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Les dosages enzymatiques suivants sont réalisés de façon automatisée à l’aide d’une machine : Mascott (Lisabio, Morangis-France). 460 µL de chaque échantillon à doser sont introduits dans des godets déposés sur un portoir. Les réactifs enzymatiques sont aussi placés dans la machine. La pompe de la machine assure le mélange des réactifs enzymatiques et des échantillons dans des cuvettes en plastique où se déroulent les différentes réactions enzymatiques. Une gamme étalon pour chaque type de dosage est préalablement réalisée et enregistrée dans le programme de dosage correspondant. Les différentes concentrations de la molécule dosée (substrat ou produit) sont calculées par rapport à la gamme étalon et directement affichées sur l’écran de la machine.

a- Dosage enzymatique de l’acide L-malique

Principe du dosage

En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD+), l’acide L-malique est oxydé en

oxaloacétate par la L-malate déshydrogénase (L-MDH).

L’équilibre de la réaction est situé du côté du malate. En éliminant l’oxaloacétate du milieu réactionnel, on oriente la réaction (1) dans le sens L-malate oxaloacétate.

En présence du L-glutamate, l’oxaloacétate est transformé en L-aspartate (2) par la glutamate – oxaloacétate-transaminase (GOT).

(1) L-malate + NAD+ oxaloacétate + NADH + H+

(2) oxaloacétate + L-glutamate L-aspartate + α-cétoglutarate

La formation de NADH, H+, mesurée par l’augmentation de l’absorbance à la longueur d’onde de

340 nm, est proportionnelle à la quantité de L-malate consommée.

Composition du kit (Microdom, kit no 110 05 011 00)

Flacon 1 (30 mL) : Tampon en solution.

Flacon 2 (6 mL) : NAD+ en solution.

Flacon 3 (0,8 mL) : Suspension de GOT Flacon 4 (0,8 mL) : Suspension de L-MDH

Reconstitution du monoréactif

Pour 20 mL de réactif de travail : 5 mL du flacon 1 1 mL du flacon 2 0,13 mL du flacon 3 0,13 mL du flacon 4 14 mL d’eau distillée.

Une gamme étalon d’acide L-malique allant de 0 à 6 g/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

b- Dosage enzymatique de l’acide L-Lactique

Principe du dosage

En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD+), l’acide L-Lactique est oxydé en

pyruvate par la L-lactate déshydrogénase (L-LDH). L’équilibre de la réaction se situe du côté du lactate.

En éliminant le pyruvate du milieu réactionnel, on oriente la réaction (1) dans le sens lactate pyruvate.

En présence du L-glutamate, le pyruvate est transformé en L-alanine grâce à la glutamate-pyruvate- transaminase (GPT) (2)

(1) L-lactate + NAD+ pyruvate + NADH, H+

(2) pyruvate + L-glutamate L-alanine + α-cétoglutarate

La formation de NADH, H+, mesurée par l’augmentation de l’absorbance à la longueur d’onde de

340 nm, est proportionnelle à la quantité de L-lactate consommée.

Composition du kit (Microdom, kit no 110 05 020 00)

Flacon 1 : Tampon Flacon 2 : GPT lyophilisé

Flacon 3 : Suspension de L-LDH

Ce monoréactif se conserve 3 jours à 4/6°C.

Reconstitution des réactifs

Dissoudre 3 flacons de GPT lyophilisé avec 2 mL de tampon chacun et puis les mélanger Ajouter 60 µL de L-LDH

Ajouter 12 mL d’eau déminéralisée Durée de conservation : 3 jours.

Une gamme étalon d’acide L-lactique allant de 0 à 4 g/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

c- Dosage enzymatique de l’acide D-Lactique

Principe du dosage

En présence de D-lactate déshydrogénase (D-LDH), l’acide D-lactique est oxydé en pyruvate par la

nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD+).

