Nous avons également analysé les effets du PAM sur des cellules saines (notamment du point de vue des dommages à l’ADN). Idéalement, il aurait fallu utiliser des cellules saines du colons mais après des tests de production de sphénoïdes, il s’est avéré qu’avec les cellules saines à notre disposition il était impossible d’obtenir des sphéroïdes reproductibles. Pour cette étude nous avons donc utilisé des cellules humaines de fibroblaste GM637 qui per- mettent de produire des sphéroïdes reproductibles. Les sphéroïdes fibroblastes sont utilisés lorsqu’ils atteignent un diamètre de 150 µm et traités d’une manière en tout point similaire que pour les sphéroïdes cancéreux avec un temps d’exposition au jet de plasma hélium de 120 s. La seule différence notable, en dehors du type cellulaire, est la taille plus réduite des sphéroïdes GM637 due à une croissance plus lente des cellules saines que pour les cellules cancéreuses. Les temps de transfert utilisés pour les sphéroïdes GM637 dans le PAM ont été variés de 15 min à 4 h. Les dommages à l’ADN, par le marquage de la forme phosphorylé de l’histone H2AX, ont été analysés. La figure 6.8.1 présente l’effet génotoxique du PAM sur les sphéroïdes de cellules fibroblastes GM637. Dans toutes les conditions de tests, la forme phosphorylée de l’histone H2AX est détectée avec une faible fluorescence ce qui indique qu’il n’y a que très peu de dommage à l’ADN généré par le PAM sur les cellules fibroblastes.
Cette sélectivité relativement intéressante du PAM, déjà observée dans la littérature (voir par exemple [133]), peut être imputable à la différence significative dans le système de signalisation entre les cellules cancéreuses et saines. De plus, les cellules cancéreuses sont plus sensibles à de faibles valeurs de peroxyde d’hydrogène que chez les cellules saines, puisqu’il existe un seuil de quantité de peroxyde au-delà duquel aucune cellule ne peut survivre [204]. Par conséquent, les jets de plasma froids induisent des concentrations de peroxyde d’hydrogène importante dans le PAM induisant ainsi une mort sélective des cellules cancéreuse sans affecter les cellules saines.
6.9 Viabilité cellulaire
Après avoir analysé certains effets du plasma sur les cellules cancéreuses (dommages à l’ADN et détachement des cellules périphériques) il est nécessaire de s’intéresser aux cellules détachées. Malgré le bénéfice évident d’une diminution rapide du volume tumoral après traitement avec le PAM, les cellules détachées peuvent être source de nombreux problèmes autrement plus risqués. En effet si ces cellules sont viables ou en capacité de se réparer après le détachement du sphéroïde il est alors possible qu’elles migrent et provoquent des métastases.
L’analyse de la viabilité cellulaire se fait à travers la mesure de l’adénosine Triphosphate (ATP) qui est une molécule complexe et une source d’énergie pour les cellules. Ainsi, une diminution de l’ATP dans les cellules indique la présence de cellules mortes ou en court de
Figure 6.8.1 – Absence d’effet génotoxique du PAM sur sphéroïdes de cellules fibroblastes (GM637) 4 h après transfert. Immuno-detection des dommages à l’ADN (phopho-H2AX, vert) sur coupe cryogénique de 5 µm d’epaisseur. Les noyaux cellulaires sont marqués en bleu par l’utilisation de DAPI. Échelle : 50 µm.
mort cellulaire. La cinétique de l’ATP dans les sphéroïdes a été réalisée grâce à l’utilisation de la molécule de Luciférine de luciole (molécule luminescente) sur plusieurs heures après traitement. La luminescence est alors normalisée par rapport à la valeur obtenue à partir des sphéroïdes contrôles sans traitement, ces résultats sont présentés sur la figure 6.9.1.
Figure 6.9.1 – Effet du PAM sur la viabilité cellulaire détecté après transfert des sphéroïdes dans du PAM (Ttrans = 15 min, Texp = 120 s). La viabilité cellulaire est évaluée par luminescence de l’ATP. En haut de la figure sont insérées des photographies en lumière transmises des sphéroïdes après leurs transfert dans le PAM.
