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Les potentialités métaboliques des bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre dans le bio-contrôle de Staphylococcus aureus

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Academic year: 2022

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Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA Faculté des Sciences

Département de Biologie

Laboratoire de Microbiologie Appliquée Thèse de Doctorat d’Etat

Option : Microbiologie Alimentaire Titre

Les potentialités métaboliques des bactéries lactiques isolées du lait cru de

chèvre dans le bio-contrôle de Staphylococcus aureus

Présentée par : GUESSAS Bettache

Président : Pr. EL-ABOUDI A. K. Université d’Oran Examinateur : Pr. HENNI J. E. Université d’Oran Examinateur : Pr. AOUES A. Université d’Oran Examinateur : Dr. MOUSSA BOUDJEMA B. Université d’Oran Rapporteur : Pr. KIHAL M. Université d’Oran

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Résumé... III Summary...VI

Introduction... 1

1. Revue bibliographique... 3

1. 1. Problématique... 3

1.2 Les bactéries lactiques... 4

1.3. Définition des bactériocines... 5

1.4. Ecologie des Bactériocines... 8

1.5. Détermination de l’activité de la bacteriocine... 9

1.6. Classification des Bactériocines... 12

1.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action... 15

1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse... 15

1.7.2. Les voies de biosynthèse... 16

1.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport... 20

1.7.4. Régulation de la biosynthèse... 22

1.7.5. L’immunité chez la souche productrice... 23

1.7.6. Mode d'action... 24

1.8. Production et Modélisation du processus... 30

1.9. Purification des bactériocines... 31

1.10. Résistance... 32

1.11. Caractérisation des bactériocines... 33

1.11.1. La nisine... 34

1.12. Spectres d'activité des bactériocines... 40

1.13. Propriétés... 43

1.14. Applications dans les aliments... 44

1.14.1. Biopreservation des produits à base de viande... 45

1.14.2. Biopreservation des produits laitiers... 49

1.14.3. Biopreservation des produits de la mer... 52

1.15. Obstacles technologiques et sécurité alimentaire... 53

1.16. Bactériocines et emballage... 55

1.17. Observations finales... 58

2. Matériel et méthodes... 58

2.1. Provenances des échantillons du lait... 58

2.2. Isolement et identification de la flore lactique... 58

2. 2.1. Préparation de l’échantillon... 58

2.2.2. Identification des isolats... 59

2.2.2.1. Caractérisation morphologiques macroscopique et microscopique59 2.2.2.2. Identification des souches bactériennes... 59

2.3. Conservation des souches bactériennes... 64

2.3.1. Conservation courte durée... 64

2.3.2. Conservation longue durée... 64

2.4. Caractérisation technologiques... 65

2.4.1. Production de l’acidité titrable... 65

2.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose)... 66

2.4.3. Production des composés aromatiques... 66

2.4.4. Production des enzymes protéolytiques... 66

2.4.5. Production de dextran... 67

(3)

2.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes... 68

2.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur... 69

2.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques... 70

2.6. Etude de la cinétique de croissance en culture mixte... 71

3. Résultats... 75

4. Discussion générale... 118

5. Conclusion générale... 124

6. Références bibliographiques... 127

ﺺﺨﻠﻤﻟا... 144

Annexe... 145

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A ma femme et mes enfants

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(6)

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. La contamination des aliments est un problème majeur pour le consommateur surtout dans la période estivale. Dans ce travail, 206 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifie à partir du lait cru de chèvre des régions ouest du pays. Les lactocoques est le groupe représentatif de cette flore avec 76,16%, les streptocoques thermophiles ne sont représentés que par 14,78%, En revanche, les leuconostoques ne représente que 8,6% de cette flore lactique. L’espèce dominante est Lactococcus lactis subsp. lactis. Chez les lactobacilles, Lactobacillus curvatus est l’espèce dominante. Lactobacillus acidophilus est la mois représentée avec seulement 2,19%. L’étude des interactions a révélé la capacité de deux souche Lc7 et Lc8 à inhiber Staphylococcus aureus. En culture mixte, la souche lactique Lc8 diminue considérablement la croissance de Staphylococcus aureus après quelques heures et elle est de 6 log cfu. Les différents tests révèlent la nature proteique de cette substance impliquée dans l’inhibition de Staphylococcus aureus. L’optimisation de la méthode de recherche de souches lactiques protéolytiques a été investie et la concentration de 2% était celle qui permet de déceler les souches faiblement protéolytiques comme celle de forte activité prteolytique.

Mots clés : lait cru, chèvre, bactéries lactiques, Staphylococcus, culture mixte, bactériocine-like, protéolyse

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The lactic acid bacteria have been used for several centuries like protective agents in fermented food. These bacteria are present in a large variety of food, such as fermented milks, the fermented yoghourts, cheeses, and meat products. Thus, various strains of commercial interest or scientist are usually isolated there. The contamination of food is a major problem for the consumer especially during the estival time. In this work, 206 strains of lactic acid bacteria were insolated and identifies from raw goat’s milk in western areas of the country. The lactocoques is the representative group of this flora with 76,16%, thermophilous streptocoques are represented only by 14,78%, On the other hand, the leuconostoques accounts are only 8,6% of this lactic flora.

The dominant species is Lactococcus lactis subsp. lactis. At the lactobacilles, Lactobacillus curvatus is the dominant species. Lactobacillus acidophilus is the month represented with only 2,19%. The study of the interactions revealed the capacity of two strains Lc7 and Lc8 to inhibit Staphylococcus aureus. In mixed culture, the lactic strain Lc8 decreases considerably the growth of Staphylococcus aureus after a few hours and it is 6 log cfu. The various tests reveal the proteic nature of this substance implied in the inhibition of Staphylococcus aureus. The optimization of the method of search for proteolytic lactic stocks was invested and the concentration of 2% was that which makes it possible to detect the strains slightly proteolytic like that of strong prteolytic activity

Key words: raw milk, goat, lactic acid bacteria, Staphylococcus, mixed culture, bactériocine-like, proteolysis

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Depuis toujours, les bactéries sont présentes dans notre alimentation.

Certaines d'entre elles dont les bactéries lactiques, sont utiles, d'autres, comme les bactéries pathogènes ne le sont pas. Depuis l'époque de Louis Pasteur et Robert Koch, il y a eu un besoin essentiel d'identification scientifique pour contrôler les micro-organismes de l’environnement. En plus, la découverte de la pénicilline par Alexander Flemming en 1929 a ouvert la porte pour l’usage thérapeutique des antibiotiques dans le domaine médical et vétérinaire afin de lutter contre les microorganismes pathogènes. Bien que l'utilisation des antibiotiques soient interdite dans les aliments, il y a d'autres agents chimiques de conservation et additifs alimentaires, qui ont des propriétés antimicrobiennes, sont devenus une conduite de la marque dans la sécurité et la conservation des aliments. Actuellement, les scientifiques exploitent les interactions microbiennes pour assurer la salubrité des aliments et pour réduire d’une façon considérable la présence des microorganismes indésirables et nuisibles. En plus de l’effet protecteur de l’acide lactique, l’acide acétique, le diacetyle et le peroxyde d’oxygène, la découverte des bactériocines a donné un élan pour le développement d’aliments de qualité sanitaire meilleure.

Le but de cette étude a donc été l'isolement des souches de bactéries lactiques productrices de substances antimicrobiennes type bactériocine. De pouvoir identifier correctement l'agent et la substance active. De plus. il a fallut identifier les souches productrices et les souches sensibles et de déterminer ainsi le spectre d'activité vis avis des microorganismes impliqués dans les intoxications alimentaires en Algérie. Finalement, l'étude d'interaction et la confrontation en milieu lait entre la souche de bactérie lactique productrice et une souche de Staphylococcus aureus a été réalisée. Les objectifs de recherche de la thèse ont donc été les suivantes :-

-.Isolement des souches de bactéries lactiques productrices de bactériocines

- Caractérisation des substances antimicrobiennes

- Effet antagoniste vis-à-vis de Staphylococcus aureus en milieu lait.

