Cellules endothéliales spécialisées à partir des CSPh

Les protocoles de différenciation endothéliale décrits ci-dessus permettent la génération de CE à partir de CSPh (CE-CSPh) dont les capacités angiogéniques ont été validées in vitro et in vivo, généralement dans des modèles murins, d'ischémie de la rétine ou des membres inférieurs, afin de confirmer leur potentiel thérapeutique. Cependant, outre leur application en thérapie cellulaire, les CE-CSPh sont nécessaires à l'établissement de modèles in vitro de tissus et d'organes vascularisés qui recapitulent la complexité des organes humains, permettant l'étude du développement embryonnaire, des pathologies humaines ou le développement de nouveaux médicaments. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, l'endothélium hémogénique, progéniteur des cellules hématopoïétiques, a été différencié in vitro à partir des CSPh et est devenu crucial pour l'étude du développement embryonnaire des cellules hématopoïétiques (Choi et al., 2012; Ditadi et al., 2015; Kennedy et al., 2012). De plus, plusieurs équipes se sont investies dans la génération des sous-types de CE à partir CE-CSPh. Ditadi et al. ont démontré, grâce aux analyses transcriptomiques, que les populations endothéliales générées à partir de CSPh sont hétérogènes et englobent des cellules artérielles et veineuses qui peuvent être identifiées selon le phénotype CD34+CD73medCD184+ et CD34+CD73+CD184-, respectivement (Ditadi et al., 2015). D’autres équipes ont mis en évidence que la

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modulation de la dose de VEGF-A est suffisante pour induire la différenciation des progéniteurs

endothéliaux en CE artérielles ou veineuses (Rosa et al., 2019; Rufaihah et al., 2013). Les cellules obtenues par ces protocoles, en plus de réguler l’expression des marqueurs artériels et veineux, ont développé des fonctionnalités différentes selon leur phénotype. Ainsi par exemple, les cellules Figure 24. Différenciation des CSPh en CE spécialisées. Schémas représentatifs de la différenciation des CSPh en cellules artérielles, veineuses, lymphatiques (LEC) et sinusoïdales du foie (LSEC) et les cytokines et molécules employées pour leur spécification.

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artérielles ont une morphologie plus allongée sous flux et produisent des niveaux de NO plus élevés par rapport aux cellules veineuses (Rosa et al., 2019). Des résultats similaires ont été obtenus par Sriram et al. qui ont différencié des progéniteurs endothéliaux en cellules artérielles en présence d’EGF (de l’anglais « epidermal growth factor »), FGF-2 et VEGF et en cellules veineuses seulement avec EGF et bFGF (Sriram et al., 2015) (

Figure 24

). L’injection de ces cellules intégrées dans des gels de Matrigel chez des souris immunodéprimées, a montré que ces cellules sont capables de former des nouveaux vaisseaux in vivo en maintenant leur phénotype (artériel ou veineux) (Sriram et al., 2015). D'autre part, Zhang et al. ont démontré que la spécification artérielle guidée par les inhibiteurs du TFG-β et de l'inositol monophosphatase en conjonction avec le resvératrol, le FGF2 et le VEGF-A donnent lieu à une population de CE coronaires ayant une fonctionnalité similaire à celle des CE artérielles coronaires primaires en termes de consommation d'oxygène, d'adhésion des leucocytes, de production de NO et de réponse à la force de cisaillement. Ces cellules ont amélioré aussi la survie des souris atteintes d’un infarctus de myocarde (Zhang et al., 2017).

La différenciation des CE lymphatiques a été moins explorée jusqu'à présent à partir des CSPh. Cependant, Lee et al. ont montré que les CSPh peuvent se différencier en ce type endothélial par la formation d'EB, la coculture avec OP9 ou en culture adhérente sans cellules nourricières, bien que dans ces dernières conditions, la différenciation soit moins efficace et les CE qui en résultent sont moins performantes (Lee et al., 2015). Comme chez la souris, le VEGF-C est indispensable pour la spécification de ce type de CE à partir des CSPh (Kono et al., 2006; Rufaihah et al., 2013). L’Ang-1 a été aussi utilisé dans ce but (Rufaihah et al., 2013). In vivo, les CE lymphatiques Lyve+Podoplanine+, dérivées à partir de CSPh par Lee et al. ont participé à la formation des vaisseaux lymphatiques et ont amélioré la guérison d’une blessure au niveau de l’oreille chez la souris (Lee et al., 2015).

