Effet0de0la0correction0

La Figure 4.9 A présente les mêmes patients que dans la Figure 4.9 B, mais après division des valeurs de volume endosomal moyen de chaque cellule par le volume cellulaire. On observe toujours des différences importantes entre les sujets ce qui signifie que les variations de volume endosomal moyen par cellule que nous observions avant correction entre les donneurs ne sont pas dépendantes du volume cellulaire. Elles pourraient représenter une variation inter donneur dépendante d’un autre paramètre biologique tel que l’âge le sexe ou la prise d’un traitement médicamenteux. Nous décidons donc de ne pas procéder à une correction des volumes endosomaux moyens par le volume cellulaire.

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Figure 4. 9 : Correction de la taille des endosomes par le volume cellulaire. Chaque boite représente la taille moyenne des endosomes dans 30 cellules d’un sujet, avant correction (A), et après correction (B). Les témoins sont représentés en rouge, et les MA-D en vert pour les stades MA-MCI, et bleu pour les stades modérés.

Figure 4. 10 : Variabilité des volumes cellulaires. Chaque boite représente la distribution du volume des 30 cellules de chaque sujet.

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La comparaison du groupe d’individus ci-dessus, avec les données acquises précédemment a mis en évidence un effet temporel peut-être lié au traitement des échantillons. En effet, les prélèvement sanguins sont traités à chaque nouvelle inclusion; il peut se dérouler plusieurs semaines entre deux prélèvements, induisant une separation dans le temps des étapes d’isolement, et de marquage des cellules, pour un échantillon donné, puis entre les groupes d’échantillons différents (Figure 4.11).

Nous constatons une différence affectant tous les échantillons qui lorsque l’ensemble des patients est aligné horizontalement. Les causes possible pour l’effet constaté sont: a) un effet lié au marquage supplémentaire par les WGA, b) autres différences dans la procédure expérimentale (i.e. lot d’anticorps

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différents, utilisation DAPI, effet de la centrifugeuse), c) une maintenance du microscope, d) une variabilité biologique liée au donneur. Pour vérifier cet effet, nous avons réalisé plusieurs tests comparatifs dans le même prélèvement, en comparant les vitesses de contrifugation, la présence d’un marquage DAPI et des expositions différentes des images pour simuler l’effet de la maintenance sur le microscope. Aucun de ces paramètres n’a permis d’observer la variabilité constatée dans la Figure 4.11.

Comme la variabilité biologique ne peut pas être exclue, dans la suite nous considérons tous les sujets comme un ensemble homogène.

Figure 4. 11 : Variablité du volume endosomal par sujet. La flèche bleue marque le début de l’utilisation du marquage WGA.

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Dans les résultats nous avons procédé à une distribution des cellules dans trois catégories, en fonction du volume endosomal moyen obtenu. Ces catégories sont définie sur l’histogramme des valeurs des témoins qui représentent les données de référence auxquelle nous comparons les malades, par conséquent les bornes d’intervalle seront différentes d’un jeu de données à un autre (figure 4.12)

Figure 4. 12 :Definition de trois catégories de volume endosomal moyen à partir des contrôles.

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En plus de la taille et du nombre d’endosomes nous avons voulu savoir si leur répartition dans la cellule pouvait être différente entre les témoins et les malades.

Chaque détection est associée à un jeu de coordonnées en X, Y et Z, il est donc possible de calculer facilement leurs distances relatives les unes par rapport aux autres et d’automatiser une analyse spatiale (l’algorithme est expliqué en annexe 2a et 2b). Les données spatiales ont été analysées de deux manières différentes :

D’abord par la méthode des plus proches voisins, en calculant les distances euclidiennes (géométriques) entre chaque endosome et tous les autres endosomes de la même cellule. Puis en triant les distances obtenues dans l’ordre croissant, pour chaque endosome et en dessinant une courbe cumulative de la distance au plus proche voisin (nombre d’occurrences par distance croissante) comparée à une distribution théorique aléatoire (Andrey et al., 2010, Figure 4.13). Dans notre cas la méthode a été détournée en remplaçant la distribution théorique par la distribution du groupe des témoins.

Figure 4. 13 : Distance auplus proche voisin. La méthode classigque de description de la distance au plus proche voisin compare la distribution des points du motif (bleu) à une distribution aléatoire (completely random binomial point pattern (CRBPP)) générée par une simulation de Monte-Carlo. Modifié de Andrey et al., 2010.

Une autre méthode de description du motif de distribution spatiale des endosomes s’inspire de la fonction de Ripley (1977), qui réalise pour chaque point du motif, une recherche du nombre de voisins qui se trouvent dans une aire de recherche définie par l’utilisateur, et découpée en disques concentriques d’aire croissante autour du point central (Ripley 1977, Figure 4.14). La fonction renvoie la moyenne du nombre de points par classe de distance croissante autour des objets (Figure 4.15).

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Lagache et collaborateurs, ont récemment proposé une méthode de correction de la fonction, et de définition d’un intervalle de confiance (Lagache et al., 2013). Malheureusement, cette fonction qui est implémentée dans ICY, n’est pas applicable pour plusieurs cellules et ne permet pas d’extraire de données chiffrées.

Afin de pouvoir automatiser l’analyse spatiale de la distribution des endosomes dans la cellule, j’ai programmé un traitement qui s’inspire de la fonction de Ripley.