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Revue bibliographique sur les

bactériocines des bactéries

lactiques et leurs applications

dans la conservation des aliments

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1. Revue bibliographique 1. 1. Problématique.

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. Les bactéries lactiques, comme les lactocoques et les lactobaciIles, sont utilisées pour leurs différentes propriétés, surtout celle de pouvoir fermenter le lactose. Cette propriété permet d'améliorer les qualités organoleptiques d'un aliment grâce aux différents composés de la fermentation (diacétyl, divers acides organiques, etc.). La fermentation permet également d'augmenter la durée de vie des aliments. En effet. I'acidification des aliments par la production d'acide lactique permet d'inhiber la croissance de la plupart des bactéries indésirables.

Ces deux dernières décennies, une variété de bactériocines, produites par des bactéries et inhibant la croissance d'autres bactéries, ont été identifiées et caractérisées biochimiquement et génétiquement. Cette revue bibliographique est consacrée à l'étude de l'écologie des bactériocines, détermination de leurs activités, leur biosynthèse et leur mode d'action. La modélisation de la production de bactériocines est aussi discutée. La nisine est la seule bactériocine actuellement purifiée et approuvé pour son usage dans la biopréservation des aliments. La nisine est utilisée avec succès comme un agent de conservation des aliments dans plus de 50 pays. Ce travail est axé sur l'étude des bactériocines du produites par les bactéries lactiques. Le développement des études sur les bactériocines permet de révéler d'autres molécules qui ont un large spectre d'activité et qui seront utilisées comme agents de conservation des aliments. Bien que utilisation de la nisine soit autorisée dans plus de 50 pays (Sahl et Bierbaum, 1998), l'émergence de souches résistantes à la nisine accroît l'intérêt porté sur les autres bactériocines. En effet, des souches résistantes à certaines bactériocines ont déjà été isolées; c'est notamment le cas pour la nisine et la pediocine (Goulhen et al., 1998; Ennahar et al., 2000a). Ceci dit, l'émergence de souches résistantes à la nisine sur le marché alimentaire, doit être considérée et les

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précautions appropriées doivent être prises. Ainsi, la recherche de nouvelles bactériocines et la caractérisation de leurs propriétés physiologique, biochimique et génétique dans différents domaines de recherche mis de l'avant pour offrir aux industriels des alternatives à la nisine.

1.2 Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des micro-organismes utiles à l'homme lui permettant de fabriquer et de conserver un grand nombre de ses aliments. Les bactéries lactiques ont été isolées pour la première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002). Les bactéries lactiques sont Gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide ou bâtonnet, fermentant toutes les carbohydrates en acide lactique principalement.

Figure 1. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN 16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacteriumet propionibacterium(Holzapfel et al., 2001)

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Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzapfel, 1997, Axelson, 2004)(Figure 1). D’autres bactéries gram positive non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium (Sneath et Holt, 2001) ainsi que le genre Bifidobacterium(Gibson et Fuller, 2000; Holzapfel et al., 2001) sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire.

Les travaux récents sur la taxonomie effectué sur la caractérisation des bactéries lactiques basée l’étude de la comparaison de l’ARN ribosomal 16S ont révélé une différence dans les relation entre les la caractérisation phénotypique et la caractérisation phylogénique. Les techniques de biologie moléculaire spécialement la PCR (réaction de la chaine polymerase) , RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient Gel Dénaturé) et TGGE (Gèl Eléctrophorèse en Gradient de Température) sont utilisées pour confirmer l’identification précise des espèces bactériennes.

1.3. Définition des bactériocines

La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette dernière, isolée d'Escherichia coli, possédait une activité bactéricide envers une autre souche de E. coli. Elle fut nommée colicine V (Gratia 1925). À cette époque, le concept de compétition entre diverses bactéries était instauré et bien accepté. Par contre, celui où des bactéries inhibent la croissance de souches de la même famille diffère des conceptions établies. La découverte d'une bactériocine chez les lactocoques remonte à 1933. À cette époque, Whitehead (1933) avait observé dans un lot de lait spécifique que la présence de deux souches de lactocoques inhibait la croissance d'un ferment de culture fromagère. L'étude démontra que les deux lactocoques produisaient une substance de nature protéique résistante au traitement thermique. Ce n'est qu'en 1944 que la première bactériocine d'origine lactique, la diplococcine, fut identifiée. C'est en 1951 que l'utilisation de bactériocine pour protéger les aliments fut proposée. En effet, Hirsch et al. (1951) démontrèrent que la nisine

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inhibait la croissance de Clostridium lors de la maturation d'un fromage de type suisse.

Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques thérapeutiques par leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité d'action étroite contre les mêmes espèces (Tagg et al., 1976). Les bactériocines sont des polypeptides synthétisés par les ribosomes et possédant une activité bactéricide. Elles sont produites par les bactéries et possédant des propriétés antibactériennes, mais ne portant pas le nom d'antibiotiques afin d'éviter la confusion; car les antibiotiques thérapeutiques conservent des réactions potentiellement allergiques chez les êtres humains (Cleveland et al., 2001).

Vue leur composition protéique, les bactériocines sont dégradées rapidement par les protéases dans le tube digestif (Joerger et al., 2000). Les bactériocines sont un groupe très hétérogène, elles sont caractérisées et sélectionnées pour être utilisées en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations et pathogènes; cependant, leur efficacité dans les aliments est limitée pour plusieurs raisons. Il reste que leur coût de production entrave leur usage comme additifs alimentaires. Les recherches récentes sur les bactériocines continuent non seulement pour révéler d'autres bactériocines plus efficaces, mais aussi pour le développement progressif pour l'optimisation de l’utilisation des bactériocines existantes pour répondre aux inquiétudes biologiques et économiques.

Depuis 1950, de nombreux pays utilisent la nisine comme agent bio- préservateur dans les aliments. Seulement, dès 1988 l'organisation mondiale de l'agriculture FDA a autorisée et élargie l’addition de la nisine dans les produits laitiers fabriquées à partir de laits pasteurisés, comme additifs alimentaires (FDA, 1988). La nisine est la principale bactériocine commercialisée, bien que d'autres bactériocines ont été caractérisées et développées pour un possible approbation et utilisation (Chi-Zhang et al., 2004 ; Chikindas et Montville 2002).

Les bactéries lactiques et leurs métabolites ont été consommés en grande quantité depuis plusieurs générations sans aucun effet indésirable, de ce fait les bactéries lactiques continuent à être la source préférée de bactériocines utilisées dans les aliments. L'obtention de bactériocines brutes se réalise en cultivant les bactéries lactiques productrices de bactériocines sur substrat

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naturel brut, en particulier le lait. La fermentation par les bactéries lactiques produit d'autres substances impliquées dans l'activité antimicrobienne. Le terme de purification de bactériocines implique que la substance antibactérienne active est la seule substance antimicrobienne contenue dans la préparation purifiée. L'usage intensif des bactéries lactiques dans l'industrie alimentaire a poussé les scientifiques à créer des souches modifiées génétiquement pour répondre aux exigences technologiques telle que la production de bactériocines pour lutter contre la prolifération des germes indésirables. Etant donné l'utilisation des bactéries lactiques comme levain pour la fabrication des aliments fermentées, elles sont ainsi des candidates évidentes pour une éventuelle modifications génétiques, afin d’améliorer génétiquement la régulation de la production de bactériocines.

En plus de la sécurité alimentaire confirmée par les travaux scientifiques, une perception des consommateurs d’un rôle probiotique a été sentit. Actuellement, les scientifiques révèlent progressivement le rôle thérapeutique des bactéries lactiques. Le terme GRAS (Generally Recognized As Safe), désigne le rôle nutritionnel et sanitaire attribuer aux bactéries lactiques.

