Les étapes enzymatiques de conjugaison des résidus SUMO à une protéine cible sont très similaires au processus d'ubiquitination. Cependant, le nombre d’enzymes impliquées dans la sumoylation est très faible, comparé à l’ubiquitination, qui consiste en plusieurs enzyme de conjugaison E2 et de ligase E3. Toutes les protéines SUMO sont exprimées en tant que précurseurs immatures, et doivent subir une activation par clivage des quatre derniers résidus dans son domaine C-terminal, grâce à l'activité hydrolytique des protéases spécifiques de SUMO, connues sous le nom de SENPs (Sentrin-specific Protéases). L’élimination de ce domaine C-terminal expose un motif diglycine « GG », conservé homologue à celui de l'ubiquitine, (figure 37). Dans une réaction ATP-dépendante, le motif « GG » est, ensuite, activé par adénylation, ce qui lui permet de former une liaison thioester, riche en énergie, avec la cystéine catalytique (Cys173) de l'enzyme E1 hétérodimérique, composée des sous-unités SAE1/SAE2 (Small Ubiquitin Like Modifier (SUMO) Activating Enzyme 1/2). Ensuite, SUMO est transféré à la cystéine (Cys93) de l'enzyme de conjugaison E2 UBC9 (Ubiquitin-Conjugating 9, nommée également Ube2I), résultant, à nouveau, en une liaison thioester. Il a été montré que la sumoylation de la sous-unité SAE2 sur la Lys236 altère son interaction avec l'enzyme E2. A l'étape finale, SUMO est transféré au substrat, formant une liaison isopeptidique avec le résidu lysine accepteur, (figure 37).
Bien que les enzymes SUMO E1 et UBC9 se soient révélées suffisantes à la sumoylation des protéines, la conjugaison de SUMO et la sélection des substrats peuvent être améliorées par des SUMO E3 ligases. La plupart des SUMO E3 ligases possèdent un domaine RING, qui interagit avec l’enzyme de conjugaison UBC9 et induit un changement conformationnel, qui facilite le transfert de SUMO au substrat (Chymkowitch et al., 2015; Pichler et al., 2017).
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Figure 37 : Représentation schématique des étapes du cycle de sumoylation (Kumar and Zhang,
2015).
2.1- Sélection des sites cibles accepteurs de sumoylation
Deux éléments prérequis déterminent la possibilité d’une protéine à être sumoylée. Soit la protéine est capable d'interagir, directement, avec UBC9, soit elle est reconnue par une E3 ligase, spécifique, pour être amenée à proximité directe d'UBC9. Dans les deux cas, un résidu lysine accepteur doit avoir accès à la liaison thioester UBC9-SUMO. Actuellement, 3 mécanismes distincts permettent de déterminer la lysine à sélectionner, (figure 38) :
• Le site lysine accepteur est intégré dans un motif « ΨKxE » où Ψ et x signifient respectivement, un acide aminé hydrophobe et n'importe quel acide aminé, qui est, directement, reconnu par UBC9. Plusieurs variations de cette séquence consensus ont été identifiées, et peuvent être reconnues par UBC9, tel qu’un motif consensus inversé, hydrophobe ou dépendant de la phosphorylation (tableau 2).
• SUMO peut se lier de façon non covalente aux protéines cibles à l’aide d’un motif SIM, caractérisé par la présence d'un noyau hydrophobe et, dans certains cas, par un groupe de résidus acides d’acides aminés. La protéine cible, par son SIM, recrute le complexe UBC9-SUMO, permettant à UBC9 d’assurer la conjugaison SUMO des résidus lysine adjacents, en l'absence d’un motif consensus (Hecker et al., 2006).
• Enfin, les SUMO E3 ligases se lient, directement, à la cible et assurent le transfert de SUMO au résidu lysine accepteur, via UBC9 (Flotho and Melchior, 2013).
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Tableau 2 : Les motifs consensus des sites accepteurs SUMO (Flotho and Melchior, 2013).
Figure 38 : Les mécanismes de reconnaissance des sites lysines accepteurs de SUMO. (a) Par un
motif SUMO consensus, (b) par interaction avec un SIM, (c) par interaction avec une E3 ligase (Flotho and Melchior, 2013).
