Caractérisation des vésicules extracellulaires

Dans certaines études, la fonction des vésicules est étudiée avant leur caractérisation. Dans ce cas, les études extrapolent souvent les méthodes classiques d’isolation des VE, en général l’ultracentrifugation différentielle, à un autre fluide biologique sans purification supplémentaire et sans vérification préalable de la validité de la méthode [228]. Ces études sont, par conséquent, extrêmement dépendantes des méthodes utilisées [151]. Il est alors d’une importance capitale de procéder à une caractérisation poussée des VE du fluide biologique étudié avant d’imputer la fonction biologique d’un groupe hétérogène de VE à une population spécifique (e.g. exosomes). Les recommandations les plus à jour concernant la caractérisation des VE sont décrites en détail dans l’Annexe 1.

1.3.5.1. Étude de la morphologie des VEs

La morphologie des VE est la première des caractéristiques à établir et permet de définir si les corps en études possèdent bien une membrane phospholipidique et sont bien des vésicules. Elle peut être élucidée par l’utilisation de microscopie ou cryomicroscopie électronique à transmission ou à balayage [229, 230], par détection d’impulsions par résistance (« Resistive pulse

sensing », RPS) [231] ou par microscopie confocale [232]. Alors que les deux premières approches

permettent d’observer des VE aussi petits que 10 nm, la microscopie confocale est limitée par la taille des VE souvent inférieure à la plus petite longueur d’onde du visible (400 nm). On observe alors souvent des amas de VE agrégées autour d’un ligand et non des VE isolées [232].

40

1.3.5.2. Étude de la taille et de la dispersion des VE

Ces premières approches, basées sur la microscopie, permettent d’estimer la forme et la taille des VE, mais nécessitent des traitements préalables qui peuvent modifier leur diamètre (fixation, séchage, agrégation, etc.)[233].

On les combine souvent avec de la cytométrie en flux [223], des méthodes basées sur la diffusion dynamique de la lumière (« dynamic light scattering », DLS)[234] ou d’analyse du suivi individuel de particules (« Nanoparticle tracking analysis », NTA)[235]. Toutes ces approches permettent de déterminer le diamètre des VE directement (DLS, NTA) ou indirectement par comparaison avec d’autres particules d’une taille connue (CMF)[223].

Elles révèlent néanmoins uniquement la taille hydrodynamique des VE, ce qui est une surestimation de leur diamètre réel [235]. Ces méthodes ne permettent pas non plus de discriminer les VE d’autres corps non vésiculaires en suspension dans la solution étudiée [151]. La combinaison de ces approches avec un marquage des lipides, du cytosol ou des protéines de surface des VE (p. ex. avec des anticorps), permet de pallier ces limites de sorte leur association avec la microscopie électronique offre une estimation convenable du diamètre et de l’aspect des VEs.

1.3.5.3. Étude de la densité des VE

La densité des VE est un élément essentiel pour leur isolation, et sa détermination est en générale concomitante à l’isolation des VE dans un gradient de densité. Ce gradient est alors fractionné (6 à 12 fractions), et la détermination de la densité des fractions enrichies en VE grâce à un densitomètre ou par réfractométrie permet d’estimer la densité des VEs. Celle-ci est, en règle générale, comprise entre 1,10 et 1,25 g/mL [236, 237].

1.3.5.4.Caractérisation de la composition des vésicules extracellulaires

Les éléments qui composent les VE (Figure 1.9) influent sur leurs caractéristiques physiques et chimiques. Les lipides, et les protéines vésiculaires modulent la densité et la taille hydrodynamique des VE [238]. En association avec les acides nucléiques intravésiculaires (ADN, ARN), ils influent aussi sur la fonction des VE [239].

41

Lipides

Les lipides sont les composants principaux qui permettent de définir la nature vésiculaire d’un corps extracellulaire. De ce fait, les VE contiennent des phospholipides, des céramides et du cholestérol entre autres lipides (glycérolipides, prénols, sphingolipides, glycérophospholipides, etc.) [240, 241].

On quantifie les lipides vésiculaires par chromatographie en phase liquide ou gazeuse couplée à de la spectrométrie de masse [242, 243] ou par certaines trousses chimiques ou enzymatiques [244]. On couple en règle générale ces données avec des analyses bio- informatiques (protéomique) afin de définir un profil spécifique à certaines populations de VE [245].

Protéines

Les protéines qui se retrouvent dans les VE peuvent être membranaires ou intravésiculaires. Leur nature définit bien souvent le type de VE qui les contiennent et la majorité de la classification des VE reposent sur leur cargo protéique [151].

Déterminer le contenu protéique des VE est, par conséquent, indispensable pour leur caractérisation, leur classification et pour la prévision de leur activité biologique.