L'utilisation des bactériocines dans les aliments fut introduite par Hirsh et al., en 1951, lorsqu'il démontra que la nisine était en mesure d'inhiber la croissance de Clostridium dans un fromage fait de lait pasteurisé. Cette découverte eut comme effet de propulser les études sur les bactériocines. En effet, grâce à l'activité anti-microbienne de leurs bactériocines, les bactéries productrices ont la capacité de diminuer la charge microbienne d'un aliment et donc de contribuer à leur innocuité. Malgré tout, seule la nisine est autorisée à ce jour comme additif alimentaire (Delves-Broughton, 1996). En effet, la nisine est la seule bactériocine à posséder le statut GRAS (Generally Recognized As Safe), décerné en 1988 par la FDA des Etats-Unis (FDA, 1988).

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont efficaces contre les bactéries pathogènes gram-positif et ont un impact direct sur les maladies transmises par les aliments. Les bactériocines inhibent les germes pathogènes tels que Listeria monocytogenes, une bactérie pathogène répandue dans l'environnement et difficile à contrôler dans les aliments. Ammor et al., (2006a et 2006b) ont pu appliqué les bactériocines des bactéries lactiques dans des films alimentaires afin d’inhiber la croissance des bactéries de contaminations.

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Arqués et al., (2006) ont montré l’efficacité des bactériocines des bactéries lactiques à inhiber la croissance de plusieurs bactéries pathogènes telle que Staphylococcus aureus dans des fromages. C’est le cas de d’autres études (Millette et al., 2007). Pour ces raisons, l'intérêt de rechercher des bactériocines a continué inchangé depuis les 25 derniers années et ne semble pas s'affaiblir de manière significative.

1.4. Ecologie des Bactériocines

Il paraît que la capacité d'en synthétiser une ou plusieurs bactériocines a été une caractéristique très avantageuse. Une opportunité claire pour la survie et la prolifération d'un organisme peut être envisagée s'il peut éliminer un micro-organisme en compétition là où la compétition peut être tout à fait intense créant ainsi une diversité des espèces et la croissance rapide des bactéries (Dykes 1995). Les antibiotiques de faible poids moléculaire (par exemple, la tétracycline), agents lytiques, toxines, enzymes lytiques, les bactériophages, et les métabolites secondaires, tel que les acides organiques, l'eau oxygénée, et le diacétyle, agissent également d’une manière similaire.

Mais néanmoins la capacité de produire des bactériocines et la protéine d’immunité par la cellule productrice se produit abondamment chez les procaryotes, eubactéries et les archaebactérie. Les bactériocines jouent un rôle fondamental dans la dynamique de la population bactérienne bien que le degré d'interactions de la bactériocine soit si complexe au niveau écologique et évolutif dans les cultures mixtes.

Comme noté par Riley (1998), le suivit des bactériocines dans les milieux naturels, chez Lactobacillus plantarum dans la fermentation des olives vert, chez Escherichia coli dans la conjonctive du cobaye, et Streptococcus mutans dans la cavité orale humaine, a indiqué que l'avantage de la compétition est augmenté substantiellement pour les bactéries productrices de bactériocines envers les bactéries sensibles dans le même environnement.

Dans l’exemple du L. plantarum, une souche productrice de bactériocine a été utilisée pour fermenter les olives vertes d’Espagne (Leal-Sánchez et al., 2003 ; Ruiz-Barba et al., 1994). La souche productrice de bactériocines se maintient à un niveau très élevé dépassant 12 semaines de fermentation. En revanche,

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quand une souche, non productrice, de la même espèce est utilisée en fermentation, celle-ci n’est pas détectée après 7 semaines.

Sur ceci, les modèles mathématiques ont été conçus pour évaluer les interactions entre souches productrices de bactériocine et variantes sensibles.

La plupart des modèles écologiques de bactériocines ont été fait avec la colicine (bactériocine produite par Escherichia coli et montrant habituellement une activité envers d’autres souches d'E. coli et des membres apparentés des Enterobacteriaceae).

L’induction s’opère habituellement sous conditions stressantes telles qu'épuisement nutritionnelle ou un surplus (Riley et Wertz 2002; Riley et Gordon 1999). La colicine diffèrent des bactériocines des bactéries gram-positif dans le sens qu'ils ont trois mécanismes d'action généraux: formation de canal dans la membrane cytoplasmique, (le mécanisme commun est rencontré avec les bactériocines des bactéries à gram-positif ), dégradation de l'ADN cellulaire, et inhibition de la synthèse protéique. Il est estimé qu'approximativement 30%

des populations naturelles d'E. coli produisent des bactériocines (Riley 1998).

Plus de 25 types de colicine ont été identifiés (Pugsley 1984). Il est aussi estimé qu’approximativement 70% de la population d'E. coli sont résistantes à un sel type de colicine, et 30% sont résistantes à tout types de colicine produite dans une population avec le du colicine-sensitive des cellules restantes (Smarda 1992). Le nombre relatif aux souches productrices de colicine dépendait de l'énergie associée avec la synthèse de la colicine (Riley et Gordon 1999).

1.5. Détermination de l’activité de la bactériocine

L’étude des interactions bactériennes est très commune. Les bactériocines représentent une catégorie de substances produites par les bactéries qui inhibent d’autres. Dès 1676, Antonie van Leeuwenhoek a défini l’antibiose comme étant le produit excrété par un micro-organisme capable d’inhiber un autre (Joerger et al., 2000). En 1877, Louis Pasteur et Joubert ont rapporté l'effet inhibiteur de bactéries de l'urine sur Bacillus anthracis. Comme mentionné plutôt, en plus des bactériocines, les substances inhibitrices produites par les bactéries incluent les antibiotiques cliniques ou thérapeutiques de faible poids moléculaire, les agents lytiques, toxines,

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enzymes bactériolytiques, bactériophages, et autres métaboliques secondaires, tel que l’eau oxygénée et le diacétyle. Ainsi, dans une niche écologique, un seul type de bactérie peut être plus compétitif qu'un autre vis-à-vis de la source nutritionnelle ou la sensibilité à un facteur environnemental, tel que la disponibilité de l’oxygène. Avec une telle variabilité de produits inhibiteurs ou conditions environnementales, l’antagonisme n’est pas dû dans sa totalité par les bactériocines. L’étude des bactériocines des bactéries lactiques doit prendre en compte la grande quantité d’acides organiques produite au cours du métabolisme bactérien et devrait écarter l’inhibition due à ces acides.

Un moyen commun pour rechercher l'activité des bactériocines est l'utilisation des milieu gélosé en boite de Petri. Mayr-Harting et al. (1972), Piddock (1990), Parente et Riccardi (1999) et Akçelik (2006) ont passés en revue les méthodes de détection et d’évaluation de l’activité des bactériocines. Il y a beaucoup de variations dans ces méthodes, la plupart d'elles dérivent de la méthode dite de la double couche, un test direct, dont la souche productrice et sensible sont co-cultivées et incubées puis des zones d’inhibition autour de la colonie de la souche productrice sont recherchées. L’exemple conçu est la culture de la souche productrice par touche ou strie, sur milieu gélosé sur laquelle une surcouche de gélose moelle contenant la souche indicatrice ou sensible (Sabine, 1963). Les différentes méthodes permettent de respecter le temps et les conditions de culture relatives à la souche productrice et sensible, ces dernières sont plus sensibles que les méthodes directes (Tagg et al., 1976).