On observe sur cette figure que la quantité d’ATP présente dans les cellules diminue après seulement une heure de traitement puis reste constante pendant les 24 premières heures de mesures malgré le détachement des cellules en périphérie du sphéroïde intervenant entre 4 h et 6 h après le début du traitement. La quantité d’ATP détectée dans les cellules après le traitement est de 64.19± 2.55 % ce qui correspond au volume du sphéroïde après détachement de 68.43± 3.97 %, P-value 0.2 (voir figure 6.3.1) et au pourcentage de cellules dans le sphéroïde sans dommage à l’ADN de 67.90 ± 1.41 %, P-value 0.1 (voir figure 6.4.1).
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cette déplétion en ATP :
— La génération de ROS et plus particulièrement de radicaux peut conduire à une in- teraction avec les molécules présentes dans le milieu intracellulaire dont l’ATP. Ainsi la présence de dommage à l’ADN et le manque d’ATP rend la cellule incapables de se réparer ce qui la fait rentrer dans un processus de mort cellulaire ;
— Le traitement par plasma peut induire une perméabilisation membranaire des cellules de façon plus ou moins temporaire. Suite à cette perméabilisation l’ATP peut être externalisée ce qui peut conduire à la mort cellulaire ;
— La perte d’ATP peut également être imputable à une consommation interne de la cellule dans la mise en place de défense suite au traitement par PAM. Certains proces- sus de mort cellulaire nécessitent également la mise en place de processus particulier consommant de l’énergie.
Pour déterminer plus précisément la cause de cette chute d’ATP, deux manipulations ont été mises en place. La première consiste à observer l’interaction entre l’ATP et le PAM tandis que la seconde consiste à observer séparément la quantité d’ATP présente dans le sphéroïde et dans le surnageant pour identifier la présence potentielle de perméabilisation cellulaires. Pour explorer les possibles interactions entre l’ATP et le PAM, 10 nM d’ATP ont été ajoutés aux milieux de culture puis activés par jet de plasma. La figure 6.9.2 donne la concentration de l’ATP en fonction du temps d’activation du milieu par jet de plasma. Quelque soit le temps d’activation, la concentration d’ATP contenue dans le milieu de culture reste constante à environs 10 nM. Cette expérience indique qu’il n’y a pas d’interaction entre l’ATP et les espèces générées par le plasma dans le liquide activé. La perte d’ATP après traitement dans les cellules n’est donc pas due à une interaction directe entre le PAM et la molécule ATP.
Figure 6.9.2 – Interaction entre les molécules générées par le PAM et l’ATP. La concen- tration initiale d’ATP lors de chaque exposition est de 10 nM.
La seconde hypothèse étant une fuite de l’ATP dans le milieu extracellulaire par perméa- bilisation transitoire ou permanente. L’expérience présentée consiste en la mesure de l’ATP dans un sphéroïde suite à un traitement PAM. La mesure d’ATP est également effectuée en ayant préalablement extrait du milieu soit le sphéroïde soit le supernageant ( milieu activé et cellules détachées). Le protocole de cette manipulation est fourni dans l’annexe B. La figure 6.9.3 montre les évolution de la concentration de l’ATP durant 4h dans les différents cas de figure.
Les mesures d’ATP en présence du sphéroïde avec ou sans supernageant donnent des valeurs très proches, à l’inverse la mesure de l’ATP dans le supernageant seul est proche de 0%. On peut déduire de cette expérience que la baisse d’ATP dans les cellules n’est pas induite par une perméabilisation membranaire.
Les deux expériences précédentes permettent d’éliminer les deux première hypothèses et de confirmer que la déplétion en ATP observée après traitement par PAM est le résultat d’un processus de protection vis à vis du stress oxydatif induit par le traitement. De plus, en tenant compte de la bonne concordance entre le volume du sphéroïde mesuré après traitement et la mesure d’ATP, on peut en déduire que les cellules en périphérie ne sont plus viables dès la première heure après le transfert dans le PAM. Ces cellules subissent un stress oxydatif important puis elles essayent de mettre en place une stratégie anti-stress qui n’est pas suffisant aux vues des nombreux dommages à l’ADN détectés. Les cellules rentrent donc dans un processus de mort cellulaire rapidement après le début du traitement qui se traduit 6 h après le traitement par un détachement des cellules mortes.
Ces observations permettent donc d’écarter la possibilité d’une dissémination des cellules cancéreuses après le traitement par PAM dans le corps empêchant ainsi le développement de métastases.
Figure 6.9.3 – Concentration en ATP présente dans le sphéroïde avec et sans le superna- geant.