CHAPITRE 2 - ORGANISATION INTERNE DES CELLULES ET POLARITE EN
II- 3 Critiques et discussion sur l’étude des fibres de stress
Nous ferons d’abord quelques critiques au sujet du contenu de l’article en lui-même, puis nous proposerons quelques réflexions personnelles et suggestions d’études à effectuer.
Certaines observations n’ont pas été commentées dans le manuscrit. Les réseaux
actine-adhésions sont différents dans les HeLas et dans les RPE1. Comment se
l’explique-t-on ? Ce sera l’occasil’explique-t-on de ml’explique-t-ontrer que ce réseau est encore différent dans les L929 et dl’explique-t-onc que ces architectures sont dépendantes de réglages intracellulaires fins propres à chaque type cellulaire et que donc les micro-patrons permettent de phénotyper le r éseau d’actine des cellules. De plus seule la partie contractile du réseau d’actine est étudiée ici alors que dans l’introduction nous avons expliqué que le système actine était un ensemble qui comprenait la contraction et les protrusions. Par ailleurs, certaines hypothèses sont formulées sur le lien
entre l’actine et la membrane plasmique qui, pour l’instant, demandent encore à être
justifiées, ce qui pourrait faire l’objet de mesures supplémentaires intéressantes. Et enfin, aucun mécanisme moléculaire n’est proposé alors que ce système expérimental semble particulièrement bien adapté pour ça.
L’état de contraction observé est assez inhabituel. Dans des cellules en culture le mouvement des cellules empêche d’observer un état stationnaire de l’architecture intracellulaire. Nous nous demanderons alors comment s’établit et se maintien un tel état
de contraction. L’article montre que les cellules observées, qui s’étalent toutes sur des
superficies égales, ont toutes la même quantité d’actine et de vinculine associée à des fibres de stress et donc qu’elles développent toutes la même contraction. Quel est le facteur limitant ?
La seule situation connue où l’on retrouve un état stationnaire est l’observation des
tissus. Il est frappant de constater que les mécanismes mis en œuvre y sont très similaires à
ceux observés sur les micro-patrons. Lorsqu’on pense aux tissus et aux contraintes mécaniques, il vient immédiatement à l’esprit l’idée de regarder des cellules musculaires et de profiter de ce système expérimental pour étudier le comportement des myofibrilles.
Enfin, il semble clair qu’un système aussi reproductible devrait pouvoir servir à faire des tests. En ayant à disposition une architecture cellulaire prédictible il devient possible de d’analyser les effets de certaines substances chimiques ainsi que l’inactivation d’un grand nombre de gènes dans des systèmes de criblage à haut débit. C’est dans cette optique que nous avons déposé le brevet publié en Annexe 2.
Structure du réseau d’actine
Il existe une différence intéressante entre le réseau dhésion-actine des HeLa et celui des RPE1. Dans les HeLa, les adhés
patrons adhésifs. Dans les RPE1, il semble que les adhésions et les petits câbles internes sont les m
es adhésions vers les extrémités de la cellule. On peut également imaginer que les adhésions sont à la périphérie car elles guident la progression de l’étale
. Elles forment beaucoup de protrusions de façon apparemment erratique. Par consé
s de leur division que les HeLa ou les RPE1 (voir discussion article division).
bres de stress dans une cellule L929. L’actine est en vert et la vinculine (adhésions focales) en rouge. Le patron de fibronectine est en bleu. Les protrusions ne sont pas visibles car la cellule a été perméabilisée avant la fixation afin de ne conserver que l’actine et la vinculine engagée dans les fibres de stress.
a
ions sont presque toutes à la périphérie de la cellule, alors que dans les RPE1, il y en a beaucoup le long de tous les bords des
arques des différentes étapes de l’étalement des cellules. A chaque progression de leur étalement, les cellules installent de nouvelles adhésions sur lesquelles elles tendent de nouveaux câbles. Ces ancrages temporaires semblent maintenus après l’étalement puisqu’on les voit encore plusieurs heures après l’étalement des cellules. Chez les HeLa on peut se demander si la technique d’étalement est différente. On pourrait penser qu’au lieu d’établir de nouveau ancrages les précédents sont déplacés. En effet, il a été montré que ces assemblages sont mobiles et peuvent fusionner (Zimerman et al., 2004). Les deux processus ont probablement lieu. On apprendrait beaucoup sur ces mécanismes en filmant le mouvement de ces câbles en TIRF dans des cellules exprimant de l’actine-GFP. En effet un modèle théorique propose que les concentrations d’intégrines libres et la tension exercée sur les adhésions guident les adhésions vers un éloignement maximal (Novak et al., 2004). Ce mécanisme pourrait participer à la concentration d
ment et que celles qui sont soumises aux plus grosses contraintes (angles, bords non adhésifs) grossissent du fait de la tension locale.
