Ecologie des Bactériocines

Il paraît que la capacité d'en synthétiser une ou plusieurs bactériocines a été une caractéristique très avantageuse. Une opportunité claire pour la survie et la prolifération d'un organisme peut être envisagée s'il peut éliminer un micro-organisme en compétition là où la compétition peut être tout à fait intense créant ainsi une diversité des espèces et la croissance rapide des bactéries (Dykes 1995). Les antibiotiques de faible poids moléculaire (par exemple, la tétracycline), agents lytiques, toxines, enzymes lytiques, les bactériophages, et les métabolites secondaires, tel que les acides organiques, l'eau oxygénée, et le diacétyle, agissent également d’une manière similaire.

Mais néanmoins la capacité de produire des bactériocines et la protéine d’immunité par la cellule productrice se produit abondamment chez les procaryotes, eubactéries et les archaebactérie. Les bactériocines jouent un rôle fondamental dans la dynamique de la population bactérienne bien que le degré d'interactions de la bactériocine soit si complexe au niveau écologique et évolutif dans les cultures mixtes.

Comme noté par Riley (1998), le suivit des bactériocines dans les milieux naturels, chez Lactobacillus plantarum dans la fermentation des olives vert, chez Escherichia coli dans la conjonctive du cobaye, et Streptococcus mutans dans la cavité orale humaine, a indiqué que l'avantage de la compétition est augmenté substantiellement pour les bactéries productrices de bactériocines envers les bactéries sensibles dans le même environnement.

Dans l’exemple du L. plantarum, une souche productrice de bactériocine a été utilisée pour fermenter les olives vertes d’Espagne (Leal-Sánchez et al., 2003 ; Ruiz-Barba et al., 1994). La souche productrice de bactériocines se maintient à un niveau très élevé dépassant 12 semaines de fermentation. En revanche,

quand une souche, non productrice, de la même espèce est utilisée en fermentation, celle-ci n’est pas détectée après 7 semaines.

Sur ceci, les modèles mathématiques ont été conçus pour évaluer les interactions entre souches productrices de bactériocine et variantes sensibles.

La plupart des modèles écologiques de bactériocines ont été fait avec la colicine (bactériocine produite par Escherichia coli et montrant habituellement une activité envers d’autres souches d'E. coli et des membres apparentés des Enterobacteriaceae).

L’induction s’opère habituellement sous conditions stressantes telles qu'épuisement nutritionnelle ou un surplus (Riley et Wertz 2002; Riley et Gordon 1999). La colicine diffèrent des bactériocines des bactéries gram-positif dans le sens qu'ils ont trois mécanismes d'action généraux: formation de canal dans la membrane cytoplasmique, (le mécanisme commun est rencontré avec les bactériocines des bactéries à gram-positif ), dégradation de l'ADN cellulaire, et inhibition de la synthèse protéique. Il est estimé qu'approximativement 30%

des populations naturelles d'E. coli produisent des bactériocines (Riley 1998).

Plus de 25 types de colicine ont été identifiés (Pugsley 1984). Il est aussi estimé qu’approximativement 70% de la population d'E. coli sont résistantes à un sel type de colicine, et 30% sont résistantes à tout types de colicine produite dans une population avec le du colicine-sensitive des cellules restantes (Smarda 1992). Le nombre relatif aux souches productrices de colicine dépendait de l'énergie associée avec la synthèse de la colicine (Riley et Gordon 1999).

1.5. Détermination de l’activité de la bactériocine

L’étude des interactions bactériennes est très commune. Les bactériocines représentent une catégorie de substances produites par les bactéries qui inhibent d’autres. Dès 1676, Antonie van Leeuwenhoek a défini l’antibiose comme étant le produit excrété par un micro-organisme capable d’inhiber un autre (Joerger et al., 2000). En 1877, Louis Pasteur et Joubert ont rapporté l'effet inhibiteur de bactéries de l'urine sur Bacillus anthracis. Comme mentionné plutôt, en plus des bactériocines, les substances inhibitrices produites par les bactéries incluent les antibiotiques cliniques ou thérapeutiques de faible poids moléculaire, les agents lytiques, toxines,

enzymes bactériolytiques, bactériophages, et autres métaboliques secondaires, tel que l’eau oxygénée et le diacétyle. Ainsi, dans une niche écologique, un seul type de bactérie peut être plus compétitif qu'un autre vis-à-vis de la source nutritionnelle ou la sensibilité à un facteur environnemental, tel que la disponibilité de l’oxygène. Avec une telle variabilité de produits inhibiteurs ou conditions environnementales, l’antagonisme n’est pas dû dans sa totalité par les bactériocines. L’étude des bactériocines des bactéries lactiques doit prendre en compte la grande quantité d’acides organiques produite au cours du métabolisme bactérien et devrait écarter l’inhibition due à ces acides.