2.2- L’enzyme de conjugaison E2
UBC9 est une protéine ubiquitaire d’environ 17 kDa (environ 158 acide aminés), principalement exprimée dans le noyau et le complexe des pores nucléaires, mais aussi autour de l'enveloppe nucléaire, dans le cytoplasme et dans la membrane cellulaire (Varadaraj et al., 2014). Des expériences de ChIP ont montré qu’UBC9 lie la chromatine, avec un enrichissement spécifique, aux régions d’hétérochromatine (Shin et al., 2005). Par des expérience de mutagenèse, il a été démontré, qu’en plus du site catalytique en Cys93, qui est nécessaire au transfert de SUMO de l’enzyme E1 vers UBC9, et de cette dernière à la protéine substrat, la tyrosine Y134 joue, également, un rôle dans ce transfert (Alontaga et al., 2016). UBC9 est régulée positivement dans les tissus néoplasiques, ce qui fait d’elle un biomarqueur du cancer et une cible thérapeutique potentielle (Mattoscio and Chiocca, 2015). L’activité d’UBC9 est modulée par modification post-traductionnelles telle que la phosphorylation de la Ser71 et Thr35, qui semble promouvoir la liaison thioester UBC9-SUMO, conduisant à une meilleure
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capacité de conjugaison. La sumoylation de la K14 modifie les cibles préférentielles d’UBC9. De plus, l’acétylation d’UBC9 sur K65 en présence d'inhibiteurs de SIRT1 (sirtinol), réduit, préférentiellement, la sumoylation des protéines substrats à motif consensus chargé négativement (NDSM). Les autres substrats restent inchangés (Pichler et al., 2017).
2.3- Les SUMO E3 ligases
Un certain nombre de SUMO E3 ligases ont été décrites et classées en groupes. Les membres du premier groupe ont un domaine SP (Siz/PIAS) RING interne, similaire à celui trouvé dans les ubiquitines E3 ligases. Ces E3 ligases favorisent la modification par SUMO, en stabilisant l'interaction de la cible avec l'E2 chargée, l’amenant à proximité de la lysine cible. Les ligases de ce groupe englobent les protéines de la famille PIAS (Protein Inhibitor of Activated STAT) (PIAS1, PIAS3, PIASxα, PIASxβ et PIASy) et Mms21.
La nucléoporine RanBP2 représente le seul membre du deuxième groupe des SUMO E3 ligases. RanBP2 se lie à UBC9 et assure la sumoylation de Sp100 et HDAC4 par SUMO-1 et PML (Promyelocytic Leukemia protein) avec SUMO-2. L'activité SUMO ligase de RanBP2 réside dans un domaine répété interne, qui est engagé dans un complexe fonctionnel avec RanGAP1 sumoylé et UBC9. Ce complexe se localise au pore nucléaire, pendant l'interphase, où il peut sumoyler des protéines substrats au cours de l'import nucléaire.
Le troisième groupe comprend les E3 ligases, dépourvues du domaine RING, telles que Pc2 (Polycomb 2 homolog, aussi nommé CBX4 (Chromobox protein homolog 4)), qui contribue, également, à la sumoylation aux sites de lésions du DNA, d’HDAC4-5-7, TOPORS (Topoisomerase I-binding RING finger protein) et RHES (Ras Homolog Enriched in Striatum). De plus, des membres de la famille TRIM ont été, récemment, décrits comme un quatrième groupe de SUMO E3 ligases, nécessitant, à la fois, un domaine RING et B-box (domaines de liaison au zinc), pour stimuler la conjugaison de SUMO aux protéines cibles (pour revue (Mattoscio and Chiocca, 2015; Pichler et al., 2017)).
2.4- Les SUMO protéases
La sumoylation est un processus réversible, régi par des protéases spécifiques appartenant à la famille SENP, qui clivent la liaison isopeptidique entre la glycine C-terminale de SUMO et la lysine de la protéine substrat, libérant ainsi la protéine SUMO afin de permettre son recyclage. Six isoformes de SENP (SENP1, 2, 3, 5, 6 et 7) ont été identifiés chez les mammifères. Ces six SENPs peuvent être divisés en trois sous-familles, basées sur leur homologie de séquence, la spécificité du substrat et la localisation cellulaire. SENP1 et SENP2 constituent la première famille qui a une large spécificité pour SUMO-1/2/3. SENP3 et SENP5 forment la deuxième
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famille, SENP6 et SENP7 la troisième. Misses à part SENP1 et SENP2, toutes les autres SENP préfèrent la déconjugaison de SUMO-2/3 à SUMO-1 (Kumar and Zhang, 2015).
