Caractérisation technologiques

Cette manipulation a pour but de déterminer par titrage la concentration molaire en ions H3O⁺ dans un échantillon de lait. Cette concentration est exprimée en "degrés Dornic". Le matériel nécessaire est le suivant: un statif avec noix et pince, une fiole conique de 100 mL, une solution de NaOH N/9, une burette de 25 mL, une pipette jaugée de 10 mL et une solution de phénolphtaléine à 1% dans l'éthanol. Remplir la burette de la solution de NaOH N/9 et la fixer au statif. Régler le niveau du liquide à zéro. À l'aide de la pipette de 10 mL, prélever 10 mL de lait et transférer dans la fiole conique de 100 mL. Ajouter 5 gouttes de solution de phénophtaléine et titrer jusqu'à apparition d'une couleur rose persistante. Noter le volume de solution titrante utilisé en dixièmes de millilitres. Nombre de dixièmes de millilitre de NaOH = 1°D

Figure 16. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable.

2.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose):

L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Annexe). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui

fermentent le citrate lancent la réaction entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-72 h d’incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.

2.4.3. Production des composés aromatiques.

La production d’acetoîne est testée sur milieu Clark et Lubs (FIL, 1996). Les souches sont cultivées sur ce milieu ; Après 24h d’incubation, on test par la réaction de Voges-Proskaeur dite réaction de V.P.

Dans un tube à hémolyse, 2ml de cette culture sont transvasés, 0,5 ml de réactif α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5 ml d’une solution de soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP2). On agite soigneusement les tubes et on laisse au repos 5 à 10 min à température ambiante. La production d’acétoîne se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.

2.4.4. Production des enzymes protéolytiques

La recherche de l'activité protéolytique au sein de nos souches lactiques à été conduite par une recherche qualitative et quantitative.

Les souches présumées des bactéries lactiques isolées des différents échantillons de lait ont été cultivées sur milieu MRSL. Les bactéries possédant une activité protéolytique donne des zones clair autour de la colonie. Les

mêmes souches sont cultivées dans du bouillon MRS additionné de caséine.

L'appréciation de l'activité protéolytique se fait par l'apparition d'un coagulum dû à l'hydrolyse de la caséine. On remarque que plus la souche est protéolytique plus le coagulum s'hydrolyse à son tour.

La quantification de l'activité protéolytique à été réalisée par la recherche de la vitesse d'hydrolyse de la caséine en utilisant la méthode de la ninhydrin. Cette méthode se base sur la quantification des groupements -NH2libérés à partir de la caseine.

Le culot cellulaire est obtenu par centrifugation des cultures jeune en milieu MRS des souches retenus (après 18 h d'incubation). Le culot est lavé dans du tampon phosphate (TP) par centrifugation 4000 tr pendant 5 min. Le culot ainsi obtenu est dilué dans 2 ml du TP, cette solution est désignée par CTP.

Une série de tube (6 tubes) pour chaque souche, contenant 5ml de TP à 1% de caséine (le milieu est stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20 min) est ensemencé par 0,2 ml du CTP de la souche à tester. L'incubation se fait à la température de croissance optimale de chaque souche. Une lecture de la densité optique est faite à intervalle de temps.

Après incubation et à intervalle de temps, un tube est retiré de l'incubateur, la culture est centrifugée et le surnagent est récupéré. 0,5 ml du surnageant est prise puis traitée par la solution de la ninhydrin puis chauffée à 85 °C pendant 5 min puis aussitôt refroidie dans de l'eau glacée. La densité optique est lue à une longueur d'onde de 507 nm. La quantité de -NH2libéré est exprimée en meq de leucine libéré dans le milieu (Chekroun et al., 1998).

2.4.5. Production de dextran.

La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence sur milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). Les souches productrices de dextrane sont caractérisées par la formation de colonies larges, visqueuses et gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé d’indentification permetant aussi de différencier entre les leuconostoques productrices et non productrice de dextran.