Un moyen commun pour rechercher l'activité des bactériocines est l'utilisation des milieu gélosé en boite de Petri. Mayr-Harting et al. (1972), Piddock (1990), Parente et Riccardi (1999) et Akçelik (2006) ont passés en revue les méthodes de détection et d’évaluation de l’activité des bactériocines. Il y a beaucoup de variations dans ces méthodes, la plupart d'elles dérivent de la méthode dite de la double couche, un test direct, dont la souche productrice et sensible sont co-cultivées et incubées puis des zones d’inhibition autour de la colonie de la souche productrice sont recherchées. L’exemple conçu est la culture de la souche productrice par touche ou strie, sur milieu gélosé sur laquelle une surcouche de gélose moelle contenant la souche indicatrice ou sensible (Sabine, 1963). Les différentes méthodes permettent de respecter le temps et les conditions de culture relatives à la souche productrice et sensible, ces dernières sont plus sensibles que les méthodes directes (Tagg et al., 1976).

Kekessy et Piguet (1970) décrivaient une procédure ou la souche productrice et indicatrice étaient cultivées chacune sur leur milieu optimal respectif. La souche productrice était cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu est complètement délogé à l’aide d’une spatule et déposé dans une autre boite en sens inverse (culture au dessous). Une surcouche de gélose moelle ensemencée par la souche indicatrice est coulée sur le premier milieu. Après incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice. Cet essai minimise les effets d'acides et l’action des bactériophages, du fait que les deux souches sont séparées physiquement par une couche d’agar. La composition du milieu de culture est un facteur important dans les essais en boite de pétri, mais la question va au-delà des exigences nutritionnelles de la souche productrice et la

souche cible. L’utilisation de l’agar dans les milieux solides peut perturber la diffusion de la bactériocine, donc limiter l’efficacité de la méthode utilisée (Lindgren et Clevstrom 1978). Les autres composés peuvent entraver les résultats. Par exemple, Hoover et al., (1989) ont trouvés que β-glycérol phosphate (utilisé comme tampon) dans le milieu M17 avec la méthode Kekessy-Piguet interfère avec les zones d'inhibition causées par Pediococcus acidilactici (PO2) comparé à d’autre milieu de culture et substance tampon.

Cependant, Spelhaug et Harlander (1989), n’ont rencontré aucune difficulté à faire exprimer l'antagonisme de la bactériocine produite par Pediococcus pentosaceus FBB61 et FBB63-DG2 sur milieu solide M17-glucose. Peut-être, ceci est dû à une bactériocine différente produite par ces souches ou la méthodologie utilisée était légèrement différente.

Rose et al., (1999) ont adapté la spectrométrie de masse pour une détection rapide de la pediocin, la nisine, la brochocins A et B, et l’enterocins A et B à partir de surnageants de culture. La méthode est dite matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF MS) qui a été conçue originairement pour l'examen de grandes molécules, tel que les biopolymers. Dans ce protocole, un lavage du surnageant pendant 30 seconde est opéré afin d’éliminer les impuretés puis la procédure est suivit jusqu’à purification complète de la bactériocine.

La PCR est utilisée pour détecter les gènes responsables de la production et la régulation de la bactériocine dans les cultures bactériennes. Rodriguez et al, (1995) ont pu amplifier le gène structural de la lactocine S chez 7 souches de lactobacilles isolés du saucisson fermenté. Dans un autre travail, Garde et al., (2001) ont détecté le gène de production du lacticine 481 et la nisine en utilisant la PCR avec une spécificité dans l’isolement de Lactococcus lactis subsp. lactis à partir du fromage de lait cru. Rodriguez et al., (1998) ont détecté l’enterocine AS-48 à partir des entérocoques isolés du lait et les produits laitiers en utilisent la méthode d'hybridation des colonies. Martinez-Bueno et al., (1994) ont réalisé le séquençage des gènes codant la synthèse de l’enterocine AS-48. Une technique PCR a été développée pour détecter rapidement ces gènes (Joosten et al., 1997).

Mugochi et al., (2001) ont développé une méthode rapide et sensible pour détecter les bactériocines à partir du milieu de fermentation. Les faibles

concentrations d'ions de potassium ont été mesurées, ainsi la quantité libérée par la souche bactérienne sensible corrélée avec la quantité de bactériocine présente dans la portion de bouillon nutritif entrant dans celle-ci. Cette méthode se compare facilement à celle de la méthode de diffusion en milieu solide.

