a- Traitements thermiques et enzymatiques des milieux préfermentés par les levures
a-1 Traitements thermiques
La sensibilité de l’agent inhibiteur à la chaleur est testée en traitant les milieux préfermentés par les levures de la façon suivante :
- Les milieux préfermentés sont tout d’abord centrifugés et leur surnageant récupéré.
- Le traitement thermique est réalisé pendant 30 minutes dans un bain-marie thermostaté à 100°C ou bien par autoclavage (120°C/20 minutes).
- La concentration d’acide malique est réajustée à 5 g/L et 200 mg/L d’Optired® sont ajoutés.
- Le pH est réajusté à 3,5 à l’aide d’une solution NaOH 10M.
- Les milieux sont filtrés stérilement à travers des filtres de 0,2 µm de seuil de coupure (Elvetec services, Meyzieu-France) et récupérés dans des fioles d’Erlen-meyer stériles.
a-2 Traitements enzymatiques
La sensibilité de l’agent inhibiteur à l’activité protéasique de certains enzymes est testée de la façon suivante :
- Les milieux préfermentés sont tout d’abord centrifugés et leur surnageant récupéré.
- 4 enzymes sont testés : la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine et la protéase XIV. Le pH de chaque milieu doit être réajusté au pH optimal d’activité de chaque enzyme (2 pour la pepsine, 7,6 pour la trypsine, 7,8 pour la chymotrypsine et 7,5 pour la protéase XIV). Pour augmenter le pH, une solution de NaOH 10 M est utilisée, et pour l’abaisser, on utilise une solution d’acide orthophosphorique à 85 %. Ensuite les enzymes sont ajoutés de façon à avoir 10 µg/µ L d’enzyme dans chaque milieu et les milieux sont incubés 1h à 37°C.
- A la fin du traitement enzymatique, la concentration d’acide malique est réajustée à 5 g/L et 200
mg/L d’Optired® sont ajoutés.
- Le pH est réajusté à 3,5 à l’aide d’une solution NaOH 10 M pour le milieu traité avec la pepsine et à l’aide de la solution d’acide orthophosphorique 85 % pour les autres.
Suite à ces traitements thermiques et enzymatiques, les milieux sont inoculés par les bactéries (2 x
106 cellules/mL). Le suivi de la FML et sa comparaison avec celle réalisée dans les milieux
préfermentés non traités nous permettra de voir si les traitements thermiques et enzymatiques vont lever l’inhibition.
b- Méthode des puits (Well plate test)
Principe du test
Ce test consiste à évaluer l’effet inhibiteur du surnageant des milieux préfermentés par les levures sur gélose. Ces surnageants sont introduits dans des puits creusés dans la gélose contenant les bactéries. Les molécules inhibitrices vont diffuser de façon radiale autour des puits et l’inhibition va se manifester par une zone claire autour du puits (le halo d’inhibition) par rapport au fond bactérien dense sur le reste de la boîte. Le diamètre de cette zone est mesuré et constitue notre unité de mesure.
Mode opératoire
Pour réaliser ce test, une culture d’une quinzaine d’heures de la bactérie sensible à l’inhibition est réalisée sur un milieu MRS (cf partie II-1-2 de ce chapitre). D’autre part le milieu gélosé est préparé de la façon suivante :
- 55,3 g/L de MRS
- 12 g/L d’agar
- 5 g/L d’acide malique
Après autoclavage (120°C/15 min), le milieu est refroidi dans un bain-marie thermostaté à 45°C avant d’ajouter la souche de bactérie en question de façon à avoir une D.O initiale de 0,002 qui
correspond à une concentration initiale de 2 x 106 cellules/mL. Le milieu est par la suite coulé dans
les boîtes de Pétri et des puits de 5 mm de diamètre sont coupés dans la gélose (2 puits/boîte). Ces puits sont remplis par 40 µ L du milieu préfermenté par la levure inhibitrice filtrés stérilement à travers des membranes de 0,2 µm de seuil de coupure (Elvetec services, Meyzieu-France) avant utilisation. Un des deux puits est rempli par le milieu non traité et l’autre par le milieu traité (traitement thermique ou enzymatique). Les boîtes sont ensuite incubées pendant approximativement 12h au réfrigérateur à 4°C. Cette étape sert à ralentir la croissance des bactéries laissant le temps à la protéine de diffuser dans la gélose avant l’obtention d’une forte croissance bactérienne. Finalement les boîtes sont incubées 12 h à 30°C.
