MATERIEL ET METHODES
A) Dosage protéique du BDNF : méthode ELISA
Un dosage par la méthode ELISA a été utilisé pour quantifier le BDNF protéique totale dans le sang, la RVL et le NTS des rats.
Prélèvement du sérum : L’animal a été maintenu pour un prélèvement dans la queue (veine
latérale), à l’aide d’une aiguille Terumo relié à un tubage plastique. Les prélèvements (200 µl) ont ensuite été transférés dans des tubes Eppendorf, et conservés à -20°C. Ces prélèvements ont eu lieu avant (D-3), et après (D10 et D30) la procédure de stress.
Extraction protéique dans la RVL et NTS : A la fin de différents protocoles (D10 ou D30), les
RVL et le NTS des rats ont été prélevés rapidement après le sacrifice (prélèvements bilatéral) et conservés à -80°C. Au moment du prélèvement, les structures ont été pesées. Le BDNF a été extrait comme décrit par Szapacs (Szapacs et al. 2004). Pour ces deux structures, 450µL de tampon de lyse (100 mM PIPES, 500 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 0.1% NaN3, 2% BSA, and 2 mM EDTA) contenant des inhibiteurs de protéases (200M MSF, 0.3M aprotinin, and 10M leupeptin), ont été ajouté à chaque échantillon. Ensuite, les tissus ont été broyés par sonication (pulses brefs d’1 sec pendant 15 secondes). Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 16000 g pendant 30 minutes à 4°C, et le surnageant a été récupéré et congelé à -20°C.
Pour le dosage du BDNF dans le sérum et dans ces deux structures, la méthode ELISA a été utilisée. Les échantillons sérique ont été dilués au 1/25ème et les tissus extraits au 1/10ème avec
le kit de dosage du BDNF fourni par Proméga (BDNF Emax® ImmunoAssay System). Les échantillons ont été dosés en duplicata dans des plaques de 96 puits contenant une gamme d’étalonnage.
B) qRT-PCR
Une quantification des ARNm du BDNF, de l’angiotensinogène, des récepteurs 5-HT3A et des récepteurs de l’angiotensine II a aussi été effectuée chez la souris. L’ARNm total a été extrait du NTS, de la RVL et du DMH suivant le protocole d’extraction AmbionTM (KIT TRI Reagent Solution). Un protocole de qRT-PCR (SYBRGGreen) a ensuite été appliqué pour ces dosages. Le gène de référence utilisé est l’ACTB (Actin beta, cytoplasmic 1). Les différents primers utilisés sont référencés dans le tableau ci-dessous.
Tableau 2 : Liste des Primer utilisés pour la qRT-PCR
ARNm Forward primer Reverse primer
5-HT3A 5’ GTGGACTCCTGAGGACTTCGACAA 3’ 5’ AGATGTCAAGGCTACAGGCGGTCA 3’
BDNF 9 5’ AAAACCATAAGGACGCGGAC 3’ 5’ TAGACATGTTTGCGGCATCC
BDNF 4 5’ CTCTGCCTAGATCAAATGGAGCT 3’ 5’ GAAGTGTACAAGTCCGCGTCCTT 3’
BDNF 6 5’ GCTGGCTGTCGCACGGTTCCCATT 3’ 5’ GAAGTGTACAAGTCCGCGTCCTT 3’
ACTB 5’ CCACCATGTACCCAGGCATT 3’ 5’ CGGACTCATCGTACTCCTGC 3’
1°) Extraction des ARNm : les tissus prélevés chez les souris 2 jours après la fin de la défaite sociale (NTS, RVL et DMH) ont été broyés dans 500µl de formol (AmbionTM, KIT TRI Reagent Solution) à l’aide d’un piston. Après ajout de chloroforme et application des centrifugations, nous avons obtenu 3 phases : phase aqueuse transparente (ARN), interphase blanche (ADN) et phase organique rose (protéines). La phase aqueuse contenant les ARN a ensuite été transférée dans un nouveau tube Ependorff. De l’isopropanol y a été ajouté et après centrifugation, le surnageant a été jeté. Le culot a été dissout dans de l’éthanol à 75%. Suite à une nouvelle centrifugation, le surnageant a été jeté et le culot a été dissout dans 30µl d’eau milliQ. Une évaluation de la quantité total d’ARN a été réalisée grâce à un Nanodrope, avant de congeler les échantillons à -80°C.
2°) Réaction de Transcription Inverse (RT) : avant de réaliser la PCR, les ARN de chaque échantillon ont été transcrits en ADN complémentaire (ADNc). Le volume final par tube
d’échantillons de la réaction de RT doit être de 20 µL, avec 14 µL d’ARN (contenant 500 ng d’ARN) dilué dans eau milliQ et 6 µL de mix PCR. Le mix PCR contient 2 µL de RT Buffer, 0.8 µL de dNTP, 2 µL de RT Random, 1µl de RT multiscribe et 0.2 µL d’eau milliQ. Ces tubes ont ensuite été installé dans un thermomixeur et ont entamé le cycle de température suivant : 10 minutes à 25°C, 2 heurs à 37°C et 5 secondes à 85°C. Tout de suite après le dernier palier de température, les échantillons ont été plongés dans la glace pour arrêter la réaction. 80 µL d’eau milliQ ont ensuite été ajoutés par tube pour avoir un volume final de 100 µL par tube.
3°) Réaction de PCR (Figure 19): La PCR a été réalisée dans des plaques de 96 puits. Chaque gène testé sur chaque échantillon a été réalisé en triplicata. Le gène de ménage utilisé a été l’ACTB. 5 µL d’ADNc des échantillons a été introduit dans chaque puits contenant 15µl de mix PCR (eau milliQ : 3.8 µL ; SYBR Green : 10 µL ; Primers à 10 µM : 0.6 µL).
Figure 19 : Représentation d’un cycle de PCR avec les différentes étapes
VI) Histologie
Du bleu de méthylène, qui n’altère pas les paramètres cardiovasculaires par lui-même (Sévoz-Couche et al. 2003), a été ajouté aux substances microinjectées. A la fin du protocole, les rats ont été perfusés de façon intracardiaque avec une solution d’eau physiologique suivie d’une solution de paraformaldéhyde à 4% tamponnée par du phosphate de sodium 0.1M pour obtenir un pH proche de 7,4. Le cerveau fixé a ensuite été prélevé et conservé dans une
solution de sucrose 20% pendant 48h. Puis, des coupes histologiques de 70 µm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un vibratome. Ces coupes sont ensuite colorées à la thionine.
VII) Analyses statistiques
Toutes les valeurs ont été exprimées en moyenne ± SEM (Erreur standard). Les modifications comportementales, physiologiques et cardiovasculaires entre les témoins et les stressés ont été analysées par un test de Student impair pour 2 groupes, et par un test one-way ANOVA lorsque plusieurs groupes devaient être comparés entre eux. Un test two-way ANOVA a été utilisé pour comparer les effets sur ces paramètres du traitement anxiolytique, de l’injection de muscimol dans le DMH, de l’injection de granisetron dans le NTS chez les rats stressés et témoins. Un test two-way ANOVA en mesures répétées a été réalisé pour comparer la prise de poids et l’ensemble des paramètres cardiorespiratoires obtenus en télémétrie des rats stressés et témoins tout au long du protocole. Les résultats ont été considérés comme significatifs à p<0.05, et suivis par un test post-hoc de Bonferroni quand nécessaire. Les analyses ont été faites avec le logiciel Prism 5.04 (Graph Pad Software).