1.6. Classification des Bactériocines

Découvert en premier par Gratia en 1925, “principe V” a été produit par une souche d'E. coli envers une autre souche de la même espèce. Le terme

“colicine” a été utilisé par Gratia et Fredericq (1946); “bactériocine” a été utilisé par Jacob et al. (1953) comme un terme général pour les protéines antibactériennes très spécifiques. Maintenant le terme colicine désigne une protéine à caractère bactéricide produite par une souche d'E. coli et d’autres membres apparentés aux Enterobacteriaceae (Konisky 1982). Bactériocines (comme les colicines) ont été défini originairement comme protéines bactéricides caractérisées par leur action létale, un large spectre d'activité, et une adsorption spécifique sur des récepteurs de la membrane cellulaire (Jacob et al., 1953).

Plus tard, la biosynthèse des bactériocines par les plasmides a été ajoutée à leur description. La définition a depuis été modifié pour incorporer les propriétés des bactériocines produites par les bactéries à gram-positif (Tagg et al., 1976).

Chez les bactériocines, différentes règles de nomenclature ont déjà été proposées (Hamon et Peron, 1963). Par contre, aucune n'a réellement été adoptée de façon unanime. Bien que l'addition du suffixe «ine» soit généralement employée, il demeure qu'il y a beaucoup de variabilité dans la nomenclature. En fait, la nomenclature d'une bactériocine est parfois basée sur le genre bactérien (Takeya et Tokiwa, 1974) ou parfois sur l'espèce (Hamada et Ooshima. 1975). Il est même arrivé que pour une même espèce, la bactériocine soit nommée selon les deux méthodes désignées. C'est notamment le cas de Corynebacterium diphtheriae où les bactériocines sont nommées corycine ou diphthericine selon l'équipe qui a isolé la bactériocine (Krylova, 1969; Gibson et Colman, 1973). Malgré tout, et pour des raisons de

simplification, il arrive fréquemment que la désignation donnée aux nouvelles bactériocines inclut le nom de souche de la bactérie productrice (Ross et al., 1999).

Les bactériocines des bactéries à gram-positif ne possèdent pas de récepteurs spécifiques pour l'adsorption mais des exceptions existent (Gravesen et al., 2002b), ces dernières sont pour la plupart de faible poids moléculaire que les colicines, ont une large gamme de bactéries cibles, avec différents modes d'excrétion dans le milieu externe et de transport membranaire (Jack et al., 1995; James et al., 1991; Riley 1998). Aujourd'hui, les peptides ou les protéines à caractère bactéricide, produites par les bactéries font typiquement référence aux bactériocines. Habituellement, la nature protéinique d'une bactériocine récemment caractérisé est démontrée par sa sensibilité aux enzymes protéolytiques telles que la trypsine, l’α-chymotrypsine, et la pepsine.

Son évaluation pour être utilisé comme additif alimentaire exige l’estimation de sa résistance à la température, un facteur très utilisé dans l’industrie alimentaire. Durant des années, plusieurs publications ont passé en revue les colicines, bactériocines des bactéries lactiques et l’application de bactériocines spécifiques. Les exemples incluent Reeves (1972), Franklin et Snow (1975), Hardy (1975), Tagg et al., (1976), Konisky (1982), Klaenhammer (1988, 1993), Jack et al., (1995), de Vos et al., (1995), Sahl et al., (1995), Venema et al., (1995c), Abee et al.,(1995), Nes et al., (1996), et Cleveland et al., (2001).

La plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont cationiques, hydrophobes, ou des molécules amphiphiliques composées de 20 à 60 résidus d'acide aminé (Nes et Holo 2000).

Afin de faciliter leur identification, différentes méthodes de classification ont été proposées. En 1976, une méthode de classification des bactériocines isolées des bactéries à Gram positif fut proposée (Tagg et al., 1976). Compte tenu du nombre important de bactériocines et de leurs multiples origines, une première classification des bactériocines produites par les bactéries lactiques f'ut proposée (Klaenhammer, 1988) et remise à jour par le même auteur (Klaenhammer, 1993). Essentiellement, cette méthode classe les bactériocines selon leur résistance à la chaleur, leur taille, certaines propriétés physico-chimiques, leur spectre d'activité et la présence ou non d'acides aminés

modifiés. Pour ce faire, elle sépare les bactériocines produites par les bactéries lactiques en quatre classes distinctes.