c- Précipitation différentielle des protéines au sulfate d’ammonium
Principe de cette technique
Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines. Comme chaque protéine est plus ou moins soluble selon sa composition, on peut en séparer plusieurs en fonction de leur tendance à précipiter plus ou moins vite quand on change la force ionique de la solution qui les contient. Une force ionique élevée peut avoir deux effets sur la solubilité : neutraliser certaines charges ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilité, et entraîner une compétition avec les protéines vis-à-vis des molécules d’eau disponibles en solution. Quand la concentration en sel est assez élevée pour priver une protéine des molécules d’eau qui l’hydratent, celle-ci sort de solution et précipite. C’est ce qu’on appelle le phénomène de salting-out.
Les protéines sont pour la plupart précipitées par une teneur en sel assez élevée, mais certaines d’entre elles seront remarquablement résistantes alors que d’autres précipitent très facilement. C’est cette différence de solubilité qui permet de les séparer.
Le sel le plus utilisé en laboratoire pour précipiter les protéines est le sulfate d’ammonium. Sa solubilisation n’affecte pas la température de la solution, il ne dénature pas les protéines et ne coûte pas cher.
Mode opératoire
Les milieux préfermentés par les levures sont tout d’abord centrifugés pour récupérer le surnageant (2000 tours/min, 20 minutes, 4°C). 200 mL de surnageant sont utilisés pour précipiter les protéines au sulfate d’ammonium. Afin d’atteindre un niveau de saturation de 60 % à 0°C, et sachant que dans les milieux préfermentés par les levures, le sulfate d’ammonium résiduel est négligeable, une
quantité de 361 g/L de (NH4)2SO4 doit être ajoutée, soit 72,2 g dans les 200 mL. Le sulfate
d’ammonium est ajouté progressivement pendant 1h avec une agitation continue qui va durer 5h. Cette étape se fait à 4°C.
Ensuite, le milieu est centrifugé à 11000g pendant 30 minutes à 4°C. Le culot de protéines obtenu est resuspendu dans 20 mL de tampon phosphate (M/15, pH=4,8) et notre échantillon est ainsi 10 fois concentré.
d- Ultrafiltration des milieux préfermentés par les levures
Principe de l’ultrafiltration
L’ultrafiltration consiste à fractionner les milieux préfermentés par les levures en séparant leurs différents constituants suivant leur poids moléculaire et ceci grâce à l’utilisation de membranes présentant différents seuils de coupure. Elle entraîne aussi une concentration du rétentat calculée par rapport au volume initial filtré et au volume final retenu par la membrane. Le passage des constituants d’un côté à l’autre de la membrane est obtenu par une différence de pression. L’ultrafiltration est généralement du type tangentiel, c’est-à-dire que le fluide circule parallèlement à la membrane contrairement à la filtration classique qui est dite frontale. La filtration tangentielle permet de limiter l'accumulation de dépôts qui obturent la surface de filtration.
