Caractérisation de l’huile de tung

La détermination en acides gras de l’huile de tung est obtenue par transformation de l’ensemble des acides gras en esters méthyliques. La dérivation consiste en une méthanolyse basique suivie d’une estérification acide selon la norme AFNOR NF T60-203.

Pour cela, une solution de méthylate de sodium est préparée en mélangeant 62 mL d’une solution méthanolique de méthylate de sodium (0,5 M), 560 mL de méthanol et une goutte de phénolphtaléine pure. Une solution de méthanol chlorhydrique est, quant à elle, préparée en mélangeant 50 mL de chlorure d’acétyle avec 625 mL de méthanol. À l’aide d’une pipette Pasteur, l’huile de tung (20 à 30 mg) est introduite dans un ballon de 50 mL et 3 mL de la solution de méthylate de sodium sont alors ajoutés. Une canne de saponification est placée au-dessus du ballon et le mélange est chauffé à reflux (65°C) en présence de pierre ponce durant 10 min. Par la suite, 3 mL de la solution de méthanol chlorhydrique sont ajoutés par le haut de la canne de saponification jusqu’à décoloration de la phénolphtaléine. Le mélange est de nouveau chauffé à reflux durant 10 min à la même température. Après refroidissement du milieu réactionnel à température ambiante, 10 mL d’eau distillée et 6 mL d’hexane sont ajoutés dans le ballon. Après agitation manuelle, le milieu est laissé au repos 5 min et quelques mL de la phase supérieure contenant les esters méthyliques sont prélevés. Cette phase organique est séchée par ajout de Na₂SO₄ anhydre, puis filtrée (millipore 0,45 µm) pour être analysée en chromatographie en phase gazeuse (CPG). La CPG utilisée (Agilent série 6890, Sigma-Aldrich) est équipée d’une colonne capillaire Supelcowax 10 (SGE, Courtaboeuf, France) de 30 m de longueur, 0,32 mm de diamètre interne et 0,25 µm d’épaisseur de film, d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) et d’un intégrateur enregistreur Merck D 2000. L’analyse chromatographique est effectuée comme suit : 1 µ L de l’échantillon en solution hexanique est injecté en mode division (rapport de fuite 1/100). Les températures de l’injecteur et du détecteur sont respectivement de 250 et 270°C. Le débit du gaz vecteur (Hélium) est de 2 mL/min. Enfin, le gradient de température du four est réalisé comme suit : palier de 2 min à 185°C, montée en température (4°C/min) de 185 à 225°C, palier final de 3 min à 225°C.

2.3.2. Caractérisation des triacylglycérols de l’huile de tung par HPLC

Le profil triglycéridique de l’huile de tung est déterminé par chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). La chaîne HPLC (Thermo Fisher, France) comporte une

pompe (modèle Spectra System P1000xR), un passeur d’échantillon automatique (modèle Spectra System AS 1000) et un détecteur à diffusion de lumière (DDL, modèle ALLTECH, 500 ELSD). Deux colonnes octadécyl C18 de type QS LICHROSPHER 5 ODS 2 (5 µm, 250 x 4,6 mm ; Interchim) maintenues à 30°C sont ensuite utilisées pour la séparation. Le débit dans les colonnes est de 1 mL/min, la pression de l’ordre de 1300 psi et la boucle d’injection d’une capacité de 100 µ L ; le solvant d’élution est, quant à lui, composé d’un mélange acétonitrile/acétone (50 : 50, v/v, solvant A) et de chloroforme (solvant B). L’élution est mise en œuvre avec un gradient linéaire comme suit : 0 min, 100 % de A ; 60 min, 80 % de A (palier 80 min) ; 95 min, 100 % de A (palier 110 min). La détection au DDL est effectuée à 30°C sous une pression de 44,2 psi.

