4 Effet de l’inhibition de la polymérisation de l’actine, de l’activité des myosines II, des

Cytosquelette d’actine

Il était attendu que le cytosquelette d’actine soit nécessaire pour une orientation correcte des fuseaux comme dans tous les autres systèmes. Cependant l’inhibition d

érisation de l’actine avec la cytochalasine D (1µg/mL) et la latrunculine A (0,1µM) donnent des résultats différents.

Figure 3.32

Les cellules traitées à la cytochalasine D s’orientent mieux que celles traitées à la latrunculin A. Les premières conservent des formes de marques corticales alors que dans le deuxième cas tout le cytosquelette d’actine est complètement dissout.

Sur les films ont peut voir que les cellules s’arrondissent sous l’effet de la drogue mais qu’elles s’arrondissent encore plus en entrant en mitose. La plaque parvient à s’assembler normalement mais elle est souvent instable et tourne (voir le film « Rocking Metaphase

cytochalasin D » et la légende en annexe 2). Les cellules n’entrant pas en anaphase B, l’orientation de la plaque a été directement mesurée manuellement sur les images en contraste de phase ((voir les films « Division without cortical actin integrity »). La cytochalasine induit la formation d’aggrégats d’actine et de vinculine en étoile. Ces petits paquets ne se distribuent pas aléatoirement dans la cellule et sont, le plus souvent, localisés près des anciennes adhésions et protrusions. Et curieusement, la distribution des orientations des fuseaux n’est pas aléatoire, elle est même assez bien orientée. Ceci suggère que ces petits paquets ont ncore la possibilité d’influencer la position du fuseau. Par contre, si l’actine est e

Cont

L’inhibition de la contractilité acto-myosique par la blebbistatine (100µM, (Straight et al., 2003)) ou Y27632 (10µM) n’a pas empêché la formation du fuseau, ni la bonne orientation du plan de division (Figure 3.33). Il a été montré que l’inhibition de la contractilité par Y27632 défaisait l’uropode des lymphocytes mais pas le cap de CD44 due à la phosphorylation Thr567 de l’ezrin (Lee et al., 2004). Donc ce traitement a vraisemblablement maintenu les marques corticales. Curieusement, l’anneau d’actine a pu se contracter mais la cytocinèse a été inhibée et les cellules ont refusionné.

ité acto-myosique.

Par contre, les cellules s’arrondissent beaucoup plus lentement et parfois se divisent avant d’avoir fini de s’arrondir (voir les films « Divisions without Myosin II »). Le fuseau est donc entièrement formé dans une cellule encore étalée. C’est alors qu’il se passe quelque-chose de frappant qui révèle certainement un mécanisme important. Le fuseau bouge dans la cellule, il se déplace d’une extrémité de la cellule vers l’autre puis repart dans l’autre sens.

ractilité acto-myosique

Une étude a conclu que la contractilité acto-myosique était nécessaire à la formation du fuseau et à son positionnement dans la cellule (Rosenblatt et al., 2004). Les myosines induiraient un mouvement du cortex qui entraînerait les pôles du fuseau et permettrait leur séparation. En effet, l’inhibition de l’activité des Myosines Light Chain Kinases, par micro-injection d’un fragment de la kinase, induit un délai entre la rupture de l’enveloppe et l’anaphase (Fishkind, 1991). Cette hypothèse intéressante qui aurait pu expliquer l’orientation du fuseau sur les patrons adhésifs n’a pas pu être confirmée dans notre système expérimental.

Figure 3.33

Les fuseaux se forment correctement et plan de division se positionne correctement en l’absence de contractil

l’image blebbistatine, peut parfois aller très près de ces sommets. Comment se fait il que dans ne situation pareille le plan de division soit correctement positionné au milieu de la cellule et vec la bonne orientation ? Si, comme c’est le cas dans la levure Saccharomyces pombe, le

stimulation. Quoiqu’il en soit, il semble que la ontractilité acto-myosique soit impliquée dans le maintien du fuseau au centre de la cellule mitotique.

forme acti entés

erticalem lle (Vasiliev, 2004). Une étude complète de

-myosique sur l’orientation du fuseau devra donc étudier l’effet yosines.