Mode opératoire
Le fractionnement et la concentration des milieux préfermentés par les levures sont réalisés à l’aide de modules d’ultrafiltration (cf figure II-3) munis de membranes présentant différents seuils de coupure. La séparation des constituants de ces milieux suivant leur poids moléculaire se fait grâce à la force tangentielle de centrifugation. Nous avons utilisé deux modules d’ultrafiltration Centricon Plus 70 (Millipore), présentant des seuils de coupure de 5 KDa (UFC 700508) et de 10 KDa (UFC 701008) qui nous ont permis de concentrer les fractions supérieures à 5 et 10 KDa. Le volume initial introduit dans ces modules doit être au maximum de 70 mL. Une première centrifugation se fait à 3500g pendant 45 minutes à froid. Les filtrats inférieurs aux seuils de coupure (5 et 10 KDa) sont ainsi récupérés. Pour récupérer le rétentat (fractions supérieures à 5 et 10 KDa), il faut faire une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions. Le volume final des différents rétentats récupérés est de 350 µL et regroupe les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 5 ou 10 KDa. On a ainsi concentré ces fractions de 200 fois. Leur effet inhibiteur est ensuite testé dans 20 mL du milieu MRS modifié dont la composition a été déjà décrite (cf partie II-1-2 de ce chapitre). Cette étape va entraîner une dilution de ces fractions et elles seront finalement 3,5 fois concentrées. Les bactéries sont ensuite inoculées dans ces milieux et la FML est suivie. L’effet inhibiteur des différentes fractions peptidiques est évalué par rapport à un témoin réalisé dans un milieu MRS modifié mais ne contenant pas les fractions peptidiques.
Centrifugation 3500 g, 45 minutes, 4°C
Figure II-3. Schéma illustrant les différentes étapes de l’ultrafiltration des milieux préfermentés par les levures.
Les fractions inférieures à 5 KDa sont elles aussi testées en les dialysant à travers une membrane de
3,5 KDa de seuil de coupure dans le but d’éliminer toute autre molécule inhibitrice comme le SO2,
les acides gras, l’éthanol, etc… et de ne garder que la fraction peptidique comprise entre 3,5 et 5 KDa. La dialyse par contre ne concentre pas les échantillons comme l’ultrafiltration.
Membrane de filtration (seuil de coupure de 5 ou 10 KDa) Milieu préfermenté par les levures
Centrifugation 3500 g, 45 minutes, 4°C
Milieu filtré : fraction inférieure au seuil de coupure (5 ou 10 KDa)
Récupération du rétentat (350 µL; fraction supérieure à 5 ou 10 KDa) couvercle
e-Dialyse
Principe de la dialyse
La dialyse est un procédé de séparation des différentes molécules en solution à travers une membrane poreuse utilisant le gradient de concentration comme force de séparation des différents constituants.
Mode opératoire
La dialyse est réalisée dans des boudins de dialyse de 3,5 KDa de porosité (Cellu-Sep T1, # 5015- 19, MFP Inc., Texas, Etats-Unis) contre un tampon phosphate (M/15, pH=4,8, V=1L) pendant 18 à 24 h à 4°C sous agitation. Pendant les dix premières heures, le tampon est changé toutes les heures. Avant utilisation, la membrane de dialyse doit être trempée 20 minutes dans de l’eau distillée puis bien rincée. La longueur de la membrane doit être calculée de la façon suivante :
1-Vol/cm de la membrane : 1,15 mL donc pour dialyser 20 mL il faudra une longueur de 17,4 cm. 2-Il faut ajouter 10% en cas d’expansion ou de contraction de l’échantillon
3-Il faut aussi ajouter 4 cm de chacun des deux côtés de la membrane pour les clampes. La longueur utilisée sera de 30 cm.
Pour tester l’effet inhibiteur des fractions dialysées (poids moléculaire compris entre 3,5 et 5 KDa), on ajoute aux 20 mL :
- 55,3 g/L de MRS
- 4 g/L d’acide malique
- 10 % d’éthanol
- pH ajusté à 3,5
Ensuite, les milieux dialysés sont filtrés stérilement à travers des membranes de 0,2 µm de seuil de coupure (Elvetec services, Meyzieu-France) et sont récupérés dans des fioles d’Erlen-meyer stériles. Les bactéries sont ensuite inoculées et la FML suivie. L’effet inhibiteur de la fraction peptidique comprise entre 3,5 et 5 KDa est évalué par rapport à un témoin réalisé dans un milieu MRS modifié ne contenant pas les fractions peptidiques.