2.3.3. Caractérisation de la régiodistribution de l’huile de tung

L’étude de la régiodistribution de l’huile de tung est réalisée conformément à la norme AFNOR T60-241. 100 mg d’huile de tung sont introduits dans un tube à hémolyse et mélangés avec 2 mL d’une solution tampon (Tris-HCL 1 M, pH 8), 0,5 mL d’une solution de cholate de sodium (1 g/L), et 0,2 mL d’une solution de chlorure de calcium (220 g/L). L’ajout de 20 mg de lipase pancréatique de porc (hydrolysant les triacylglycérols en positions sn-1 et

sn-3) est immédiatement suivi d’une agitation manuelle du milieu réactionnel durant 3 min

dans un bain-marie chauffé à 40°C. La réaction est ensuite stoppée par ajout de 1 mL d’une solution d’acide chlorhydrique (6 M). La phase lipidique est extraite par 1 mL d’éther diéthylique. Après centrifugation (3000 g, 10 min, 20ºC, centrifugeuse Sigma, Fischer Bioblock Scientific, Marseille, France), la phase organique est prélevée puis déposée automatiquement (300 µ L) sur un plaque de silice préparative (Merck, 10 cm x 20 cm x 0,25 mm). La phase mobile utilisée lors de la migration est constituée d’hexane/éther diéthylique/acide acétique (50 : 50 : 1, v/v/v). Les monoacylglycérols (MAGs) présentant un rapport frontal de 0,15 sont grattés puis transformés en esters méthyliques directement à partir de la silice grattée afin d’être injectés en chromatographie en phase gazeuse (cf. section 2.3.1.).

Cette méthode permet de déterminer la composition en AGs de la position interne des TAGs. La composition en AG totaux des TAGs étant connue, les pourcentages des AGs correspondant à la moyenne des 2 positions externes peuvent être calculés à partir de l’équation 1 comme suit :

2 A A 3 A_{e =} ^t − ⁱ (Eq 1)

avec A_e, A_i et A_t, correspondant respectivement aux % molaires des AGs en position externe, interne et totale.

2.3.4. Analyses des tocophérols endogènes de l’huile de tung

La quantification des tocophérols endogènes de l’huile de tung est effectuée selon la norme AFNOR 9936, par la technique d’HPLC en phase normale couplée à une détection fluorimétrique (λ_ex : 290 nm/λ_em : 330 nm). L’appareillage HPLC se compose d’une pompe (modèle Spectra System P1000xR), d’un injecteur automatique (modèle Spectra System AS1000) et d’un détecteur à fluorescence (modèle Spectra System FL3000). La colonne de silice employée est de type Hypersil Silica (Si 60 ; 5 µm ; 250 x 4,6 mm) et maintenue à 30°C. La phase éluante est composée d’un mélange d’hexane et de dioxane de qualité HPLC (97 : 3 ; v/v). Le débit de la colonne est de 1 mL/min, avec une pression de 350 psi. La quantification et l’identification des tocophérols sont réalisées à partir de composés standards d’α-, β-, γ- et δ-tocophérols (VWR International SAS, Fontenay sous Bois, France).

2.3.5. Préparation de l’huile de tung purifiée

Les composés polaires de l’huile de tung (comprenant le β-tocophérol) sont retirés en passant 25 mL d’une solution hexanique d’huile de tung (200mg/mL), suivi de 25 mL d’hexane pur à travers une colonne d’alumine préparée comme suit : 25 g d’alumine dans l’hexane sont introduits dans une colonne en verre et l’excès d’hexane est éliminé jusqu’à affleurement. Après retrait complet des tocophérols, l’hexane est évaporé sous vide (-2,9 psi) à 35°C dans un évaporateur rotatif équipé d’une pompe à vide (Laborport, KNF euberger GmbH, Freiburg, Allemagne). Il faut préciser que toutes les manipulations doivent être réalisées autant que possible à l’abri de la lumière. Enfin, l’huile de tung purifiée est aliquotée dans des tubes en verre ambré, puis inertée sous flux d’azote et stockée à -18°C jusqu’à son emploi. L’utilisation d’aliquotes jetables d’huile de tung (i.e., 15 aliquotes pour 15 microplaques) permet d’éviter les retraits successifs d’un même échantillon et minimise de ce fait l’apparition d’éventuelles oxydations.