Colocalisation, assistance, coopération et collaboration

A tetrazina é uma molécula que consiste num anel aromático de seis membros contendo quatro átomos de azoto. A sua síntese tem vindo a ser reportada desde o século XIX, sendo a mais comum a reacção equimolar entre a hidrazina e um benzonitrilo, com posterior oxidação. As tetrazinas e seus derivados reagem rapidamente com uma série de compostos insaturados através de uma cicloadição Diels-Alder [4+2] que forma um intermediário não observável e, posteriormente através de um passo irreversível de Diels-Alder inversa (iEDDA, do inglês, inverse-electron- demand Diels-Alder) liberta uma mole de N2 dando origem ao produto final.116,117

A cicloadição de Diels-Alder é uma transformação altamente selectiva e mais rápida em meio aquoso do que em solventes orgânicos devido ao efeito hidrofóbico. Este tipo de cicloadição têm vindo a ser vastamente utilizada em reacções de bioconjugação, nomeadamente na marcação de biomoléculas funcionalizadas com o trans-cicloocteno (TCO), que reagem depois com tetrazinas adicionadas ao meio.102,106,116-120

Mecanisticamente (Esquema 1.6.), a tetrazina reage com o dienófilo através de uma cicloadição [4+2] formando um aducto que rapidamente se forma na correspondente 4,5- dihidropiridazina através de uma iEDDA, libertando uma mole de azoto. De seguida, dá-se uma isomerização 1,3-prototrópica que forma o isómero final. Na iEDDA a HOMO do dienófilo reage com a LUMO do dieno, ou seja, a orbital π* do dieno que é deficiente em electrões (tetrazina) sobrepõe-se com a orbital π ocupada mais energética do dienófilo.116,117

Esquema 1.6 - Esquema geral de uma reacção de iEDDA entre uma tetrazina e um alceno com libertação de azoto molecular e posterior oxidação.

A reacção de iEDDA nas ligações da tetrazina com compostos insaturados pode ser seguida espectroscopicamente observando o desaparecimento de uma banda bem visível entre os 510 e 550 nm e apresenta duas grandes vantagens para a marcação de biomoléculas, comparativamente com as reacções biortogonais enumeradas anteriormente: i) não necessita de catalisadores metálicos (tóxico para as células) e ii) as cinéticas desta reacção são claramente superiores a todas as outras reacções biortogonais (Tabela 1.3.).116,121

Tipo de Reacção k (M-1_s-1₎ Condições

3,6-di(2-piridilo)-tetrazina+TCO 2000 MeOH:H2O (9:1) Tetrazina+norborneno 1,9 PBS aq. Tetrazina+TCO 6000 PBS aq. 12700 Dioxano Tetrazina+Oxanobornadieno 0,00087 PBS aq. Tetrazina+Cis-cicloocteno 0,03 Dioxano

Como se pôde perceber, as limitações cinéticas das reacções biortogonais têm sido uma preocupação geral. Tal facto, fez com que fossem exploradas outro tipo de reacções como é o exemplo da iEDDA que ao reagir rapidamente pode ser facilmente utilizada em condições biológicas na presença de grupos funcionais biológicos. Devido à sua cinética rápida, a ligação de tetrazina pode ser bastante útil nos casos em que reacções rápidas são necessárias para localizar biomoléculas pouco abundantes.

1.4.3 “Turn-On Probe” – fluoróforo BODIPY-FL

Para o seguimento em tempo real da marcação de biomoléculas em sistemas biológicos vivos, a construção de uma sonda fluorescente tem pré-requisitos muitos específicos. A sua síntese deve ser livre de catalisadores metálicos, a sua cinética de acoplamento deve ser rápida e tem que ter um fluoróforo.120