Les L929 sont des cellules fibroblastiques de souris issues d’une lignée transformée très agressive. Leur cytosquelette d’actine n’a pas été décrit dans l’article car, contrairement aux HeLa et aux RPE1, il est beaucoup moins reproductible d’une cellule à l’autre. Elles sont très actives
quent, elles bougent beaucoup mais migrent aléatoirement. Sur les patrons adhésifs, elles produisent également de nombreuses protrusions tout autour d’elle. L’organisation de leurs fibres de stress est très différente de celle des HeLa ou des RPE1. Elle est centripète ce qui semble cohérent avec la formation de protrusions dans toutes les directions. Elles répondent beaucoup moins précisément à la géométrie du patron adhésif au cour
Figure 2.31 Fi
Réseau d’actine dans son intégralité
arallèle avec celle de
sions membranaires
Il faut toutefois bien onnement adhésif. Les
ypothèses pourraient être mises à l’épreuve : - es mesures par AFM permettraient de sonder la rigidité corticale. Il serait ainsi
Mécanisme moléculaire
Un article récent montre que la zyxine, initialement présente dans les contacts adhésifs, décore toutes les fibres de stress pendant l’augmentation de la tension (Yoshigi et
al., 2005). Elle est directement nécessaire à l’au uteurs
suggèrent que cette molécule pourrait être impl au des
contacts focaux. Ce type de marquage dans de mettre
de mieux visualiser les zones de tension et d’an au fur
et à mesure que la tension augmente en fin mages
présentées dans notre l’article, mais aussi sur beaucoup d’autres que nous n’avons pas
présentées, montre aussi une capacité à décorer cts. La
formation de ce manchon pourrait bien être, elle aussi, dépendante de la tension. L’organisation spatiale des fibres de stress est établie en p
l’activité de l’actine au cortex. Dans cet article la description des protru n’est pas faite car elle est présentée dans l’article sur les divisions. réaliser que c’est tout l’ensemble du système actine qui répond à l’envir
fibres de stress sont présentes dans les zones d’activité de RhoA, partout ailleurs, Rac est actif,et la cellule forme des protrusions. La ségrégation spatiale de ces RhoGTPases, et celle des différents assemblages de l’actine, définissent des domaines dans la cellule. Ces domaines affectent la polymérisation des microtubules et le recrutement sélectif de certaines molécules impliquées dans la polarité cellulaire. On constate donc que l’asymétrie de l’environnement adhésif de la cellule a induit une réorganisation profonde de l’équilibre mécanique de la cellule. Cette réorganisation influe directement sur la localisation des compartiments cellulaires. C’est l’objet de l’article intitulé « Adhesive control of cell polarity ».
Actine et membrane
Dans notre article, nous avons supposé que la tension membranaire dépend de l’adhésion du feuillet lipidique avec le cortex d’actine et que la tension de ligne dépendait de la tension de la fibre de stress sous-jacente. Ces h
D
possible de savoir si les tensions dans les fibres de stress sont transmises à la membrane.
- La mesure des coefficients de diffusion de petites billes, libres dans le cytoplasme ou attachées à des phospholipides dans la membrane, seraient une évaluation de la
viscosité locale.
