Figure 3 : Technologie de sé uençage haut dé it SOLiD.
Suite à l’h ridatio d’u e a orce u iverselle, u set d’a orces est ajouté. Ces a orces o t la particularité d’avoir e ’OH u pre ier ucléotide et u deu i e ucléotide et = A,T,G ou C . Les autres ases so t des ases dégé érées ou u iverselles. Il e iste ai si co i aiso s d’associatio s et ui so t e codées par couleurs, ai si u e couleur correspo d a co i aiso s de et . Les so des ar uées au fluorochro e leu, jau e, vert ou rouge selo la co i aiso des deu pre iers ucleotides e ’OH s’h ride t selo la co plé e tarité de sé ue ce. Apr s la lecture des fluorochro es u e partie de la sé ue ce est clivée puis éli i ée et u e autre so de ar uée est ajoutée. Les c cles SOLiD so t répétés di fois e suite le pri er u iversel est cha gé fois pour u e a orce co plé e taire de la sé ue ce - . Da s ce processus cha ue ase est i terrogée da s deu réactio s de ligatio i dépe da tes par deu différe tes a orces. Selo le code couleur, cha ue ase est associée a deu couleurs. L’alig e e t s’effectue e espace couleur et est retra scrit e sé ue ce ADN. D’apr s Metzker et al.
60 Les résultats de mon travail sont présentés sous la forme de deux chapitres, composés principalement de deux articles scientifiques. Le 1er chapitre traite de la caractérisation des miARN d’A. thaliana dans les galles induites par les nématodes à galles du genre Meloidogyne. Il est complété avec un second chapitre qui présente les résultats de l’analyse de la famille des siARN différentiellement régulés lors de la formation de la galle.
Chapitre 1 : Caractérisation des miARN d’A. thaliana dans les galles
induites par les nématodes à galles du genre Meloidogyne spp.
Cette première étude vise d’une part à identifier les miARN dont l’expression est modifiée lors de la formation des galles d’A. thaliana et d’autre part à étudier leur fonction. Afin d’analyser le rôle global des miARN dans l’interaction, des mutants hypomorphes ago1-25, ago1-27, ago2-1 et le double mutant ago1-27/ago2-1 affectés dans les régulations PTGS associées aux petits ARN, ont été infectés par les larves de M. incognita. La diminution du nombre de masses d’œufs observée chez ces mutants par rapport aux plantes de l’écotype sauvage suggère un rôle de la voie PTGS et des petits ARN associés dans la formation des galles induites par M. incognita. Afin d’étudier le rôle des miARN dans l’interaction plante - nématodes à galles plus en détail, les petits ARN de racines non inoculées d’A. thaliana et des galles 7 jai et 14 jai par M. incognita ont été séquencés avec la technologie SOLiD (Fig 37). Les séquences s’alignant sur les positions des miARN matures répertoriées dans le génome d’A. thaliana ont été comptées et une analyse statistique a permis d’identifier les miARN différentiellement régulés entre la condition « galles » et « racines non infectées ». Au total 10 et 20 miARN ont été identifiés comme différentiellement exprimés à 7 et 14 jai respectivement. L’analyse de lignées portant des constructions de promoteurs de gènes MIR fusionnés au gène GUS (MIR167,
MIR164, MIR394, MIR390 et MIR408) ont permis de confirmer l’activité de ces cinq promoteurs dans
les galles. Les profils d’expression des constructions pMIR390b::GUS, pMIR408::GUS, pMIR167d::GUS et pMIR394b::YFP ont permis de confirmer les résultats de séquençage. Ces analyses désignent les miARN des familles miR167, miR390 et miR394 comme des candidats prometteurs pour intervenir dans la formation de la galle. De plus, la réponse à l’infection par M. incognita des mutants « mimicry », perte de fonction ou surexpresseurs a été testée pour 7 miARN différentiellement exprimés afin de déterminer le rôle de ces gènes dans la formation des cellules géantes. Ces résultats ont permis de mettre en évidence le rôle important des miARN de la famille miR159 dont les formes matures ont pu être localisées, par une expérience d’hybridation in situ, dans les cellules géantes et les cellules voisines de la galle. Enfin l’analyse de l’expression d’une fusion traductionnelle de MYB33,
61 une des cibles des miR159, montre que la surexpression de miR159a et miR159c observée à 14 jai par séquençage est corrélée à une diminution de l’expression de MYB33.
L’ensemble de ces résultats font l’objet d’un article soumis à la revue internationale à comité de lecture The New Phytologist et qui est actuellement en révision.
Article 1: Characterisation of microRNAs from Arabidopsis galls highlights a role for miR159 in the
plant response to the root-knot nematodes Meloidogyne incognita.
Clémence Medina, Martine da Rocha, Marc Magliano, Alizée Ratpopoulo, Benoît Revel, Nathalie
Marteu, Virginie Magnone, Kevin Lebrigand, Javier Cabrera, Marta Barcala, Ana Cláudia Pereira da Silva, Anthony Millar, Carolina Escobar, Pierre Abad, Bruno Favery & Stéphanie Jaubert-Possamai.
En révision
J’ai contribué à cet article en participant à la collecte du matériel nécessaire au séquençage, en réalisation les analyses bio-informatiques permettant l’identification des miARN exprimés dans les galles et les racines saines ainsi que l’identification des miARN différentiellement exprimés entre les deux conditions. J’ai également contribué à la localisation de l’expression des promoteurs des gènes
MIR pour les miARN différentiellement régulés miR408, miR167a/b/c/d, miR164c et miR394b et à la
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