Um fluoróforo é um composto químico fluorescente que tem na sua estrutura grupos aromáticos ou partes planas ou cíclicas com várias ligações π. A sua característica particular é a fluorescência, onde a molécula absorve energia a um comprimento de onda específico e posteriormente emitirá essa energia noutro comprimento de onda maior (menor energia).122 _O

processo de fluorescência inicia-se quando uma molécula, no estado fundamental (S0), absorve a

energia de um fotão, o que faz com que os electrões se desloquem para orbitais de maior energia, passando para o estado excitado (S1). O electrão pode voltar ao estado fundamental, havendo

libertação da energia em excesso, com emissão de fotões (por exemplo, fluorescência) ou de maneira não-radiactiva.123

Quando se escolhe um fluoróforo para fazer parte de uma sonda fluorescente a introduzir num sistema biológico, existem vários aspectos a ter em conta, nomeadamente: a absorção máxima (λmax) e a emissão máxima (λem), que representam o pico máximo no espectro de absorção e

emissão, respectivamente. O comprimento de onda da λem é maior que o λmax, devido à perda de

energia na reorganização do solvente ou outros processos. A diferença entre o λem e o λmax é

designado de desvio de Stokes. Outro parâmetro importante num fluoróforo é o coeficiente de extinção molar (ε), que correlaciona a quantidade de luz absorvida, num dado comprimento de onda, com a concentração do fluoróforo em solução.124

Fluoróforos com pequenos valores de desvios de Stokes são susceptíveis de se autoextinguirem (quenching) por transferência de energia, o que limita o número de espécies que se podem acoplar à biomolécula. O tempo em que a molécula está no estado excitado (τ) e a razão dos fotões de fluorescência com os absorvidos (φ) são parâmetros essênciais num fluoróforo, pois são importantes na comparação de diferentes moléculas fluorescentes. O brilho de um fluoróforo (ε x φ) inclui a quantidade de luz absorvida e a razão da eficiência do fluoróforo e, portanto, na comparação de diferentes sondas estes dados devem ser considerados. Na Figura 1.15. estão representados alguns dos fluoróforos mais usados.124

Figura 1.15 - Fluoróforos mais comuns. No eixo horizontal está representado o comprimento de onda máximo de absorção e no eixo vertical está o brilho. Circundado a vermelho está o fluoróforo sintetizado neste trabalho. Imagem adaptada da referência 123

Recentemente, o BODIPY-FL (104), representado na figura, têm sido reportado como um dos fluoróforos mais promissores e utilizados na marcação de biomoléculas no interior de sistemas biológicos.124 _{As suas características neutras e lipofílicas revelam vantagens para esta aplicação,}

em relação a outros fluoróforos. O BODIPY-FL é um composto tricíclico fluoro-borado com características espectroscópicas particulares, tais como: i) apresenta um pequeno desvio de Stokes;

ii) tem uma λmax de 505nm e λem de 512 nm; iii) um ε = 9,1x104 M-1cm-1 e iv) um φ de 0,94 em

meio aquoso (meio fisiológico).

Relativamente à sonda, o BODIPY-FL, ao reagir com a tetrazina (quencher) o seu rendimento quantitativo (φ) cai, diminuindo assim, a sua fluorescência inicial. No entanto, após reacção biortogonal com o TCO (constantes cinéticas elvadas) é recuperada a fluorescência da sonda (daí o nome, “turn-on” probe). Este tipo de sondas têm vido a ser reportadas como métodos inovadores no seguimento de processos bioquímicos intracelulares, pois não necessitam de catalisadores metálicos na sua estrutura (menor toxicidade), apresentam cinéticas de reacção rápidas, permitindo

Figura 1.16 - Representação de uma bioconjugação por afinidade fotoquímica. O alvo (laranja) reage com o GFT a amarelo (pex. benzofenona, azida ou diazirina, respectivamente) que pode, ou não, ser ajudado por um repórter químico e um fluoróforo via biortogonal. Imagem adaptada da referência 124

uma imagiologia eficiente e resolução temporal rápida e é altamente fluorescente, o que maximiza o sinal da imagem e minimiza o sinal de fundo em aplicações in vivo.120