Ces mesures permettraient de mieux caractériser la polarité mécanique de la cellule en réponse à la géométrie de l’environnement.
gmentation de la tailles des fibres. Les a iquée dans la mécano-sensation au nive s cellules sur micro-patrons devrait per alyser en détail la décoration de la fibre
d’étalement. La vinculine, sur les i la fibre dans sa partie proche des conta
Etablissement et maintien de la tension
détachent du substrat avant que la tension maximale que peut supporter la fibre ne soit atteinte. Il serait intéressant d’imposer une suractivation de Rho et de suivre l’évolution des câbles et des adhésions.
le [V] est-elle la tension maximale ? Comment imposer éométriquement une tension encore plus élevée ? Si les autres bords n’étaient pas droits mais courbe
pou
ériences de Riveline, les adhésions grossissent immédiatement lorsque la ten n
(comm
adhésions continueraient-elles de grossir ou faudrait-il pour cela que l’on continue à
ar ailleurs, la possibilité de mesurer l’augmentation de la tension à l’aide du rayon de courbure, comme c’est le cas au-dessus de la zone non-adhésive sur un [V], devrait apporter aussi beaucoup d’informations sur la dynamique de cette contraction et les cinétiques
cette augmentation locale de tension. Le profil apparemment néaire de cette augmentation demanderait d’être étudié plus en détail. Y27632 inhibe la contrac
es cellules à qui on imposerait des surfaces d’étalement plus petites et plus grosses.
Il est assez intéressant de constater que les cellules atteignent un état stationnaire qui semble demander une importante dépense énergétique. Pourquoi la cellule ne finit-elle pas par relaxer ?
Les expériences de Daniel Riveline montrent qu’il existe une boucle de rétroaction positive entre la tension externe et la tension interne (Riveline et al., 2001). En tirant sur la cellule, les adhésions grossissent et la tension interne monte (on comprend que les cellules n’aient pas développé l’effet inverse auquel cas la moindre contrainte les déformeraient jusqu’à la rupture). Il existe pourtant un seuil à cette tension.
Quels sont les paramètres qui définissent ce seuil ? Est-ce le niveau d’activité des myosines ? La résistance des fibres d’actine ? Celle des adhésions ? Que se passe-t-il lorsque le seuil est atteint ? Peut-être que si la tension est trop élevée, les adhésions se
La tension sur g
(comme l’imposerait une forme en C) la contractilité des bords adhésifs et droits pourrait être déplacée vers l’unique zone de contraction.
En approchant le câble d’actine avec une fibre souple, il devrait être possible de le sser vers l’intérieur pour voir la réaction de la cellule.
Dans les exp
sio est exercée mais que se passerait-t-il ensuite si la tension externe était maintenue e dans notre cas où l’hétérogénéité des contraintes externes est constante) ? Les augmenter la contrainte ?
P
d’assemblage qui participent à li
tilité assez rapidement. Il serait instructif de comparer la cinétique de contraction avec celle de relaxation. L’établissement de la tension et le maintien de cette tension peuvent être deux voies distinctes. La première relève de la sensation locale de la tension et de la réponse immédiate, comme un réflexe, la seconde semble être intégrée à l’échelle de la cellule entière, peut-être par d’autres voies de signalisation.
Quel est le facteur limitant qui fait que toutes les cellules mesurées semblent développer la même tension totale ? Au vu des cellules fixées sans perméabilisation il semble qu’il reste de l’actine libre dans le cytoplasme. Est-ce la quantité de myosines qui est limitante ? Celle de son activateur ? Il serait interessant de refaire toutes ces mesures sur d
Tissus
La structure mécanique établie par les cellules en réponse au patron adhésif est remarq
insi, la distribution des tensions dans le corps cellulaire vient compenser le soutien mécani
sifs en faisant des protrusions. En effe
04). Ceci procure une intégrité mécanique au
tissu. Ainsi la réponse observée dans cette étude sur une cellule devrait se propager sur les
cellules
rôle des contraintes uable. Cette façon qu’ont les cellules de contrebalancer les contraintes externes par la régulation des tensions internes est une manifestation évidente de la tenségrité du réseau d’actine. A
que qu’offre l’environnement. L’adhésion induit la polymérisation d’actine dans des protrusions membranaire, le manque d’adhésion induit la contraction de l’actine. Ce mécanisme est certainement fondamental pour l’intégrité mécanique des tissus : un vide va générer des tensions autour de lui qui participe à sa fermeture alors que les cellules vont s’étaler et s’écarter d’une accumulation locale de contacts adhé
t, à la périphérie d’un feuillet de cellules qui n’est pas attaché à un substrat ou à d’autres cellules on constate un renforcement des cables d’actine (Figure 2.29).
Figure 2.29 Les cellules renforcent la tension autour des trous.