Kekessy et Piguet (1970) décrivaient une procédure ou la souche productrice et indicatrice étaient cultivées chacune sur leur milieu optimal respectif. La souche productrice était cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu est complètement délogé à l’aide d’une spatule et déposé dans une autre boite en sens inverse (culture au dessous). Une surcouche de gélose moelle ensemencée par la souche indicatrice est coulée sur le premier milieu. Après incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice. Cet essai minimise les effets d'acides et l’action des bactériophages, du fait que les deux souches sont séparées physiquement par une couche d’agar. La composition du milieu de culture est un facteur important dans les essais en boite de pétri, mais la question va au-delà des exigences nutritionnelles de la souche productrice et la

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souche cible. L’utilisation de l’agar dans les milieux solides peut perturber la diffusion de la bactériocine, donc limiter l’efficacité de la méthode utilisée (Lindgren et Clevstrom 1978). Les autres composés peuvent entraver les résultats. Par exemple, Hoover et al., (1989) ont trouvés que β-glycérol phosphate (utilisé comme tampon) dans le milieu M17 avec la méthode Kekessy-Piguet interfère avec les zones d'inhibition causées par Pediococcus acidilactici (PO2) comparé à d’autre milieu de culture et substance tampon.

Cependant, Spelhaug et Harlander (1989), n’ont rencontré aucune difficulté à faire exprimer l'antagonisme de la bactériocine produite par Pediococcus pentosaceus FBB61 et FBB63-DG2 sur milieu solide M17-glucose. Peut-être, ceci est dû à une bactériocine différente produite par ces souches ou la méthodologie utilisée était légèrement différente.

Rose et al., (1999) ont adapté la spectrométrie de masse pour une détection rapide de la pediocin, la nisine, la brochocins A et B, et l’enterocins A et B à partir de surnageants de culture. La méthode est dite matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF MS) qui a été conçue originairement pour l'examen de grandes molécules, tel que les biopolymers. Dans ce protocole, un lavage du surnageant pendant 30 seconde est opéré afin d’éliminer les impuretés puis la procédure est suivit jusqu’à purification complète de la bactériocine.

La PCR est utilisée pour détecter les gènes responsables de la production et la régulation de la bactériocine dans les cultures bactériennes. Rodriguez et al, (1995) ont pu amplifier le gène structural de la lactocine S chez 7 souches de lactobacilles isolés du saucisson fermenté. Dans un autre travail, Garde et al., (2001) ont détecté le gène de production du lacticine 481 et la nisine en utilisant la PCR avec une spécificité dans l’isolement de Lactococcus lactis subsp. lactis à partir du fromage de lait cru. Rodriguez et al., (1998) ont détecté l’enterocine AS-48 à partir des entérocoques isolés du lait et les produits laitiers en utilisent la méthode d'hybridation des colonies. Martinez-Bueno et al., (1994) ont réalisé le séquençage des gènes codant la synthèse de l’enterocine AS-48. Une technique PCR a été développée pour détecter rapidement ces gènes (Joosten et al., 1997).

Mugochi et al., (2001) ont développé une méthode rapide et sensible pour détecter les bactériocines à partir du milieu de fermentation. Les faibles

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concentrations d'ions de potassium ont été mesurées, ainsi la quantité libérée par la souche bactérienne sensible corrélée avec la quantité de bactériocine présente dans la portion de bouillon nutritif entrant dans celle-ci. Cette méthode se compare facilement à celle de la méthode de diffusion en milieu solide.

1.6. Classification des Bactériocines

Découvert en premier par Gratia en 1925, “principe V” a été produit par une souche d'E. coli envers une autre souche de la même espèce. Le terme

“colicine” a été utilisé par Gratia et Fredericq (1946); “bactériocine” a été utilisé par Jacob et al. (1953) comme un terme général pour les protéines antibactériennes très spécifiques. Maintenant le terme colicine désigne une protéine à caractère bactéricide produite par une souche d'E. coli et d’autres membres apparentés aux Enterobacteriaceae (Konisky 1982). Bactériocines (comme les colicines) ont été défini originairement comme protéines bactéricides caractérisées par leur action létale, un large spectre d'activité, et une adsorption spécifique sur des récepteurs de la membrane cellulaire (Jacob et al., 1953).

Plus tard, la biosynthèse des bactériocines par les plasmides a été ajoutée à leur description. La définition a depuis été modifié pour incorporer les propriétés des bactériocines produites par les bactéries à gram-positif (Tagg et al., 1976).

Chez les bactériocines, différentes règles de nomenclature ont déjà été proposées (Hamon et Peron, 1963). Par contre, aucune n'a réellement été adoptée de façon unanime. Bien que l'addition du suffixe «ine» soit généralement employée, il demeure qu'il y a beaucoup de variabilité dans la nomenclature. En fait, la nomenclature d'une bactériocine est parfois basée sur le genre bactérien (Takeya et Tokiwa, 1974) ou parfois sur l'espèce (Hamada et Ooshima. 1975). Il est même arrivé que pour une même espèce, la bactériocine soit nommée selon les deux méthodes désignées. C'est notamment le cas de Corynebacterium diphtheriae où les bactériocines sont nommées corycine ou diphthericine selon l'équipe qui a isolé la bactériocine (Krylova, 1969; Gibson et Colman, 1973). Malgré tout, et pour des raisons de

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simplification, il arrive fréquemment que la désignation donnée aux nouvelles bactériocines inclut le nom de souche de la bactérie productrice (Ross et al., 1999).

Les bactériocines des bactéries à gram-positif ne possèdent pas de récepteurs spécifiques pour l'adsorption mais des exceptions existent (Gravesen et al., 2002b), ces dernières sont pour la plupart de faible poids moléculaire que les colicines, ont une large gamme de bactéries cibles, avec différents modes d'excrétion dans le milieu externe et de transport membranaire (Jack et al., 1995; James et al., 1991; Riley 1998). Aujourd'hui, les peptides ou les protéines à caractère bactéricide, produites par les bactéries font typiquement référence aux bactériocines. Habituellement, la nature protéinique d'une bactériocine récemment caractérisé est démontrée par sa sensibilité aux enzymes protéolytiques telles que la trypsine, l’α-chymotrypsine, et la pepsine.

Son évaluation pour être utilisé comme additif alimentaire exige l’estimation de sa résistance à la température, un facteur très utilisé dans l’industrie alimentaire. Durant des années, plusieurs publications ont passé en revue les colicines, bactériocines des bactéries lactiques et l’application de bactériocines spécifiques. Les exemples incluent Reeves (1972), Franklin et Snow (1975), Hardy (1975), Tagg et al., (1976), Konisky (1982), Klaenhammer (1988, 1993), Jack et al., (1995), de Vos et al., (1995), Sahl et al., (1995), Venema et al., (1995c), Abee et al.,(1995), Nes et al., (1996), et Cleveland et al., (2001).

La plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont cationiques, hydrophobes, ou des molécules amphiphiliques composées de 20 à 60 résidus d'acide aminé (Nes et Holo 2000).

Afin de faciliter leur identification, différentes méthodes de classification ont été proposées. En 1976, une méthode de classification des bactériocines isolées des bactéries à Gram positif fut proposée (Tagg et al., 1976). Compte tenu du nombre important de bactériocines et de leurs multiples origines, une première classification des bactériocines produites par les bactéries lactiques f'ut proposée (Klaenhammer, 1988) et remise à jour par le même auteur (Klaenhammer, 1993). Essentiellement, cette méthode classe les bactériocines selon leur résistance à la chaleur, leur taille, certaines propriétés physico- chimiques, leur spectre d'activité et la présence ou non d'acides aminés

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modifiés. Pour ce faire, elle sépare les bactériocines produites par les bactéries lactiques en quatre classes distinctes.

La classe I est formée des lantibiotiques. Ces petits peptides, de poids moléculaire inférieure à 5 kDa, agissent au niveau de la membrane cytoplasmique. Elles ont toute la caractéristique commune de posséder des acides aminés modifiés. Ces derniers résultent de modifications post- traductionnelles de la sérine, la thréonine et la cystéine en lanthionines. P- méthylelanthionines ainsi qu'en résidus déshydratés. La nisine, la subtiline, la duramycine ainsi que la cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques (Delves-Broughton et al., 1996; Sariset al.,1996; Sahl et Bierbaum, 1998).