Cette version simplifiée ne réalise pas de correction par la surface cellulaire et les effets de bord de l’image, dans la mesure où les distances de recherche des voisins sont faibles, et que les images sont comparées entre elles, non à une distribution théorique aléatoire.

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Figure 4. 14 : Image représentative d'un fibroblaste de malade Alzheimer marqué sur les endosomes précoces.

Les cercles concentriques illustrent une zone de recherche des endosomes voisins dans un rayon d’environ 15#m.

Le comptage du nombre de voisins par disque est répété pour chaque endosome de la cellule. La valeur de la densité moyenne de voisins par classe de distance (DMV) d’une cellule est la moyenne des nombres d’endosomes par cercle concentrique divise par la surface.

Figure 4. 15 : Densité de voisins par classe de distance. La fonction de Ripley permet de décrire les tendances à l'agrégation ou à la répulsion des points composant un motif de distribution spatiale. Adapté de Lagache et al, 2013.

0

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2 Population0

Le Tableau 4.2 présente le résumé de la population incluse.

Trois groupes sont comparés : 24 témoins et 48 patients Alzheimer dont 25 au stade léger (CDR=0.5) et 23 avec une démence modérée (CDR>0.5).

Tous les patients MA répondaient aux critères suivants : a) syndrome amnésique initial et prédominant le tableau clinique, avec des scores au RLRI définis par RL < 19 ou RT < 40 ; b) des marqueurs physiopathologiques de MA positifs définis par des biomarqueurs du LCR de type Alzheimer (ratio IATI

< 0,8, Koric 2011) et une imagerie amyloïde positive définie par un index global cortical de fixation du ligand > 1,4.

Les patients ont été définis en deux sous groupes en fonction de la gravité globale de la maladie par l’échelle de CDR en stade de MCI (CDR = 0,5) et stade de démence légère à modéré (CDR= 1 ou 2). Ces groupes seront désignés par le terme MA-MCI et MA-D.

Les témoins ont été inclus sur les bases d’un bilan neuropsychologique normal, l’absence d’ATCD médicaux pouvant interférer avec les résultats, l’absence de lésion significative sur l’IRM cérébrale ET une imagerie amyloide négative (index de fixation cortical < 1,4).

Les trois groupes sont équilibrés en âge et sexe. Comme attendu, le MMSE est significativement diffèrent entre les trois groupes.

La fréquence des allèles epsilon4 de l’ApoE n’est pas significativement différente entre les patients MA-MCI et MA-D.

Les données individuelles des témoins, des MA-MCI et des MA-D sont disponibles en annexes 1a, 1b et 1c, respectivement.

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00

Tableau 4. 2 Description détaillée de la population incluse dans l’analyse des endosomes dans les PBM

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Les données ont été analysées avec deux niveaux d’analyse différents, d’abord par cellule, en comparant entre les groupes le nombre et la taille moyenne des endosomes par cellule, puis par sujet en confrontant les données des endosomes aux données clinico-biologiques disponibles, puis par une analyse spatiale des endosomes dans la cellule.

Le Tableau 4.2 présente le résumé de la population incluse. Trois groupes sont comparés : 24 témoins et 48 patients Alzheimer dont 25 au stade léger (CDR=0.5) et 23 avec une démence modérée (CDR>0.5). Les trois groupes sont équilibrés en age et sexe. Le MMSE est significativement different entre les trois groupes. Enfin la frequence des alleles epsilon4 de l’ApoE n’est pas significativement differente entre les patients MCI et MA. La Figure 4.16 montre des exemples de cellules marquées sur les endosomes précoces dans les trois groupes.

Figure 4. 16: Planche d'images représentatives de PBMC marquées sur les endosomes précoces avec des anticorps anti-EEA1, et un marquage secondaire couplé à un fluorophore vert (Goat-anti-rabbit-Alexa488®). Chaque panneau présente de haut en bas trois cellules représentatives des contrôles (A), des individus MCI (B), et desindividus MA (C). Pour chaque cellule est présenté horizontalement une série de trois coupe optiques espacées de 2#m à travers le volume de la cellule. Les barres d’échelle représentent une longueur de 1#m.

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117 B"!"! <3*-@A%0:%A0%3:(A(5%A0)*'0D%--&-%0

Les données cellulaires qui ont été étudiées sur la cohorte entière sont le nombre et le volume moyen par cellule. Le nombre d’endosomes par cellule et la taille moyenne des endosomes par cellule ont été comparés par une ANOVA hiérarchique à deux niveaux (sujet, groupe) et aucune différence significative n’a été mise en évidence (Figure 4.17). Le tableau 4.3 résume la moyenne± l’ecart type du nombre d’endosomes par cellule des sujets.

Figure 4. 17: Nombre et taille moyenne des endosomes par cellule. Ni le nombre (A), ni le volume moyen par cellule (B) ne sont significativement différents entre les Témoins et les patients.

Nb cellules

Témoins n=454

MCI-MA n=460

MA n=427 Nb endosomes / cellule 21.99 ±14.87 20.24 ±12.28 21.97 ±14.1 Vol. endosomes / cellule 216.19 ±105.6 214.62 ±106.4 234.03 119.5

Tableau 4. 3 : Nombre moyen d’endosomes par cellule et volume moyen des endosomes par cellule.

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