La classe I est formée des lantibiotiques. Ces petits peptides, de poids moléculaire inférieure à 5 kDa, agissent au niveau de la membrane cytoplasmique. Elles ont toute la caractéristique commune de posséder des acides aminés modifiés. Ces derniers résultent de modifications post-traductionnelles de la sérine, la thréonine et la cystéine en lanthionines. P-méthylelanthionines ainsi qu'en résidus déshydratés. La nisine, la subtiline, la duramycine ainsi que la cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques (Delves-Broughton et al., 1996; Sariset al.,1996; Sahl et Bierbaum, 1998).

La classe II est caractérisée par des petits peptides dont la masse moléculaire est généralement inférieure à 10 kDa. Ces bactériocines sont stables à la chaleur et sont caractérisées par un site de maturation conservé Gly-Gly situé sur le peptide signal. Ces dernières ne contiennent pas d'acide amine modifié.

Par ailleurs, les bactériocines matures sont prédisposées à former des hélices amphiphiles avec des régions d'hydrophobicité variable et il est prédit que la structure secondaire de forme native possède des feuillets p. Cette classe est subdivisée en trois sous-classes:

- classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria ayant une séquence constitué en N-terminale de Tyr-Gly-Ans-Gly-Val-X-CyLsa. La pédiocine PA- 1, la sakacine P, la leucocine A-UAL187 et la curvacine A n'en sont que quelques exemples (Hastings et al., 1991 ; Holck et al., 1992; Tichaczek et al., 1992).

- classe IIb Complexe de poration qui nécessite deux peptides pour être actif. La lactococcine G et la lactacine F en sont deux exemples (Mulet-Powell et al.,1998).

- classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu cystéine pour être actif. La lactococcine B en est un exemple classique (Venema et al., 1993).

La classe III comprend toutes les bactériocines de poids moléculaire élevé (>30 kDa). Les bactériocines de cette classe ont la caractéristique d'être thermosensible, c'est-à-dire qu'elles ne résistent pas aux traitements

thermiques sévères. L'helveticine I et les lacticines A et B en sont trois exemples (Joerger et Klaenhammer, 1986; Toba et al., 1991).

La classe IV englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique pour être active. Klaenhammer (1993) a suggéré cette quatrième classe, comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou des fractions lipidiques pour leur activité. Cependant, les bactériocines de cette classe n'ont pas été suffisamment caractérisées au niveau biochimique vu que leur définition nécessite des informations supplémentaires (Jimenez-Diaz et al., 1995; McAuliffe et al., 2001). C'est le cas notamment de la pédiocine SJ-1 et de la lactocine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975; Schlyter etal., 1993).

1.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action

1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse

La synthétise des bactériocines est ribosomiale. Les gènes qui codent la production et l’immunité sont organisés habituellement en opéron (Nes et al., 1996; Sahl et Bierbaum 1998; McAuliffe et al., 2001). La synthèse des bactériocines linéaires non modifier inclue la plantaricine, la carnobacteriocine et la sakacine, paraît induite par des peptides spécifiques. Cette synthèse est localisée sur le même opéron (Quadri et al., 1997; Brurberg et al., 1997;

Anderssen et al., 1998). Les gènes de synthèse des bactériocines peuvent être localisés sur le chromosome, comme dans le cas de la subtiline (Banerjee et Hansen 1988) et la mersacidine (Altena et al., 2000) ou plasmidique, comme dans le cas de la divergicine A (Worobo et al., 1995) et la sakacine A (Axelsson et Holck 1995), ou sur un transposon comme dans le cas de la nisine (Rauch et de Vos 1992) et la lacticine 481 (Dufour et al., 2000).

Les opérons de la biosynthèse des lantibiotiques contiennent généralement des gènes qui codent pour le prépeptide LanA – lan. Cette l'abréviation faisant référence aux gènes homologues du gène des différents groupes de lantibiotiques. Des enzymes responsables des réactions de transformation de la prébacteriocine (LanB,C/LanM), des protéases responsables du clivage du peptide (LanP), le système de transport ABC (ATP-binding cassette), un système de transport protéique responsable dans la translocation du peptide (LanT), des protéines de régulation (LanR, K), qui sont des protéines impliqué dans

autoprotection chez la souche productrice (immunité) (LanI, FEG). Ces informations ont été récoltées à partir d’une multitude d’analyse génétiques sur plusieurs lantibiotiques, l’epidermine (Schnell et al., 1992, Bierbaum et al., 1996; Geissler et al., 1996), nisine (Buchmann et al., 1988; Mulders et al., 1991; de Vos et al., 1995), subtiline (Banerjee et Hansen 1988; Klein et al., 1992; Klein et al., 1993, Klein et Entian 1994), lacticine 481 (Piard et al., 1993;

Rince et al., 1997; Uguen et al., 2000), et mersacidine (Bierbaum et al., 1995;

Altena et al., 2000).