La classe II est caractérisée par des petits peptides dont la masse moléculaire est généralement inférieure à 10 kDa. Ces bactériocines sont stables à la chaleur et sont caractérisées par un site de maturation conservé Gly-Gly situé sur le peptide signal. Ces dernières ne contiennent pas d'acide amine modifié.

Par ailleurs, les bactériocines matures sont prédisposées à former des hélices amphiphiles avec des régions d'hydrophobicité variable et il est prédit que la structure secondaire de forme native possède des feuillets p. Cette classe est subdivisée en trois sous-classes:

- classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria ayant une séquence constitué en N-terminale de Tyr-Gly-Ans-Gly-Val-X-CyLsa. La pédiocine PA- 1, la sakacine P, la leucocine A-UAL187 et la curvacine A n'en sont que quelques exemples (Hastings et al., 1991 ; Holck et al., 1992; Tichaczek et al., 1992).

- classe IIb Complexe de poration qui nécessite deux peptides pour être actif. La lactococcine G et la lactacine F en sont deux exemples (Mulet- Powell et al.,1998).

- classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu cystéine pour être actif. La lactococcine B en est un exemple classique (Venema et al., 1993).

La classe III comprend toutes les bactériocines de poids moléculaire élevé (>30 kDa). Les bactériocines de cette classe ont la caractéristique d'être thermosensible, c'est-à-dire qu'elles ne résistent pas aux traitements

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thermiques sévères. L'helveticine I et les lacticines A et B en sont trois exemples (Joerger et Klaenhammer, 1986; Toba et al., 1991).

La classe IV englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique pour être active. Klaenhammer (1993) a suggéré cette quatrième classe, comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou des fractions lipidiques pour leur activité. Cependant, les bactériocines de cette classe n'ont pas été suffisamment caractérisées au niveau biochimique vu que leur définition nécessite des informations supplémentaires (Jimenez-Diaz et al., 1995; McAuliffe et al., 2001). C'est le cas notamment de la pédiocine SJ-1 et de la lactocine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975; Schlyter etal., 1993).

1.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action

1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse

La synthétise des bactériocines est ribosomiale. Les gènes qui codent la production et l’immunité sont organisés habituellement en opéron (Nes et al., 1996; Sahl et Bierbaum 1998; McAuliffe et al., 2001). La synthèse des bactériocines linéaires non modifier inclue la plantaricine, la carnobacteriocine et la sakacine, paraît induite par des peptides spécifiques. Cette synthèse est localisée sur le même opéron (Quadri et al., 1997; Brurberg et al., 1997;

Anderssen et al., 1998). Les gènes de synthèse des bactériocines peuvent être localisés sur le chromosome, comme dans le cas de la subtiline (Banerjee et Hansen 1988) et la mersacidine (Altena et al., 2000) ou plasmidique, comme dans le cas de la divergicine A (Worobo et al., 1995) et la sakacine A (Axelsson et Holck 1995), ou sur un transposon comme dans le cas de la nisine (Rauch et de Vos 1992) et la lacticine 481 (Dufour et al., 2000).

Les opérons de la biosynthèse des lantibiotiques contiennent généralement des gènes qui codent pour le prépeptide LanA – lan. Cette l'abréviation faisant référence aux gènes homologues du gène des différents groupes de lantibiotiques. Des enzymes responsables des réactions de transformation de la prébacteriocine (LanB,C/LanM), des protéases responsables du clivage du peptide (LanP), le système de transport ABC (ATP-binding cassette), un système de transport protéique responsable dans la translocation du peptide (LanT), des protéines de régulation (LanR, K), qui sont des protéines impliqué dans

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autoprotection chez la souche productrice (immunité) (LanI, FEG). Ces informations ont été récoltées à partir d’une multitude d’analyse génétiques sur plusieurs lantibiotiques, l’epidermine (Schnell et al., 1992, Bierbaum et al., 1996; Geissler et al., 1996), nisine (Buchmann et al., 1988; Mulders et al., 1991; de Vos et al., 1995), subtiline (Banerjee et Hansen 1988; Klein et al., 1992; Klein et al., 1993, Klein et Entian 1994), lacticine 481 (Piard et al., 1993;

Rince et al., 1997; Uguen et al., 2000), et mersacidine (Bierbaum et al., 1995;

Altena et al., 2000).

La régulation génétique des bactériocines de la classe II, les lactococcines A, B, et M (Holo et al., 1991; Van Belkum et al., 1991; Stoddard et al., 1992; Van Belkum et al., 1992; Venema et al., 1995b), pédiocine PA- 1/AcH (pédiocine PA-1 et AcH représentent la même molécule; le nom de pédiocine le PA-1 est plus couramment utilisé) (Marugg et al., 1992; Motlagh et al., 1992;

Bukhtiyarova et al., 1994; Venema et al., 1995a), et plantaricine A (Diep et al., 1994; 1995; 1996) ont été étudiées. Les gènes responsables de la biosynthèse des bactériocines de la classe II se partagent plusieurs similitudes dans l’organisation génétique. Elle en consiste dans le gène structural codant pour le peptide précurseur, par le gène codant pour la protéine d’immunisation et celles du système de transport ABC ainsi que d’autres protéines essentielles dans l'excrétion dans le milieu. Ces protéines ne sont pas présentes chez les lantibiotiques (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000). Enfin, dans certains cas, on rencontre le gène de régulation. La génétique des lantibiotique et non lantibiotique a été largement débattue par Klaenhammer,(1993), Jack et al., (1995), Nes et al., (1996), Sahl et Bierbaum (1998), Van Kraaij et al., (1999), Ennahar et al., (2000b), Sablon et al., (2000), et McAuliffe et al., (2001).

1.7.2. Les voies de biosynthèse

La biosynthèse d'une bact6riocine nécessite l'interaction de plusieurs facteurs qui sont généralement contrôlés par des protéines. L'induction de la synthèse d'ARN, la maturation, l'exportation et finalement l'immunité de la souche productrice sont toutes contrôlées par des familles de protéines distinctes. De façon générale, la biosynthèse d'une bactériocine débute par le signal provoqué par un facteur d'induction. En générale, ces facteurs d'induction provoquent un signal chez une histidine-kinase située à la surface

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de la membrane. Celle-ci provoque la phosphorylation d'un régulateur de réponse qui interagit directement avec les différents promoteurs présents sur l'opéron de la bactériocine. Quelques facteurs d'induction sont bien connus.

Par exemple, la biosynthèse de la nisine est induite par la nisine elle-même alors que pour les bactériocines de classe II, c'est un peptide similaire à la bactériocine qui induira la biosynthèse (Kuipers et al., 1995; Nes et al., 1996a).

Ces peptides sont généralement inactifs. Par contre, le facteur d'induction de la plantaricine démontre une activité bactéricide (Anderssen et al., 1998).

Suite à l'induction, les bactériocines sont synthétistes par la voie ribosomique sous forme de pré-peptides. Ces derniers possèdent un peptide signal en N- terminal qui doit être clive pour que la bactériocine mature soit active. La présence du peptide signal joue un double rôle. En premier lieu, tout indique que la présence du peptide signal inactive la bactériocine (Ennahar et al., 2000b). De plus, cette séquence en N-terminal garantit que le pré-peptide sera exporté via le transporteur dédié ou sec-dépendant approprié (Nes et al., 1996).

Ainsi, le peptide signal pourra être clivé par une peptidase spécifique ou, comme c'est le cas pour la plupart des bactériocines de classe II, il sera clivé par le domaine protéolytique du transporteur lors de la sécrétion de la bactériocine par ce même transporteur (Havantein et al., 1995). Cette reconnaissance du peptide signal est due principalement à sa séquence. En effet, chez les bactériocines de classe II, il est très fréquent d'observer un doublet glycine à la position -1 et -2 du site de clivage. C'est ce doublet qui garantit une reconnaissance du site de clivage par la peptidase dédiée.