Beaucoup plus explorée est la différenciation des CSPh en CE de la barrière hémato-encéphalique, HBMEC, qui a bénéficié des connaissances accumulées au fil des ans grâce aux études avec des cellules primaires humaines et des modèles animaux. Il est intéressant de noter qu’à la différence d’autres méthodes de différenciation endothéliale, la plupart des protocoles pour la génération des HBMEC-CSPh ne nécessitent pas de sélection cellulaire (Figure 25). La différenciation des CSPh en HBMEC dépend de l'ajout de l’AR (Lippmann et al., 2014; Stebbins et al., 2018) et de la culture ultérieure sur une matrice mixte de collagène IV et de fibronectine (Lippmann et al., 2012; Neal et al., 2019). Au-delà de l'expression de protéines des jonctions serrées et de transporteurs membranaires, les monocouches de HBMEC-CSPh ont démontré une TEER (résistance électrique transépithéliale/endothéliale, de l’anglais « trans-endothelial electrical resistance ») plus élevée (200-8000 Ω cm2) que celle obtenue précédemment avec les lignées cellulaires ou des HBMEC primaires (130-2200 Ω cm2). La TEER est une mesure de la résistance électrique exercée par une couche

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cellulaire et elle est lié à l’intégrité et perméabilité de cette couche. De plus, la coculture avec des astrocytes ou des péricytes, retrouvés dans le cerveau autour des capillaires de la barrière hémato-encéphalique, a démontré induire une augmentation de TEER in vitro (Jamieson et al., 2017; Lippmann et al., 2012; Neal et al., 2019; Workman and Svendsen, 2020). Grâce à ces caractéristiques, ces CE ont été utilisées dans différents modèles in vitro de la barrière hémato-encéphalique tel que les systèmes de « transwell » (Li et al., 2019; Lippmann et al., 2012) ou les systèmes microfluidiques, démontrant une perméabilité aux médicaments similaire par d’autres méthodes (Faley et al., 2019; Linville et al., 2019). Récemment, les CE ont été incorporées dans des organoïdes cérébraux permettant leur vascularisation et facilitant leur transplantation dans des modèles de souris (Pham et al., 2018; Song et al., 2019; Vargas-Valderrama et al., 2020).

Récemment, deux équipes de recherche ont généré des LSEC à partir de CSPh après une étape d'expansion d'une population endothéliale (CD34+ ou VEGFR-2+CD31+CD34+) (Figure 24). Pour ce faire, les CE-CSPh ont été cultivées sur fibronectine (Koui et al., 2017) ou sur Matrigel (Gage et al., 2020) en présence des inhibiteurs de la voie de signalisation TGF-β (Gage et al., 2020; Koui et al., 2017). De plus, Gage et al. ont montré que les LSEC ont leur origine principalement dans les angioblastes à phénotype veineux et que l'hypoxie favorise leur spécification en LSEC in vitro (Gage et al., 2020). In vivo, la transplantation des angioblastes artériels et veineux et des LSEC provenant de

Figure 25. Résumé des principaux protocoles de différenciation des CSPih en CE de la barrière hémato-encéphalique. Les étapes de différenciation des CSPih en HBMEC dans divers protocoles publiés sont illustrées dans cette figure ainsi que la caractérisation des cellules obtenues en terme de résistance électrique transépithéliale/endothéliale (TEER), immunocytochimie (ICC), activité des transporteurs de membrane (ETA) entre autres. Workman et Svendsen 2020.

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ces deux populations a démontré que les angioblastes veineux génèrent un plus grand nombre de cellules greffées qui acquièrent les caractéristiques des LSEC matures, dont la production du facteur VIII humain et la formation d'un endothélium fenestré (Gage et al., 2020). Dans cette étude, les HUVEC utilisées comme témoins n'ont pas donné une transplantation stable ni ont acquis des caractéristiques des LSEC (Gage et al., 2020). D’autre part, Koui et al. ont démontré que la coculture de progéniteurs hépatiques et de LSEC, issus de la même lignée CSPh, induit une différenciation plus efficace des hépatoblastes par rapport à la coculture de ces progéniteurs hépatiques avec les HUVEC (Koui et al., 2017).

Finalement, malgré l'absence de marqueurs spécifiques des CE spécialisées, la différenciation simultanée des CE et des autres lignages cellulaires à partir des CSPh a permis d'obtenir, par exemple, des organoïdes rénaux contenant des CE dans des structures similaires aux glomérules des néphrons (Freedman et al., 2015; Homan et al., 2019a; Vargas-Valderrama et al., 2020).

Dans le document Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules endothéliales et cellules hématopoïétiques via une population du type hémangioblastique (Page 149-153)