2.5. Etude des interactions bactériennes

2.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes

Les bactéries lactiques isolées sont testées pour leur activité antagoniste selon deux méthodes.

a- méthode directe

L’activité antimicrobienne de nos souches a été évaluée sur milieu solide selon la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983). Le milieu MRS est ensemencé en touche par nos souches. Après 24 heures d’incubation une couche de gélosé moelle (0,7%) ensemencée par la souche de Lactobacillus curvatus (souche de bactéries lactique sensible aux substances antimicrobiennes et ne produisant pas ces dernières, offerte par le Dr Hammes, laboratoire de hohenhain, Allemagne) est coulée à la surface puis réincubée pour 24 à 48 heures supplémentaire. Les souches présentant une zone claire tout au tour sont considérées comme productrices de substances antimicrobiennes.

b- méthode indirecte

Cette méthode permet de mettre en contacte le surnageant de la souches lactiques productrice de substance antimicrobienne avec la souche test. Les souches précédemment sélectionnées pour leur production de substances antimicrobienne sont concernées par ce test.

Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18 heures. Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le surnagent est conservé. Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et ensemencé par la souche test, des puits sont réalisés avec un emporte pièce et celée par 10 µl de gélose MRS (figure 17). Les puits recevront 100 µl du surnageant de la souche à testée et les boites sont incubée pendant 24 à 48 heures. Les colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme positive.

Figure 17. Les différentes méthodes utilisée pour la recherche de substances antimicrobienne.(a) méthode de la double couche,(b) méthode de diffusion en puits

2.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.

Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos bactéries lactiques, il est impératif de réaliser une série de test.

a- inhibition due au peroxyde d’hydrogène

Pour écarter l’effet du peroxyde d’hydrogène dans l’inhibition de Staphylococcus aureus, les surnagents des cultures des bactéries lactiques sont traités par 1 mg/ml de catalase puis incubée à 37°C pendant 1 heure. Le surnageant est stérilisé par filtration et testé par la méthode des puits sur Staphylococcus aureus.

b- inhibition due à l’acide lactique

L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries lactiques. Afin d’éliminer son effet, les bactéries lactiques sont cultuvées dans du MRS liquide tamponé; ainsi l’acide lactique produit par la souche lactique sera neutralisé et seule la substance antimicrobienne si elle est produite exprime son action sur Staphylococcus aureus.

c- inhibition due aux bactériophages

Avec une pipette Pasteur, on découpe un fragment de gélose dans la zone d’inhibition. Ce fragment est mis en suspension dans 1 ml de milieu contenant 50 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min, puis on prélève 300µl de milieu que l’on ajoute à 7 ml de gélose molle contenant la souche

indicatrice. Le mélange est coulé stérilement dans une boite de Pétri et incubé 48 h à 28°C. La présence de plage de lyse indique la présence de phages.

d- recherche de la nature proteique de la substance antimicrobiene

La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines, nécessitent la recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait aux bactériocines devrait avoir une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de culture de la bactérie lactique productrice est traité par différents types d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1 ml du filtrat de culture est traité par 1 mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à 37°C pendant 1 heure. Le filtrat ainsi traité est stérilisé par filtration sur filtre millipore de 45 µm de diamètre. L’action de ce filtrat est testé par la méthode des puits sur milieu Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure.

e-Effet de la température

Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la température et la conservation de leur activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Le filtrat de culture de la souche lactique productrice est traité par différentes températures (75, 80 et 100°C) puis testé sur Staphylococcus aureus sur milieu gélosé Chapman par la méthode des puits.

2.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques

L’étude des interaction de Staphylococcus aureus et nos souches de bactéries lactiques productrices de substances antimicrobienne à été conduite selon les deux méthodes déjà décrites en haut. Les bactéries lactiques donnant un résultat positif avec la méthode directe sont retenues et tester de nouveau par la méthode indirecte en puits sur gélose Chapman; L’incubation se fait à 37°C pour 24 à 48 heures. L’inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus par nos bactéries lactiques peut être due à la production de peroxyde, à l’acide lactique, aux bactériophage ou à des substances antimicrobiennes produites dans le milieu externe (extracellulaire).

Afin de confirmer la nature antimicrobienne des substances produites, il est impératif d’éliminer l’action des autres facteurs inhibiteurs. Il faut noter que seules les souches inhibant Staphylococcus aureus par la méthode des puits est retenue.