Pour ce faire, les approches les plus courantes quantifient certaines protéines présélectionnées par Elisa, immunobuvardage ou cytométrie en flux. Ces méthodologies sont simples et rapides à mettre en place, mais présupposent souvent que les protéines sélectionnées sont spécifiques d’une population de VEs. Or, il n’y a pas de marqueur de VE, mais des protéines enrichies dans une population ou une autre [151, 152].

La présence concomitante de plusieurs protéines dans une population de VE peut néanmoins suggérer leur nature. C’est notamment le cas lorsqu’une population de VE contient concomitamment CD9, CD63 et CD81. Dans ce cas, ces VE sont probablement des exosomes [152].

42

Figure 1.9. Aspect général d’une vésicule extracellulaire.

Le contenu des VE dépend de leur origine et de leur biogenèse. Il existe plusieurs populations de VE dans un même fluide biologique, et leur nature peut être élucidée par l’étude de leur contenu en lipides, protéines et ARNs. Figure tirée de Colombo et al. 2014 [154].

43

De la même manière, la présence notable de phosphatidylsérines tournées vers le milieu extracellulaire dans les MVs conduit à la fixation du milk-fat globule membrane element 8 (MFG-8), une protéine souvent enrichie dans les MVs [246]. Ce type de VE est aussi souvent positif lorsqu’exposé à l’Annexine V et possède parfois des traces d’actine, ce dont les exosomes sont en général dépourvues [247, 248].

Ces marqueurs ne sont néanmoins pas exclusifs à une seule population ou type de VEs. Par conséquent, leur utilisation en combinaison est souhaitable et recommandée afin de caractériser une population inconnue de VEs.

Des approches à plus large spectre par Bioplex, Elisa multiplex et DotBlot Elisa (pour les cytokines/chimiokines) ou par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (pour tous les autres peptides) permettent de caractériser une population sans préjuger de leur nature et de simplement décrire leur contenu [152, 249, 250]. Leur mise en œuvre nécessite, en revanche, beaucoup de moyens et l’analyse bio-informatique (protéomique) qui leur est combinée exige des plateformes dédiées [251]. Néanmoins, ce sont les méthodes à privilégier face à une population de VE indéfinie ; elles permettent d’estimer la potentielle fonction des VE selon leur contenu protéique.

Enfin, il existe des méthodes centrées sur les activités enzymatiques retrouvées dans les VE (p. ex. acétylcholine estérase, ACHE ou autres estérases cytoplasmiques). Ces méthodes, généralement colorimétriques, ne sont pas particulièrement précises et ne permettent pas de différencier les enzymes libres, agrégées dans des complexes protéiques ou encapsulées dans des VE [252, 253]. Elles sont souvent utilisées en complément des approches décrites précédemment.

La totalité des approches décrites ici a permis la création de bases de données décrivant différentes populations de VE et leur contenu protéique [254, 255].

ARNs

Parmi le cargo des VE, les ARNs concentrent la majorité de l’intérêt de la communauté scientifique, car ce sont des acteurs durables de l’activité cellulaire. Les VE peuvent contenir des ARNs non codants comme les microARN, les longs ARNnc, ARNs de transfert (ARNt) et leurs

44

fragments, ARNs circulaires, des fragments d’ARNs ribosomaux (ARNr). On y retrouve aussi des ARNm et parfois des virus à ARN [256-258].

Les microARN sont particulièrement étudiés à cause de leur potentiel régulateur, mais d’autres ARNs comme les ARN circulaires ou les long ARNnc ont gagné en intérêt dans les études les plus récentes [256, 259-261]. Cela tient principalement du fait que les VE contiennent plusieurs types d’ARNs et par conséquent ce n’est pas une seule espèce d’ARN qui conduit l’activité biologique d’une VE, mais leur combinaison et le contexte cellulaire [257, 262].

Tout comme pour les protéines, l’étude des ARNs vésiculaires repose sur des méthodes ciblées (RT-qPCR, Northern blot) ou des méthodes à haut débit et large spectre d’analyse (RNA

microArray et séquençage de nouvelle génération et à haut débit des ARNs, NGS-RNAseq)[263,

264]. Les approches à large spectre sont généralement privilégiées, mais elles sont rarement quantitatives et nécessitent une validation par les méthodes ciblées [265].

Comme pour les protéines, il existe des bases de données décrivant les ARNs contenus dans différentes VE (EVpedia, VesiclePedia, EVmiRNA, etc.) [254, 255, 260].

Ainsi, non seulement il existe pléthore de VE, mais leur contenu est aussi très varié et les techniques qui permettent d’isoler des VE et analyser ce contenu sont nombreuses et très variables. L’utilisation d’une approche ou d’une autre influe donc énormément sur les conclusions d’une étude. Malgré les recommandations récentes, il n’y a toujours pas de consensus. Il est donc indispensable que la méthodologie utilisée soit scrupuleusement décrite afin d’assurer la reproductibilité des résultats [151].