Déroulement d’hybrides

L’objectif de ce test est de vérifier la capacité d’une hélicase à séparer un hybride qui présente une extrémité simple brin permettant à l’hélicase de se charger. L’un des deux brins de l’hybride porte un marquage radioactif (P32_{) pour pouvoir suivre la cinétique.}

Les oligonucléotides d’ADN utilisés pour former les hybrides sont synthétisés sur commande (Eurofins). Les oligonucléotides d’ARN sont préparés par transcription in

vitro et purifiés sur gel d’acrylamide/urée.

III.1.1. Préparation des hybrides

III.1.1.a. Marquage radioactif

Afin d’effectuer un marquage radioactif, l’ADN simple brin est kinasé par la PNK, en présence d’ATP radioactif. La PNK échange le phosphate à l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide par le phosphate radioactif γ de l’ATP.

Réaction de phosphorylation Oligo (10 pM)

PNK buffer (buffer A) PNK (Fermentas) P32 γATP H2O 1µL 1,5µL 1µL 3µL 8,5µL Total 15µL

• Incuber le mélange pendant 1 heure à 37ᵒC ;

• Arrêter la réaction par ajout de l µL d’EDTA 0,5 M, et de 40 µL d’eau ;

• Purifier l’oligonucléotide en utilisant une colonne de centrifugation de type G50 ou P6 (GE healthcare) ;

• Ajouter 15 µL de NaAc (3M, pH = 5,2), 80 µL d’eau, et 450 µL d’éthanol absolu pour précipiter l’ADN ;

• Incuber 20 min à -80ᵒC, ou 1h minimum à -20ᵒC ; • Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min a 4ᵒC ; • Laver 2 fois le culot à l’éthanol 70% ;

• Eliminer le surnageant, puis laisser le culot sécher a l’air libre.

III.1.1.b. Hybridation

L’oligonucléotide kinasé et précipité est resuspendu dans le mélange réactionnel suivant :

Réaction d’hybridation Culot

ADN ou ARN simple brin Tampon F100 5X H2O entier 20pmol 3µL qsp Total 15µL

Tampon F100 5X Stock Volume

100mM MES pH6 500mM KAc 0,5mM EDTA 5mM DTT H2O 200mM 5M 500mM 1M - 2,5mL 0,5mL 5µL 25µL 1,97mL Total 5mL

• Pour assurer l’hybridation des deux oligonucléotides, utiliser une machine de PCR pour effectuer un cycle de températures (monter à 94ᵒC puis réduire la température par paliers de 2ᵒC jusqu’à une température de 20ᵒC) ;

• Ajouter au mélange 8 µL d’un tampon de charge natif (25% Ficoll, 0.01% Bleu de bromophénol, 0.01% Xylène cyanol) ;

• Prélever 1 µL du mélange, ajouter de l’eau et du tampon de charge, et incuber 3 min a 95ᵒC pour dénaturer l’échantillon qui servira de contrôle ;

• Charger le mélange principal et l’échantillon sur un gel natif d’acrylamide : bisacrylamide 29 :1 de 6% ;

• Faire migrer à bas voltage (130V) pendant 1h30, dans une pièce froide.

• Exposer le gel sur un écran Kodak, puis scanner l’écran à l’aide d’un Typhoon

PhosphorImager ;

• Imprimer l’image aux dimensions réelles, et la placer derrière le gel pour découper la part de gel correspondant à l’hybride.

• Couper la portion de gel à l’aide d’un scalpel, et placer la bande dans un tube contenant 800 µL de tampon d’élution. Incuber 3h à 18ᵒC en remuant de temps en temps, ou sur la nuit à 4ᵒC sur une roue.

Tampon d’élution à partir du gel Stock Volume 20mM MOPS pH6 300mM NaAc pH5,2 1mM EDTA H2O 100mM 3M 500mM - 1mL 0,5mL 10µL 3,49mL Total 5mL

III.1.1.c. Purification de l’hybride

• Récupérer et partager l’éluât sur 2 tubes ;

• Ajouter 400 µL de phénol chloroforme à chaque tube, sur la glace, sans vortexer ; • Mélanger doucement, puis centrifuger à vitesse maximale pendant 4 min a 4ᵒC ; • Récupérer les surnageants, et ajouter à chacun 1200 µL d’éthanol absolu ;

• Incuber 20 min à -80ᵒC, ou 1h minimum à -20ᵒC ; • Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min a 4ᵒC ; • Laver 2 fois les culots à l’éthanol 70% ;

• Eliminer les surnageants, puis laisser les culots sécher a l’air libre ;

• Resuspendre le premier culot dans 30 µL de tampon F100 1X. collecter et transférer vers le deuxième culot pour le resuspendre ;

• Quantifier 1 µL d’hybride à l’aide d’un compteur à scintillation. Pour ce faire, préparer une gamme étalon du même lot d’ATP radioactif utilisé pour marquer l’hybride (dilutions en série au 1/10, 1/20, 1/100 et 1/200).