Le mécanisme « actin purse string » permet aux cellules au bord d’un trou d’assembler un gros cable d’actine trans-cellulaire dont la contraction va permettre la fermeture du trou (à gauche). Ce mécanisme se retrouve aussi bien dans la fermeture de l’embryon de drosophile (droite A) que dans la réparation d’une blessure d’un épithélium (droite B) (Martin and Parkhurst, 2004).
Les cellules sentent la contrainte externe et s’alignent le long de cette contrainte sur de grandes distances (Sawhney and Howard, 20
voisines dans une architecture multi-cellulaire. En effet les tensions se distribuent de façon hétérogène au sein des assemblages multicellulaires qui eux aussi semblent répondre à des contraintes géométriques locales comme des angles (Nelson et al., 2005). Des développements ultérieurs de la technique de micro-patrons adhésifs vers la contrainte de plusieurs cellules devraient apporter beaucoup d’informations sur le
Cellules musculaires et myofibrilles
mesurer les actions exercées par les cellules. Les essais d’Emilie Dressaire, en stage de DEA au boratoire, n’ont pas été concluants. Sur les piliers de PDMS utilisés (Tan et al., 2003; du Roure et al., 2005) les cellules s’enfoncent entre les piliers. Les patrons sont difficiles à réaliser sur des substrat en polyacrylamide car ils sont humides et fragiles (Beningo K., 2002). L’idéal serait d’être capable d’imprimer les patrons sur un film de PDM suffisamment souple pour pouvoir être déformé par les cellules. Les expériences menées dans l’équipe de Kit Parker à Harvard sur des cellules cardiaques contraintes par micro-patrons adhésifs (Figure 2.30) devraient permettre de commencer ce type d’étude. Des patrons inhomogènes pourraient certainement apporter beaucoup d’informations supplémentaires sur l’organisation spatiale et la sensibilité mécanique de ces fibres.
ystèmes de choix pour l’étude de la mécanotransduction. Le type d’adhésion développé (composition, taille) est directement dépendant de la contrainte Une fibre de stress n’est pas un ensemble de câbles homogènes. Les myofibrilles, qui sont une forme particulière de fibre contractile, sont effectivement inhomogènes. Les monomères d’actine et les myosines s’échangent entre la fibre et le cytoplasme à un rythme plus grand au milieu de la fibre qu’à ses extrémités. L’espacement entre les bandes d’actinine et de myosine est plus court aux extrémités de la fibre accrochées au substrat (Peterson et al., 2004). La dynamique d’assemblage permanent dans ces fibres et leur inhomogénéité pourrait être une des caractéristique qui assurent la capacité de réponse du système à des changements externes. Ces fibres, comme les fibres de stress, pourraient être en permanence en train de se tendre et se détendre de façon à évaluer le module élastique environnant. L’utilisation de substrats flexibles permettrait de mieux comprendre cette dynamique et de
tr la
Figure 2.30 Organisation des myofibrilles de cellules musculaires en réponse à la géométrie imposée. La myosine est en rouge et l’actinine en vert.
K.K. Parker website.
mécanique. Cette contrainte affecte même leur mode de différenciation (Grinnell, 2003; Hinz and Gabbiani, 2003).
Crible haut débit
Ce sont souvent des traitements pharmacologiques (comme l’hyper activation de Rho) qui permettent d’induire la contraction des fibres de stress et l’étude de la contractilité cellulaire. Ici c’est un effet purement géométrique et mécanique. Cela pourrait permettre de tester l’effet de nombreux composés sur la contractilité des cellules. Notamment ceux présent dans des bibliothèques chimiques dont on attend, a priori, aucun effet mais qui pourraient être révélés dans ce type de situations. Il suffirait pour cela de déposer les cellules dans des dizaines de puits au fond desquels des patrons en [V] seraient imprimés puis de les fixer trois heures après et de marquer l’actine. Puis, une acquisition et une quantification automatisée suffiraient à deceler les drogues capables d’empêcher la contraction. C’est ainsi que la blebbistatin a été découverte. Le test utilisé était l’asence contraction de l’anneau d’actine en mitose ce que l’on peut détecter par la présence de cellules bi-nuclées. Les micropatterns offrent une lecture plus simple et plus fiable, car plus spécifique de l’exercice de la tension.