La plupart des bactériocines sont synthétisées comme un prépeptide biologiquement inactif qui porte une extrémité N-Terminale attachée à l’extrémité C-Terminale du propeptide. Pour les lanthibiotiques, la sérine, thréonine, et les résidus cystéiniques dans leurs parties du propeptide subissent une post-translation extensive pour former Lan/MeLan. La voie de biosynthèse des lanthibiotique suit un schéma global (Figure 1): formation du prépeptide, réaction de modification, clivage protéolytique de l’amorce peptidique, transport du prépeptide modifié ou du prépeptide mûr à travers la membrane cytoplasmique.

Le clivage de l’amorce se déroule soit durant l’opération de synthèse ou après l’excrétion de la cellule. Sur la base de cette voie de biosynthèse les

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lantibiotiques sont génétiquement divisées en deux groupe I et II (Sahl et Bierbaum 1998; Guder et al., 2000; McAuliffe et al., 2001). Ce plan de classification n'est pas lié à la classification précédente qui divise les lantibiotiques en type A et B, ainsi le groupe I et II peuvent être de type A ou B.

Par exemple, la lacticine 481 qui appartient au grouper II d'après ce plan d'organisation génétique est un lantibiotique de type A. Dans la production des lantibiotiques du groupe I, comme dans le cas de la nisine, l’épidermine, la subtiline, et le Pep5, la réaction de déshydratation est catalysée vraisemblablement par l'enzyme LanB, pendant que LanC est impliqué dans la formation du thioether. Le prépeptide modifié est traité par une sérine-protéase LanP et transporté à travers le système de transport ABC LanT. Par contre, les lantibiotiques du groupe II, comme dans le cas de la cytolysine, la lacticine 481, et la mersacidine, sont modifiées par un seul enzyme LanM (Van Kraaij et al., 1999; McAuliffe et al., 2001), et la maturation prend place de façon concomitante au cours du transport par LanT(P). La lactocine S est l'exception de cette classification. Elle est modifiée par un seul enzyme LanM et sa maturation se fait avant son transport, de ce fait elle peut représenter un nouveau groupe (Skaugen et al.,1997).

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Figure 2 : Schémas représentant les modifications post-translationelle du Pep 5. En haut le prépeptide Pep5 non modifié. A l’éxtremité, le site d’action de la protéase. Au milieu, Dehydratation du groupement gydroxyl de l’acide aminé (R=H pour Serine ou R=CH3 pour la thréonine) et la formation du thioether (R=H pour le Lantibiotique ou R=CH3 pour le methionine lantibiotique). En bas, cleavage du peptide amorce et la désamination du groupement N-terminal donnant le Pep5 mature et actif.

La classe II des bactériocines (Table 1) sont synthétisées comme un prépeptide qui contient une extrimité N-Terminale qui demeure inchangée et un site protéolytique avec deux molécules de glycine très caractéristique pour sa maturation, à l’exception avec la classe IIc des bactériocines, qui sont synthétisées avec une séquence typique N-terminal dite du type sec et sont par la suite traitées et sécrétées par la voie de sécrétion générale (Leer et al., 1995; Worobo et al., 1995).

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Figure 3. représente le schéma de la biosynthèse des lantibiotiques: (1) Formation de la prébactériocine; (2) la prébactériocine est modifiée par LanB et LanC, transloquée à travers le système Abc de transport LanT, résultant de la maturation de la bactériocine; (3) l’histidine a protéine kinase (HPK) phosphorylant la bactériocine; (4) le groupement phosphorylé (P) est transféré par la suite au régulateur répondant RR;

(5) le RR active transcrit des gènes régulés; et (6) production de la protéines de l'immunité, LanI, et les protéines de Transport, LanFEG (Leer et al., 1995).

Contrairement au lantibiotiques, la classe II des bactériocines ne subissent pas une modification post-translationnelle. Le suivi de la formation du prépeptide montre que ce dernier subit un traitement pour éliminer l’amorce peptidique pendant son transport à travers le système ABC et ses protéines auxiliaires (Nes et al., 1996; Ennahar et al., 2000b). La voie de biosynthèse de cette classe est représentée dans la figure 3.

Plusieurs fonctions de l’amorce peptidique ont été proposées. Il peut servir comme un site de reconnaissance qui dirige le prépeptide vers sa maturation et vers la protéine du transport, protège la souche productrice en gardant le lantibiotique dans son état inactif pendant qu’il se trouve à l’intérieur de la cellule productrice et réagit avec le propeptide pour assurer une conformation convenable qui est essentiel pour l’interaction du complexe enzyme-substrat (van Der Meer et al., 1994; van Belkum et al., 1997; Sablon et al., 2000;

McAuliffe et al., 2001).

1.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport

Ingram (1969; 1970), le premier à avoir proposé deux étapes de réaction de modification post-translationnelle d'un pre-lantibiotique menant à la formation du Lan/MeLan. Initialement, les acides aminés hydroxylés, la sérine et la thréonine, sont déshydratés pour former respectivement le 2,3-

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didehydroalanine et le 2,3-didehydrobutyrine. Quelques acides aminés dehydratés ne contiennent pas de résidus de cystéine et restent comme tel dans le peptide mûr; D’autres subissent une réaction intramoléculaire d’addition de Michael qui implique le groupement thiol des résidus cystéine avoisinants et la double liaison de l’acide didehydroamino, donnant ainsi lieu à la formation de ponts thioether.

Le suivit des réactions de modification, montrent que les prélantibiotiques modifiés subissent une protéolyse pour libérer la séquence terminale menant ainsi à l’activation du lantibiotique. Pour le groupe I des lantibiotiques, la séquence terminale est enlevée par une protéase à sérine, LanP, et, selon l'emplacement du LanP, cela peut avoir lieu avant ou après la sécrétion du peptide de cellule productrice par le système de transport ABC, LanT.

Figure 4. schématise la voie de la biosynthèse de bactériocines de la classe II: (1) Formation de la prébactériocine et le facteur initial prépeptide IF; (2) La prébactériocine et le pré IF sont traités et transportés par le système de transport Abc, produisant la bactériocine mature et l’IF; (3) l’histidine kinase (HPK) capte l’IF et le phosphorolyse par l’ATP; (4) Le groupe phosphate (P) est par la suite transféré au régulateur RR; (5) le régulateur RR active transcrit les gènes de régulation; et (6) production de la protéine d’immunité (Leer et al., 1995).

Par exemple, les protéases LanP de l'epicidin 280 et Pep5 (Sahl et Bierbaum 1998) sont intracellulaire afin que la protéolyse prend place dans la cellule. Par contre, les protéases de la nisine (van der Meer et al., 1993) et l’epidermine (Geissler et al. 1996), lesquels sont extracellulaire, activent le lantibiotique seulement après exportation par le système de transport ABC. Ce system contient entre 500 et 600 acides aminés et est caractérisé par deux domaine N et C-terminal. Le domaine N-terminal consiste en 6 hélices couvrant la membrane qui peuvent reconnaître le substrat et créer son chemin à travers la

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membrane, pendant que le domaine cytoplasmique C-Terminal contient deux domaines porteur d’ATP en conservant la liaison avec l’ATP. L'hydrolyse de l'ATP se produit vraisemblablement au niveau du domaines de rattachement de l’ATP, fournissant ainsi de l'énergie d''exportation (Fath et Kolter 1993;

McAuliffe et al., 2001). Les enzymes LanB et LanC, avec le transporteur LanT, forment probablement un complexe multi-métrique associé à la membrane (Siegers et al., 1996; Kiesau et al.1997). Pour le groupe II des lantibiotiques, possédant un site de clivage di-glycine, le processus protéolytique se déroule en concomitante avec l’exportation à travers un système de transport ABC hybride. Cet ABC-Transporteur unique possède une protéase du domaine N- Terminal fait approximativement de 150 résidus d'acide aminé qui clive la séquence de tête diglycine (Nes et al., 1996; Sablonet al., 2000) (Figure 4).