III.1.2. Test de déroulement

UPF1 déroule des doubles brins d'acides nucléiques avec une polarité 5’-3’ spécifique. Les hybrides preparés portent une extremité 5’ simple brin qui respecte la polarité de l’hélicase. La capacité des hélicases à dérouler un double brin est évaluée par un test de séparation de double brin "tout ou rien" (all or nothing). Dans ces tests, UPF1 est mélangée à un hybride ARN/ADN ou ADN/ADN portant une extension simple brin 5’ suffisante à charger l’hélicase qui sépare l’hybride en deux simple brins en présence d’ATP. L’un des brins est marqué radioactivement, ce qui permet de suivre la cinétique de la réaction. A des instants t précis, des aliquotes sont prélevés et mélangés à une solution qui arrête la réaction. L’ensemble des aliquotes est ensuite déposé sur un gel d’acrylamide natif, qui permet de visualiser et de quantifier l’avancement de la réaction, les hybrides intacts migrant plus haut que les simples brins dissociés.

Pour quantifier la vitesse de séparation d’un double brin, la réaction est effectuée en conditions « pre-steady state » en utilisant un excès d'enzymes par rapport au substrat, assurant des réactions « single run », c’est-à-dire dans lesquelles une hélicase agit en moyenne une fois sur un substrat avant d’être piégée.

L’activité de la protéine UPF1 recombinante est affectée par des décongélations/recongélations successives. Les aliquotes utilisés dans ces tests sont donc à usage unique. La protéine est aussi sensible à la dilution, qui n’est donc effectuée qu’au dernier moment avant la réaction. La cinétique est déclenchée par ajout d’un mélange équimolaire ATP/MgCl2 dans une réaction contenant l’hybride, l’hélicase, de

l’héparine (mimique de l’ADN, pour attraper l’hélicase), et un oligonucléotide non marqué identique à l’oligonucléotide marqué, pour éviter la réhybridation des hybrides séparés par l’hélicase.

• Préparer deux réactions pour chaque hélicase à tester en mélangeant tous les réactifs sauf l’ATP dans un volume de 27µL de tampon F100 1X ;

• Préparer une solution de démarrage 10X de la cinétique, contenant 20µM d’ATP (ou ADP), 20 µM de MgCl2, et 3 µM d’oligonucléotide piège non marqué.

• Pré-incuber les réactions et solutions de démarrage à 37ᵒC pendant 10 min ; • Prélever un échantillon de 2µL pour le point 0, et mélanger à 8µL de solution

stop (150 mM NaAc, 10 mM EDTA, 0.5% (w/v) SDS, 25% (w/v) Ficoll-400, 0.05% (w/v) xylène cyanole, 0.05% (w/v) bleu de bromophénol) ;

• Induire la réaction en ajoutant 3 µL de la solution de démarrage au mélange réactionnel ;

• A des temps t, prélever un échantillon de 2µL et mélanger rapidement à 8µL de solution d’arrêt. Conserver les échantillons sur la glace jusqu’à la fin de la cinétique ;

• Charger les échantillons sur un gel natif d’acrylamide 19 :1 à 11%, contenant 0,5% de SDS ;

• Migrer à 130V pendant 1h30 dans une pièce froide ;

• Exposer le gel sur un écran Kodak (sur la nuit à -80ᵒC), puis scanner l’écran à l’aide d’un Typhoon PhosphorImager ;

• Quantifier les bandes correspondant aux fractions d’hybrides déroulés/non déroulés à l’aide du logiciel FIJI (ImageJ) ;

• Calculer aux différents temps t les fractions d’hybrides déroulées/non déroulées par les formules suivantes :

F0 = P0 / (R0 + P0)

Ft = (Pt – F0 (Pt + Rt)) / ((1 – F0) (Pt + Rt))

P étant l’intensité des bandes correspondant au produit de la réaction (simple brin après déroulement de l’hybride) et R correspondant à la quantité de substrat non déroulée à un instant t ;

• Les valeurs obtenues sont utilisées pour tracer à l’aide du logiciel Kaleidagraph la courbe d’équation :

y = A(1 – e–kt₎

où A et k représentent l’amplitude et la vitesse de la réaction dans la phase exponentielle.