(1) D-lactate + NAD+ pyruvate + NADH, H+

L’équilibre de la réaction (1) se situe du côté du D-lactate. En présence du L-glutamate, le pyruvate est transformé en L-alanine (2) par la glutamate-pyruvate-transaminase (GPT). On oriente la

réaction (1) dans le sens lactate pyruvate et NADH, H+.

(2) pyruvate + L-glutamate L-alanine + α-cétoglutarate

La quantité de NADH, H+ formée au cours de la réaction (1), est proportionnelle à la quantité

d’acide D-lactique. L’augmentation de l’absorbance est mesurée à la longueur d’onde de 340 nm.

Composition du kit (Microdom kit no 110 05 025 00)

Flacon 1 : Tampon Good (100 mL)

Flacon 2 : Solution Blanc Echantillon (100 mL) Flacon 3 : lyophilisat (NADP/ATP) (5x Flacon 3)

Flacon 4 : Suspension de D-lactate-déshydrogénase (2,5 mL) Flacon 5 : solution standard d’acide D-lactique (0,6 g/L ; 10 mL)

Reconstitution du réactif

Dissoudre un flacon de lyophilisat (NADP/ATP) dans 20 mL de tampon Good. Agiter délicatement jusqu'à dissolution complète (stabilité : 1 semaine entre 4 et 8 °C).

Pour la préparation de 44 mL de monoréactif, mélanger :

- 20 mL de (NADP/ATP)

- 0,5 mL de D-LDH

- 20 mL de solution blanc échantillon

- 3,5 mL d’eau distillée

Une gamme étalon d’acide D-lactique allant de 0 à 0,6 g/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

d-Dosage enzymatique de l’azote ammoniacal

Principe du dosage

En présence de glutamate déshydrogénase (GIDH) et de nicotinamide-adénine-dinucléotide

(NADH, H+), l’azote ammoniacal est transformé en L-glutamate par le 2-oxoglutarate qui oxyde la

NADH, H+.

2-oxiglutamate + NADH, H+ + NH4+ L-glutamate + NAD+ + H2O

La détermination est basée sur la formation de NAD+. La diminution de l’absorbance est mesurée à

la longueur d’onde de 340 nm. La quantité de NADH, H+ oxydée en NAD+ au cours de la réaction

est proportionnelle à la quantité d’ammoniaque (azote ammoniacal).

Composition du kit (Microdom no 110 05 037 00)

2 flacons contenant chacun 50 mL de diluant du chromogène.

1 flacon contenant 2,7 mL de chromogène (NADH, H+).

2 flacons contenant chacun 50 mL de solution de blanc échantillon. 1 flacon contenant 5,5 mL de starter (glutamate déshydrogénase)

1 flacon de 10 mL d’une solution étalon de 50 mg/L d’azote ammoniacal.

Reconstitution du monoréactif

Pour un volume réactionnel de 21 mL :

- 0,25 mL de chromogène

- 10 mL de diluant chromogène

- 10 mL de solution blanc échantillon

- 0,5 mL de starter

Une gamme étalon d’azote ammoniacal allant de 0 à 50 mg/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

e-Dosage de l’azote alpha-aminé

Principe du dosage

En présence de o-phtaldialdéhyde/N-acétyl-L-cystéine (OPA/NAC), les groupements d’acides aminés primaires réagissent pour former des dérivés d’isoindole, stables à la longueur d’onde de 340 nm.

Composition du kit (Microdom kit no 110 10 110 00)

Flacon 1 : Tampon soude + acide borique + NAC (25 mL) Flacon 2 : solution hydro-alcoolique d’OPA (20 mL) Flacon 3 : NAC (5 microtubes)

Reconstitution des réactifs de travail

Réactif 1 : 25 mL R1 + 1 microtube

Réactif 2 : réactif prêt à l’emploi

Une gamme étalon d’azote alpha-aminé allant de 0 à 80 mg/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

Conservation deux semaines entre 4 et 8°C

(Conservation 1 semaine a 4°C)

f-Dosage enzymatique de l’acide acétique

Principe du dosage

L’acide acétique est converti en acétyle-CoA en présence de l’acétyle-CoA synthétase (ACS), de l’adénosine-5’-triphosphate (ATP) et du coenzyme A (CoA) (1).

