DNA2

Rôle cellulaire

DNA2 est une hélicase/nucléase hautement conservée parmi les eucaryotes uni et pluricellulaires. C’ un facteur essentiel pour la maturation des fragments d’Okazaki, à la maintenance des télomères, à la voie de réparation des cassures double brin de l’ADN, et aurait aussi un rôle mitochondrial (Choe et al., 2002; Masuda-Sasa et al., 2006a; Stewart et al., 2010).

Elle a d’abord été identifiée chez la levure comme facteur de réplication nécessaire à la viabilité et au clivage des flaps ARN/ADN au niveau des fragments d’Okazaki (Budd and Campbell, 1995) ; en effet durant la réplication, les flaps générés par l’action de la polymérase δ sur le brin tardif sont en général traités et dégradés sur le champ par l’endonucléase FEN1 (Bae et al., 2001; Stith et al., 2008). Cependant, les flaps qui échappent à ce clivage deviennent suffisamment longs et sont recouverts par la protéine RPA, les rendant insensibles à l’action de FEN1. DNA2 intervient et dégage alors les protéines RPA, clive les flaps pour prévenir le raccrochage de RPA, et restore l’activité de la nucléase FEN1 (Ayyagari et al., 2003; Bae et al., 2001; Gloor et al., 2012; Stewart et al., 2008). Cette activité nécessite une interaction directe entre DNA2 et RPA.

Au niveau de la réparation des cassures d’ADN double brin chez la levure, DNA2 agit en complexe avec les protéines RPA et SGS1 (homologue de l’hélicase BLM chez les mammifères) pour sectionner les extrémités 5’ au niveau de la cassure double brin de l’ADN. L’activité du complexe génère de longues extrémités 3’ simple brin nécessaires au déclenchement de la recombinaison homologue (Symington and Gautier, 2011). De plus, DNA2 est impliquée dans la prévention de la régression des fourches réplicatives freinées grâce à son activité nucléase (Hu et al., 2012). Enfin, plusieurs études rapportent le rôle de DNA2 dans le développement de divers cancers, en accord avec son rôle dans le maintien de l’intégrité du génome (Jia et al., 2017).

Propriétés enzymatiques

DNA2 est formée d’un domaine OB (oligonucleotide/oligosaccharide-binding) N- terminal suivi d’un domaine endonucléase simple brin et d’un domaine C-terminal hélicase (Figure 19) (Bae and Seo, 2000; Budd et al., 2000). In vitro, DNA2 agit sur des duplexes d’ADN portant une extrémité simple brin. Elle démarre le clivage sur la partie simple brin dans les deux sens 5’-3’ et 3’-5’, et continue jusqu’à environ 5 nucléotides à l’intérieur du duplexe (Bae and Seo, 2000; Cejka et al., 2010; Gloor et al., 2012; Masuda- Sasa et al., 2006a). Les activités ATPase et hélicase de DNA2 sont relativement faibles en comparaison à d’autres hélicases (Bae and Seo, 2000; Masuda-Sasa et al., 2006b). Le domaine hélicase a une polarité 5’-3’ de translocation et pourrait forcer DNA2 à aller dans le sens 5’-3’. Cependant, les mutations affectant l’activité ATPase de DNA2 ont peu d’effet sur le traitement des flaps et des cassures simple brin in vitro. De plus in vivo, des mutations inactivant l’activité ATPase de DNA2 n’ont pas d’impact sur la viabilité de levure, même si certains défauts de croissance sont observés (Budd et al., 2000; Cejka et al., 2010). Ces observations suggèrent que le rôle principal de DNA2 est son activité nucléase.

Structure cristallographique

Les structures cristallographiques disponibles de DNA2 correspondent à la forme recombinante entière de DNA2 de souris exprimée et purifiée à partir de baculovirus, puis cristallisée avec de l’ADP et de l’ADN simple brin (PDB 5EAN) (Figure 19) (Zhou et al., 2015). Dans cette structure les trois domaines principaux sont visibles (OB/ nucléase/ hélicase). La structure globale de la protéine adopte une forme cylindrique, avec un tunnel central à travers lequel l’ADN peut passer.

La base du cylindre est formée du domaine nucléase, qui organise la structure générale. Le domaine OB n’est pas impliqué dans la liaison à l’ADN, qui est positionné avec son extrémité 5’ du côté du domaine hélicase, et son extrémité 3’ du côté du domaine nucléase.

La structure du domaine hélicase de DNA2 correspond à celle d’une hélicase UPF1-

like. Cependant elle présente plus de ressemblances avec le domaine hélicase

d’IGHMBP2 qu’avec celui d’UPF1, en particulier au niveau du repliement de la protrusion 1B (Figure 20). Les auteurs proposent que l’activité catalytique faible du domaine hélicase de DNA2 est due aux contraintes imposées par la présence du domaine nucléase. Dans cette enzyme, le domaine hélicase viendrait plutôt en support au domaine nucléase pour prolonger le site de liaison à l’ADN et augmenter ainsi l’affinité de l’enzyme et la stabilité de sa liaison au substrat. Le domaine hélicase UPF1-like aurait été acquis durant l’évolution comme domaine auxiliaire au domaine nucléase.

Figure 19: structure cristallographique de la nucléase/hélicase DNA2 de souris.

La protéine entière a été cristallisée en présence d’un ADN simple brin et d’ADP (PDB 5EAN). Les domaines RecA1, RecA2, 1B et 1C sont représentés avec le même code couleur qu’UPF1. Les domaines nucléases et hélicase spécifiques de DNA2 sont représentés respectivement en rose et bleu. L’ADN est représenté en noir, et l’ADP en bâtons. La sphère magenta correspond à un ion Ca2+ _{lié au domaine nucléase.}

Figure 20 : alignement des structures des domaines hélicases de DNA2 et d’IGHMBP2.

Dans ces deux structures, les deux protéines recombinantes ont été cristallisées sans acides nucléiques. DNA2 (PDB 5EAW) a été cristallisée avec de l’ADP, alors qu’IGHMBP2 (PDB 4B3F) a été cristallisée avec une molecule de PO4-_{. L’alignement de structures est effectué selon la}

position du domaine RecA1. IGHMBP2 est en gris clair. Les domaines RecA1, RecA2, 1B et 1C sont représentés avec le même code couleur qu’UPF1. Les domaines nucléase et OB ne sont pas représentés pour la clarté de la figure.