Les ressemblances substantielles existent entre la séquence de tête peptidique de la classe IIa et b et celles du groupe II des lantibiotiques. Les deux contiennent le site de clivage à double glycine (Nes et al., 1996; Ennahar et al., 2000b).

La conservation du site de clivage recommande fortement que le mécanisme de traitement et de translocation des bactériocines de la classe IIa et b soit très semblable à celui du groupe II des lantibiotiques. Les bactériocines de la classe IIc sont traitées par une peptidase signal pendant la translocation à travers la membrane cytoplasmique.

Figure 5. Le système de transport ABC avec un domaine N-Terminal de la protéase (Sablon et al., 2000).

1.7.4. Régulation de la biosynthèse

La biosynthèse des lantibiotiques et nonlantibiotiques est régulée habituellement à travers 2 systèmes régulateurs. Ces systèmes régulateurs consistent en 2 protéines productrices de signal, une protéine kinase membranaire représentant le site histidine (HPK), et un régulateur de la

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réponse cytoplasmique (RR) (Stock et al., 1989; Parkinson 1993; Nes et al., 1996). Dans la voie de transduction du signal, le HPK opère une auto phosphorylation du résidu histidine dans son domaine intracellulaire quand il excrète une certaine concentration de bactériocine dans le milieu externe. Le groupe phosphorylé est transféré vers le résidu de l'acide aspartique sur le domaine récepteur du RR et les changements intramoléculaires résultants déclenchent une réponse de régulation pour activer la transcription du gène régulé. Ces gènes régulés incluent le gène structurel, les gènes exportateurs, les gènes de l'immunité, et dans quelques cas, les gènes régulateurs eux- mêmes (Kuipers et al., 1998).

Pour la nisine et la subtiline, la molécule de bactériocine, apparemment elle- même agit comme un signal externe pour autoréguler sa propre biosynthèse via un signal de transduction (Kuipers et al., 1995; Guder et al., 2000). Par contre, la plupart des bactériocines de la classe II produisent un peptide similaire à la bactériocine sans activité antimicrobienne et utilisé comme un facteur d’induction (IF), pour activer la transcription des gènes de régulation.

Le facteur d’induction (IF) est un petit peptide, thermostable, cationique et hydrophobe qui est synthétisé en premier comme une prépeptide avec une séquence de tête à double glycine. Le system de transport ABC relatif clive spécifiquement la séquence de tête du facteur IF en concomitance avec l'exportation du peptide mûr à partir de la cellule. Le facteur IF ainsi sécrété agit comme un signal externe qui déclenche la transcription des gènes impliqués dans la production de la bactériocine (Nes et al., 1996; Ennahar et al., 2000b).

1.7.5. L’immunité chez la souche productrice

Suite à la sécrétion de bactériocines matures, l'immunité doit être conférée à la souche productrice. Pour les bactériocines de classe I identifiées chez les lactocoques, deux systèmes participent à l'immunité. La majorité de l'immunité est attribuable à des protéines d'immunité dont le mode d'action exact demeure inconnu. Il est cependant postulé que ces dernières sont présentes sur la surface externe de la membrane bactérienne et que leur structure est modifiée par des lipides (Kuipers et al., 1993). Deux systèmes d'immunité des lantibiotiques de la cellule productrice ont été identifiés. La protection peut être véhiculée par la protéine d’immunité LanI, et son système

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de transport ABC relatif, LanFEG (Reis et al., 1994; Siegers et Entian 1995;

Peschel et Gotz 1996; Saris et al.,1996; McAuliffe et al.,2001). Ces deux systèmes d'immunité fonctionnent synergitiquement pour protéger la cellule productrice de leur propre bactériocine (Klein et Entian 1994). LanI, lequel est attaché très probablement à la face externe de la membrane cytoplasmique, donne une immunité aux cellules productrices en empêchant la formation de pores par la bactériocine. LanFEG agit apparemment en transportant la bactériocine qui est insérée sur la membrane vers le milieu environnant et garder ainsi la concentration de la bactériocine dans la membrane à des niveaux critiques.

Pour les bactériocines de la classe II, le gène d'immunisation code habituellement pour une protéine qui est généralement associée avec la membrane cytoplasmique. Quadri et al., (1995) ont utilisé la technique de Western blot (immunoblot) pour ces analyses et ont indiqué que la majeure partie de la protéine de l'immunité (CbiB2) de la carnobacteriocine B2 est trouvée dans le cytoplasme et qu'une plus petite proportion est associée à la membrane. Abdel-Dayem et al., (1996) ont démontré que la majorité des protéines de l'immunité (MesI) de la mésentericine Y105 se situe dans le cytoplasme, avec seulement une petite proportion détectée dans la membrane.

La protéine de l'immunité qui est cationique et constituée de 51 à 254 acides aminés, fournit une immunité totale contre la bactériocine. L’interaction de la protéine de l'immunité avec la membrane paraît protéger la souche productrice contre sa propre bactériocine (Nissen-Meyer et al., 1993a, b; Venema et al., 1994; Nes et Holo 2000). L'immunité serait en fait attribuée à une seule protéine de surface. Ces protéines sont généralement de petite taille et montrent un faible degré d'homologie entre elles. Par contre, Eijsink et al., (1998) stipulent que ces dernières pourraient avoir une conformation structurelle similaire.

1.7.6. Mode d'action

La plupart des bactériocines produites par les lactocoques qui ont été caractérisées démontrent un mode d'action semblable. En effet, à part la lactococcine 972 qui sera décrite par la suite, les bactériocines semblent former des pores dans la membrane des cellules sensibles. Certaines bactériocines,

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comme la nisine, n'ont pas de récepteur spécifique (Abee et al., 1995). En effet, la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides cationiques présents à la surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre, il semblerait que pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de pores nécessite la présence d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de la bactériocine à la membrane cellulaire (van Belkum et al., 1991). De plus, certaines bactériocines, telles que, la bactériocine J46 dont l’activité dépendent de la présence d'une force proton motrice sur la membrane pour pouvoir s'y lier (Huot et al., 1996). Le modèle actuel propose que les bactériocines se concentrent à la surface de la membrane avant de s'y insérer en adoptant une structure en forme de tonneau. Il résulte généralement de la formation des pores une perte du potentiel de membrane ainsi qu'une perte du gradient de pH, les deux facteurs responsables de la force proton motrice. En plus, les lipides anioniques de la membrane cytoplasmique sont les récepteurs primaires de la bactériocine des bactéries lactiques pour initier la formation des pores (Abee 1995; Moll et al., 1999). La conductivité et la stabilité des pores induits par les lantibiotiques, peuvent être surélevés en fixant des molécules membranaires (lipide II, le précurseur du peptidoglycan). Dans le cas des bactériocines de la classe II, apparemment, les récepteurs dans la membrane cible agissent pour déterminer la spécificité (Venema et al., 1995b;

1995c). Les bactériocine de la classe I, peuvent induire la formation de pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (Figure 6-A), et celles de la classe II, peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de pores en barils (Figure 6-B, Figure 7) ou par un mécanisme de moquette par lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la membrane et interagit avec la structure de la membrane (Moll et al., 1999).

Pour la nisine par exemple, les pores peuvent atteindre une dimension de 1,2 nm. La présence de ces pores induit la perte de plusieurs composés de faible poids moléculaire (ions, acides aminés et ATP) qui vont quitter l'intérieur de la cellule. La perte d'ions est ainsi responsable de la déstabilisation du potentiel de membrane, de la perte d'ATP et du gradient de pH. La disparition de la force proton motrice et l'inhibition de la synthèse de macromolécules provoquent la mort de la cellule sensible après 20-30 minutes de contacte (DeVuyst et Vandamme, 1994).