(1) Acétate + ATP + CoA acétyle-CoA + AMP2 + pyrophosphate

L’acétyle-CoA réagit avec l’oxaloacétate pour donner du citrate en présence de la citrate synthase (CS) (2).

(2) Acétyle-CoA + oxaloacétate + H2O citrate + CoA

L’oxaloacétate requis pour la réaction (2) est formé à partir du L-malate et du nicotinamide-

adénine-dinucléotide (NAD+) en présence de la L-malate déshydrogénase (L-MDH) (3). Dans cette

réaction le NAD+ est réduit en NADH, H+.

(3) L-malate + NAD+ oxaloacétate + NADH, H+

Le dosage est basé sur la formation de NADH, H+ mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340

nm et qui est indirectement proportionnel à la concentration d’acide acétique consommé.

Composition du kit (Boehringer Mannheim kit nO 10 148 261 035)

Flacon 1 : tampon triéthanolamine pH= 8,4, acide L-malique (134 mg), chlorure de magnésium (67 mg) contenus tous dans un volume de 32 mL.

Flacon 2 : 280 mg de lyophilisat contenant : ATP (175 mg), CoA (18 mg), NAD+ (86 mg)

Flacon 3 : 0,4 mL de suspension contenant : L-MDH (1100 U), citrate synthase (270 U) Flacon 4 : 3 flacons de lyophilisat d’acétyle-CoA synthétase de 5 U chacun.

Le contenu du flacon 2 est dissous avec 7 mL d’eau distillée et le contenu du flacon 4 est dissous avec 4 mL d’eau distillée.

Reconstitution des réactifs de travail

Réactif 1 : 10 mL du flacon 1 Réactif 2 : 4 mL du flacon 4 2,3 mL du flacon 2

0,133 mL du flacon 3

Une gamme étalon d’acide acétique allant de 0 à 1 g/L a été préalablement introduite au programme de dosage de cet acide.

g-Dosage enzymatique de l’acide citrique

Principe du dosage

L’acide citrique est transformé en oxaloacétate et acétate dans une réaction catalysée par la citrate- lyase (1).

(1) Citrate oxaloacétate + acétate

En présence de L-malate déshydrogénase (2) et de L-lactate déshydrogénase (3), l’oxaloacétate et son dérivé de décarboxylation, le pyruvate, sont réduits en L-malate et en L-lactate par le nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH).

(2) Oxaloacétate + NADH, H+ L-malate + NAD+

(3) Pyruvate + NADH, H+ L-lactate + NAD+

La quantité de NADH oxydé en NAD+ est proportionnelle au citrate présent dans l’échantillon.

L’oxydation du NADH est mesurée par la diminution de son absorption à la longueur d’onde de 340 nm.

Composition du kit (Microdom nO 110 05 036 00)

Flacon 1 : 72 mL de tampon Tris/L-LDH/L-MDH. Flacon 2 : 8 mL de chromogène (solution NADH)

Flacon 5 : 5 mL d’une solution pour l’enzyme citrate lyase Flacon 6 : 10 mL d’une solution étalon d’acide citrique 0,8 g/L

Reconstitution du monoréactif de travail

1- Reconstitution de la solution de travail chromogène : 18 mL de tampon + 2 mL de

chromogène. Solution stable 2 semaines entre 4 et 8 °C.

2- Solution starter de citrate lyase : 1 flacon de citrate lyase + 1 mL de solution pour citrate

lyase. Solution stable 1 semaine entre 4 et 8 °C ou 4 semaines a -20 °C.

3- Le monoréactif de travail est finalement préparé en mélangeant 1 mL de citrate lyase