L’inhibition des tyrosines kinases de la famille Src a un effet spectaculaire sur l’orientation du plan de division. Elle a également un effet sur la position des cellules mitotiques (Figure 3.34). Les cellules s’arrondissent très brusquement comme si l’ancrage du cytosquelette dans les adhésions lâchait soudainement au lieu d’être lentement remodelé. Au lieu d’être dans le coin du L les cellules mitotiques sont dispersées sur toute la zone adhésive. Souvent, la plaque métaphasique n’est que peu désorientée

elle se met à tourner doucement pendant que la cellule se

film « Divisions without Src tyrosines kinases»). L’orientation du plan de division au cours de l’allongement en anaphase est quasi-aléatoire. La télophas

n’aurait jamais pu être observée dans des conditions contrô

Fig. 3.34

Lorsque Src est inhibé les cellules mitotiques se positionnent et se divisent aléatoirement sur le patron adhésif.

En haut à gauche, l’actine est en vert, les adhésions sont en

u a

fuseau détermine le plan de division à un instant très précis juste avant l’anaphase (voir la fin de l’introduction) alors il faut que le fuseau soit au milieu à ce moment. Peut-être que le fuseau finit par se stabiliser quelques instants à cet endroit et que cela déclenche l’anaphase. Peut être que le fuseau tente au cours de ces mouvements d’établir un plan de division et que seul le milieu de la cellule répond à la

c

Il a été montré également que les fuseaux de cellules épithéliales surexprimant une ve de RhoA dans un pseudo-épithelium en culture étaient souvent ori v ent au lieu d’être dans le plan de la lame

l’effet de la contractilité acto

e l’inhibition et également celui de la suractivation des m d

Src tyrosine kinases

juste après l’arrondissement mais mble bloquée en métaphase. (voir e montrée sur cette la figure 3.34 le.

rouge et la fibronectine est en bleu.

En haut à droite, l’actine est en vert, l’ADN est en bleu et la fibronectine est en rouge. En bas, les graphes montrent les positions des cellules mitotiques (gauche) et l’orientation des divisions. PP3 est la forme inactive de PP2 qui inhibe les tyrosines kinases de la famille Src.

Src joue un rôle majeur dans la signalisation par les intégrines (Playford and Schaller, 004). Src a de nombreuses protéines cibles (dont intégrine, paxiline, tensine, vinculine,

). Il est impliqué dans la régulation de l’adhésion, la igration, le cycle cellulaire, la différentiation et l’apoptose (Tatosyan and Mizenina, 2000). L’inhib

al., 2000). DIP (mDia interacting partner) régule Rho et Rac en fonction de Src (Meng et al., 2004).

e Src nous empêche de conclure sur les causes exactes du désengagement du fuseau avec le cortex : non seulement les adhésions ne sont certainement plus capables d’entretenir les voies de signalisation habituelles aux niveaux des adhésions mais en plus le cytosquelette ne peut se réorganiser correctement au cours de l’arrondissement mitotique. Une étude plus approfondie du rôle de Src entre les adhésions et l’orientation du fuseau est donc nécessaire.

La génisteine est un inhibiteur plus général qui bloque toutes les tyrosines kinases et entre autre les protéines de signalisation associée aux intégrines (Rho, Rac, Ras, ERK, JNK,

…). L’effet de la génisteine est si fort que les cellules e

certaines finissent par se diviser l’orientation est effectivem 2

cortactine, β-cathenine, FAK, PI3K m

ition des Src kinases perturbe donc un grand nombre de signaux générés au niveau du cortex cellulaire au cours des modifications du cytosquelette. Src est effectivement une des voies de signalisation principales de la mécanotransduction (Geiger and Bershadsky, 2001; Bershadsky et al., 2003). Son inhibition rend la cellule incapable d’interpréter les contraintes mécaniques qu’elle subit et d’organiser le cytosquelette en conséquence (Mack et al., 2004). Src influence également l’activité des formines comme mDia 1 et 2 qui couplent l’actine et les microtubules. Les inhibitions de Src, de mDia1 et de Rho inhibent la cytocinèse (Tominaga et Toutes ces interactions entre l’actine, les voies Rho/Rac, et les microtubules sont donc perturbées par l’inhibition de Src.

Cependant, peu d’études avaient rapporté l’effet de l’inhibition de Src sur l’orientation des divisions (Bei et al., 2002; Tsou et al., 2003a). Dans l’embryon de Caenorhabditis

elegans, les cellules observées (division EMS/P2) n’étaient plus sensibles au contact qu’elles

avaient avec leurs voisines.

Dans nos expériences, la variété des substrats d

ne sortent pas de mitose. Lorsqu ent aléatoire.