SENP1, SENP6 et SENP7 sont localisées dans le nucléoplasme, tandis que SENP3 et SENP5 sont confinées aux nucléoles. Bien que SENP2 soit localisée dans le complexe des pores nucléaires, avec SENP1, elles possèdent un signal d'export et import nucléaire pour faciliter leur entrée et sortie du noyau. Alors que les six isoformes possèdent toutes une activité isopeptidase, seules SENP1, SENP2 et SENP5 peuvent effectuer la maturation protéolytique des précurseurs SUMO (Matunis and Rodriguez, 2016) (tableau 3 et figure 39).
Tableau 3 : Propriétés biologiques et structurales des isoformes SENPs (Kumar and Zhang, 2015).
Les SENPs partagent un domaine cystéine protéase catalytique, conservé en C-terminal (environ 200 acides aminées), qui a la triade catalytique typique (histidine-acide aspartique-cystéine). Le domaine N-terminal est quant à lui peu conservé, il est impliqué dans la régulation de la localisation des différents isoformes de SENPs, il est sujet à des modifications par phosphorylation ou ubiquitination, susceptibles d'affecter la stabilité des SENPs. Ce domaine N-terminal contient, également, un ou plusieurs SIM, qui contribuent à la reconnaissance des substrats sumoylés (Hickey et al., 2012).
Les niveaux de SUMO protéases varient en réponse à un certain nombre de stimuli. SENP1 est surexprimé dans le cancer de la prostate, mais son activité est inhibée dans des conditions de stress oxydatif. Inversement, des niveaux accrus de ROS stabilisent SENP3, et bloque son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. Enfin, il est, également, rapporté que SENP2 est régulée par ubiquitination et dégradation par le protéasome (Flotho and Melchior, 2013). D’autres classes de SUMO protéases, nommées DeSI1/2 (Desumoylating isopeptidase) et USPL1 (Ubiquitin-specific protease-like 1), ont été identifiées. DeSI1/2 sont localisées dans le
SENP isoform Specificity Subcellular
localization Enzymatic activity Amino acid residues
643 Catalytic domain (419–643) 589 Catalytic domain (365–589) 574 Catalytic domain (353–574) 755 Catalytic domain (567–755) 1112 Catalytic domain (637–1112) 984 Catalytic domain (662–984) SENP6 SUMO-2/3 Nucleoplasm Isopeptidase
SENP7 SUMO-2/3 Nucleoplasm Isopeptidase SENP3 SUMO-2/3 Nucleolus Isopeptidase
SENP5 SUMO-2/3 Nucleolus Precursor processing, isopeptidase SENP1 SUMO-1/2/3 Nucleoplasm Precursor processing,
isopeptidase SENP2 SUMO-1/2/3 Nuclear pore Precursor processing,
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noyau et le cytoplasme, tandis qu’USPL1 est retrouvé dans le noyau. Contrairement aux SENPs, DeSI reconnaît un ensemble limité de cibles. Le répresseur transcriptionnel BZEL (BTB-ZF Protein Expressed In Effector Lymphocytes) est reconnu comme le seul substrat connu de DeSI qui est capable de dé-conjuguer à la fois SUMO1 et SUMO2/3 de BZEL. USPL1 interagit, spécifiquement, avec les 3 résidus SUMO, mais préfère SUMO2/3. La déplétion de l'expression d’USPL1 ne provoque pas de changement détectable dans le profil global de sumoylation, ce qui suggère un nombre limité de cibles (Hickey et al., 2012).
Figure 39 : Les Activités de sumoylation et désumoylation des SENPs. Les SENPs possèdent une
activité d'endopeptidase permettant d’effectuer la maturation protéolytique au niveau du précurseur SUMO en C-terminal, pour exposer les deux résidus glycine. Les SENPs possèdent, également, une activité isopeptidase pour libérer SUMO conjugué aux protéines substrats (Kumar and Zhang, 2015).