La régulation génétique des bactériocines de la classe II, les lactococcines A, B, et M (Holo et al., 1991; Van Belkum et al., 1991; Stoddard et al., 1992; Van Belkum et al., 1992; Venema et al., 1995b), pédiocine PA- 1/AcH (pédiocine PA-1 et AcH représentent la même molécule; le nom de pédiocine le PA-1 est plus couramment utilisé) (Marugg et al., 1992; Motlagh et al., 1992;

Bukhtiyarova et al., 1994; Venema et al., 1995a), et plantaricine A (Diep et al., 1994; 1995; 1996) ont été étudiées. Les gènes responsables de la biosynthèse des bactériocines de la classe II se partagent plusieurs similitudes dans l’organisation génétique. Elle en consiste dans le gène structural codant pour le peptide précurseur, par le gène codant pour la protéine d’immunisation et celles du système de transport ABC ainsi que d’autres protéines essentielles dans l'excrétion dans le milieu. Ces protéines ne sont pas présentes chez les lantibiotiques (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000). Enfin, dans certains cas, on rencontre le gène de régulation. La génétique des lantibiotique et non lantibiotique a été largement débattue par Klaenhammer,(1993), Jack et al., (1995), Nes et al., (1996), Sahl et Bierbaum (1998), Van Kraaij et al., (1999), Ennahar et al., (2000b), Sablon et al., (2000), et McAuliffe et al., (2001).

1.7.2. Les voies de biosynthèse

La biosynthèse d'une bact6riocine nécessite l'interaction de plusieurs facteurs qui sont généralement contrôlés par des protéines. L'induction de la synthèse d'ARN, la maturation, l'exportation et finalement l'immunité de la souche productrice sont toutes contrôlées par des familles de protéines distinctes. De façon générale, la biosynthèse d'une bactériocine débute par le signal provoqué par un facteur d'induction. En générale, ces facteurs d'induction provoquent un signal chez une histidine-kinase située à la surface

de la membrane. Celle-ci provoque la phosphorylation d'un régulateur de réponse qui interagit directement avec les différents promoteurs présents sur l'opéron de la bactériocine. Quelques facteurs d'induction sont bien connus.

Par exemple, la biosynthèse de la nisine est induite par la nisine elle-même alors que pour les bactériocines de classe II, c'est un peptide similaire à la bactériocine qui induira la biosynthèse (Kuipers et al., 1995; Nes et al., 1996a).

Ces peptides sont généralement inactifs. Par contre, le facteur d'induction de la plantaricine démontre une activité bactéricide (Anderssen et al., 1998).

Suite à l'induction, les bactériocines sont synthétistes par la voie ribosomique sous forme de pré-peptides. Ces derniers possèdent un peptide signal en N-terminal qui doit être clive pour que la bactériocine mature soit active. La présence du peptide signal joue un double rôle. En premier lieu, tout indique que la présence du peptide signal inactive la bactériocine (Ennahar et al., 2000b). De plus, cette séquence en N-terminal garantit que le pré-peptide sera exporté via le transporteur dédié ou sec-dépendant approprié (Nes et al., 1996).

Ainsi, le peptide signal pourra être clivé par une peptidase spécifique ou, comme c'est le cas pour la plupart des bactériocines de classe II, il sera clivé par le domaine protéolytique du transporteur lors de la sécrétion de la bactériocine par ce même transporteur (Havantein et al., 1995). Cette reconnaissance du peptide signal est due principalement à sa séquence. En effet, chez les bactériocines de classe II, il est très fréquent d'observer un doublet glycine à la position -1 et -2 du site de clivage. C'est ce doublet qui garantit une reconnaissance du site de clivage par la peptidase dédiée.

Ainsi, le peptide signal pourra être clivé par une peptidase spécifique ou, comme c'est le cas pour la plupart des bactériocines de classe II, il sera clivé par le domaine protéolytique du transporteur lors de la sécrétion de la bactériocine par ce même transporteur (Havantein et al., 1995). Cette reconnaissance du peptide signal est due principalement à sa séquence. En effet, chez les bactériocines de classe II, il est très fréquent d'observer un doublet glycine à la position -1 et -2 du site de clivage. C'est ce doublet qui garantit une reconnaissance du site de clivage par la peptidase dédiée.