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Figure 6. Montre l’action des bactériocine de la classe I qui peuvent induire la formation de pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (A) et celles de la classe II, qui peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de pores en barils (B) ou par un mécanisme de moquette par lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la membrane et interagit avec la structure de la membrane (Moll et al., 1999).

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Figure 7. Schéma représentant la structure et le mécanisme d’action des bactériocines de la classe-IIa à travers la perforation de la membrane cellulaire: (a) structure de la bactériocine; (b) possibilité d’interactions avec la surface de la membrane; (c) insertion de la molécule de bactériocine et la formation des pores hydrophiliques.

Gravesen et al., (2002b) ont examiné la résistance de Listeria monocytogenes à la classe II des bactériocines et ont trouvés un rapport avec le site spécifique de reconnaissance. Huit mutants de L. monocytogenes

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résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la pediocine PA-1 et la leucocine A, ont été isolés et étudiés. La mutation trouvée dans toutes les souches mutantes résistantes était dûe à une sous unité d'une enzyme dans un système d’enzyme appartenant à la phospho-transférase phosphoenolpyruvate-dépendant mannose-spécifique régulée par le facteur de transcription spécifique nommé σ54. Il a été interprété que la résistance à ces bactériocines dans L. monocytogenes et autres bactéries gram-positives est fondamentalement en rapport avec ce site commun sans aucun rapport avec la souche, ni le type de bactériocine de la classe IIa, ou les conditions de cette expérience. Il a été suggéré que la mutation à cette sous unité spécifique localisée dans la membrane a changé le site de reconnaissance de la cible des bactériocines de la classe IIa.

La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2 composants, 2 peptides appelés lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants sont nécessaire pour exercer une activité antagoniste complète résultant de la formation de pores ioniques spécifiques dans la membrane de la cellules gram positive cible. McAuliffe et al., (2000) ont démontrés que la lacticine 3147 exige une enzyme de modification séparée pour chacun des prepeptides lac1 et lac2.

Deux autres bactériocines à deux composants connues sont la lacticine F (Abee et al., 1994), la lactococcine G (Nissen-Meyer et al., 1992), et la thermophiline 13 (Marciset et al., 1997).

La première étape d’action dans son adsorption à la membrane cellulaire bactérienne nécessaire dans la rupture de la membrane par la nisine est souvent comparée à un détergent cationique actif en surface. Cela est suivi par une inactivation du groupe sulfhydryl. Bruno et al., (1992) ont démontré que la nisine dissipe complètement la force protonique motrice chez L.

monocytogenes Scott A. D’autres souches de L. monocytogenes ont été trouvées également sensibles à la nisine, en exprimant une réponse similaire à la détérioration du gradient pH et le potentiel membranaire. D’autre bactériocines de la classe I des bactéries lactiques se comportent d’une manière similaire. La carnocine UI49 agit sur la membrane cytoplasmique dans un modèle semblable à la nisine (Stoffels et al., 1994). La perméabilité aux ions ou la formation de canaux dans les membranes cytoplasmiques provoqués par les bactériocines de Lactobacillus acidophilus, a été démontrée en utilisant des

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membranes lipidiques artificielles (Palmeri et al., 1999). L’augmentation de la conductance de la membrane a été détectée et des canaux avec une conductance élémentaire de 68 à 70 mV a été mesurée en appliquant un voltage externe de polarité différente.

La lactocine 27, produite par Lactobacillus helveticus LP27, a été décrite dans les travaux de Upreti et Hinsdill (1975) comme une bactériocine dont l'effet était bactériostatique. Elle a été adsorbée aussi bien par des souches sensibles que par des souches résistantes en inhibant la synthèse des protéines.

Cependant, il y avait un effet remarquable sur l’ADN, la synthèse de l’ARN et l'ATP. Zajdel et al., (1985) trouvez que la lactostrepcine, Las 5, bloque immédiatement la synthèse d'ADN, de l’ARN, et les protéines, mais ces conséquences étaient probablement une réaction secondaire à de multitude ruptures sévère membranaire et perte de composants intracellulaires. Les souches bactériennes sensibles et résistantes adsorbent de la même manière la bactériocine Las 5. Les protoplastes des souches bactériennes sensibles n'ont pas été affectés par Las 5, indiquant ainsi la nécessité les récepteurs membranaires cellulaires pour l'action de la bactériocine.

Andersson (1986) a démontré que les souches gram-négatif résistantes telle que Escherichia coli, Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, et Serratia.

marcescens pourraient être rendus sensible à la bactériocine de Lactobacillus plantarum en transformant les cellules gram-négatif en sphéroplastes. Des travaux subséquents ont montré l’inactivation de bactéries pathogènes à gram- négatif avec les bactériocines de bactéries gram-positives avec l'usage d'agents chélateurs (EDTA), qui diminue les propriétés des barrières fourni par les LPS membranaires externes de ces bactéries gram-négatives (Stevens et al., 1991;

Shefet et al.,1995; Scannell et al., 1997; Helander et al., 1997). Des stress supplémentaires aux bactéries gram-négatives comme une approche à savoir l’application simultanée de plusieurs processus peut rehausser l'efficacité d'une bactériocine. Cutter et Siragusa (1995) ont montré que la nisine (à 2000 IU/ml) était efficace contre les bactéries gram-négatives (E. coli O157:H7 et Salmonella enterolytica serovar typhimurium) quand elle est utilisée avec l’EDTA, le citrate, ou le lactate. Ganzle et al., (1999) ont démontré que la curvacine A et la nisine en combinaison avec un pH bas, une concentration de NaCl supérieure à 5%, ou le propylparabene provoque une augmentation de la

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sensibilité de Salmonella et E. coli envers ces bactériocines. Tel effet est suggérer par de nombreux travaux, la combinaisons de l’action de la bactériocine avec des agents additionnels et d’une manière appropriée qui peut élargir considérablement le spectre d’action de quelques bactériocines des bactéries lactiques contre les bactéries gram négative.

1.8. Production et Modélisation du processus

Dans le but de rendre l’usage commercial des bactériocines économiquement faisable, il est nécessaire d’optimiser le rendement pendant la production.

Dans une étude de production de la nisine, la pediocine PA-1 de Pediococcus acidilactici, la leuconocine Lcm1 par Leuconostoc carnosum, et la sakacine A par Lactobacillus sake Lb 706, Yang et Ray (1994) ont trouvé que dans le milieu de culture, le facteur clé est le maintien d’un pH optimal et l’addition dans le milieu, d’éléments nutritifs spécifiques pour chaque souche ou espèce.

Les conditions favorisant l’obtention d’une concentration élevée de cellules résulte en une augmentation comparable dans la bactériocine libérée représentant ainsi un indice de métabolite primaire. Pour augmenter le rendement et la pureté des bactériocines des bactéries lactiques à partir des fermentations industrielles et avec des frais de production inférieurs, Coventry et al., (1996) ont démontré que la nisine, la pediocin PO2, la brevicine 286, et la piscicoline 126 pourrait être synthétisé en excès dépourvu de protéines de contamination (92 à 99%) en utilisant la diatomite au silicate de calcium et plusieurs agents de désorption comparé aux surnageant de la culture d’origine et aux extraits par le sulfate d'ammonium. Pour réduire les frais de production, On continu à améliorer la vitesse et la production par la méthode de purification de la bactériocine à partir du bouillon de culture (Guyonnet et al., 2000). Carolissen-Mac Kay et al., (1997) ont examiné des protocoles pour purifier des bactériocines des bactéries lactiques. Dans le but d'obtenir des modèles de production qui ont été divisé pour prévoir l’efficacité commerciale de la bactériocine basée sur les informations rassemblées dans les systèmes tests afin d'optimiser les applications des bactériocines.

Blom et al., (1997) ont conçu une méthode pour l’examen simultané de l'effet de facteurs intrinsèques (pH, concentration de la souche indicatrice, agar, huile de soja, et la concentration du NaCl) sur la diffusion et l’efficacité de la

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