Détermination de l’effet d’inserts faits de différents matériaux et de tailles de pores différentes pour la prévention de l’adsorption non-

spécifique du 3H-cholestérol sur la membrane.

Le revêtement des inserts n’ayant pas amélioré la présence de résidu radioactif sur la membrane, on s’est tourné vers différents types de matériaux constituant les inserts ainsi que la taille des pores de la membrane afin de déterminer si des inserts en polyester recouvert ou non de collagène ou des inserts en polycarbonate, les deux

types ayant des pores de 0,4 ou 3,0 m amèneraient des avantages pour le système de co-culture.

Les graphiques présentés dans la Figure 11 A et B, p.133 représentent les cpm dans chaque compartiment de la co-culture en DMEM seul ainsi que ceux de l’insert uniquement, respectivement. Le graphique à la Figure 11 A, p.133 montre encore une fois la similitude des cpm dans le lysat de J774 et dans le milieu entre les différentes conditions du système de co-culture sans accepteurs. Les résultats des cpm totaux sur les inserts sont montrés à la Figure 11 B, p.133, où les pourcentages relatifs aux lysats de HepG2 ont été calculés sur le total des cpm recueillis. Les inserts de polyester ayant des pores de 3,0 m représentent les inserts standards généralement utilisés dans notre système de co-culture. Les résidus sur la membrane des différents types d’inserts sont équivalents sauf pour les inserts faits en polyester recouvert d’un revêtement en collagène avec des pores de 0,4 m (Coll. 0,4) où le résidu représente plus de la moitié des cpm totaux pour ces inserts.

Dans la poursuite de notre objectif visant à trouver une condition permettant d’obtenir un différentiel avantageux entre les cpm sur l’insert du système de co- culture entre le sérum complet et le DMEM seul, nous avons établi qu’à première vue, les inserts de polyester 0,4 m (PE 0.4), de polycarbonate 0,4 m (PC 0.4) et 3,0 m (PC 3.0) sont de bons candidats pour atteindre l’objectif fixé puisque ces derniers possèdent les cpm totaux sur l’insert les plus bas, contrairement aux inserts standards (PE 3,0), dont les cpm totaux sont un tant soit peu plus élevés.

Figure 11 : Détermination des effets de différents matériaux et tailles de pores sur l’adsorption du 3H-cholestérol par la membrane de l’insert du système de co-culture.

Lors d’un essai de 24 h dans le système de co-culture avec du DMEM et 2 % HS, différents matériaux tels que le polycarbonate (PC), le polyester sans revêtement (PE) et avec un revêtement au collagène (coll) et tailles de pores de 0,4 ou 3,0 m ont été évalués. Les différents compartiments (A);(C) ainsi que l’insert isolé (B);(D) du système ont été comptés tel que décrit dans les Méthodes pour la condition DMEM et la condition 2 % HS, respectivement. Les chiffres en noir au dessus de la

barre représentent la somme des cpm dans le compartiment insert pour chaque condition. Les chiffres en blanc représentent le pourcentage attribué au lysat des cellules HepG2 par rapport aux comptes totaux.

Les graphiques présentés dans la Figure 11 C et D, p.134 représentent les cpm dans chaque compartiment de la co-culture avec 2 % HS ainsi que ceux de l’insert uniquement. Des cpm équivalents sont notés pour le lysat de J774 et ceux du milieu entre les différentes conditions du système de co-culture avec sérum complet. (Figure 11 C, p.134). Pour le milieu avec 2 % HS, la moyenne des cpm est augmentée de 8 fois par rapport à celle du milieu dépourvu en accepteur. De plus, en termes de la proportion recueillie dans le lysat de HepG2 ainsi que dans le résidu sur la membrane, les inserts PC 3,0 permettent une meilleure récolte du lysat HepG2 et réduisent le résidu membranaire. En termes de cpm totaux recueillis sur les inserts, les inserts Coll 0,4 sont ceux qui obtiennent les plus grands comptes, en grande partie dus à une hausse très grande du résidu sur la membrane. Or, une diminution du résidu sur la membrane est ce qui nous intéresse, ce qui exclut ce type d’insert. Les différentiels entre le système de co-culture avec sérum et celui sans sérum sont de 6 500, 6 600, 9 700 et de 5 800 cpm pour PE 0,4, PE 3,0, PC 0,4 et PC 3,0, respectivement.

Le PC 0,4 semble le choix évident, puisqu’il permet le plus grand différentiel entre le sérum complet et le DMEM seul, cependant il occasionne un résidu membranaire qui double en présence de sérum par rapport au résidu en condition sans accepteurs. Le PC 3,0 semble aussi un choix prometteur pour la co-culture en termes de différentiel entre les systèmes, la proportion de lysat HepG2 obtenu ainsi que le résidu membranaire, mais les caractéristiques physiques du polycarbonate telles qu’une mauvaise transparence et donc visibilité cellulaire au microscope rendent difficile la capacité à évaluer la croissance cellulaire sur la membrane et nous oblige à exclure ces inserts. (Tableau II, p.137) Ce faisant, il ne nous reste que les inserts faits de PE 0,4 et PE 3,0 comme possibilité. Ceux-ci démontrent les meilleurs résultats en termes de visibilité cellulaire ainsi que pour la capacité à évaluer la croissance cellulaire sur ces membranes.

De plus, les cpm des résidus sur ce type de membrane augmentent malgré tout en présence de sérum mais pas exagérément comparativement aux inserts Coll. 0,4. Puisqu’aucune différence majeure n’a été démontrée entre les inserts faits de polyester, les inserts standards soit le PE 3,0 sont conservés pour l’élaboration du système de co-culture pour l’évaluation du TIC.

Tableau II : Observation microscopique de la culture des cellules HepG2 sur des membranes de différents matériaux et tailles de pores.

PE 0,4 PE 3,0 PC 0,4 PC 3,0 Coll. 0,4 Visibilité

cellulaire Moyenne Moyenne Mauvaise Faible Excellente Croissance

cellulaire Bonne Bonne

Impossible à évaluer Impossible à évaluer Formation d’agrégats Densité de pores (pores/cm2)a 4x106 2X106 1x108 2x106 Aucune information a

Adapté du guide d’instructions de Corning. “Transwell® Permeable Supports