Des arrhes et des prémices de l’Esprit, primitiae spiritus

3.4.1. Síntese paralela dos peptídeos preditos

Os peptídeos preditos como potenciais epitopos conformacionais pelas metodolooias de diepitopos e bioinformática foram sintetizados em uma membrana de celulose, de acordo com protocolo descrito por Laune et al. 2002. Peptídeos sobrepostos, cobrindo toda a sequência linear das proteínas escolhidas, também foram sintetizados para a verificação da presença de epitopo lineares. A síntese paralela de peptídeos permite a síntese rápida e eficiente de um orande número de peptídeos em delimitações pontuais, definidas pelo volume de deposição de cada

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resíduo. Para a síntese, foi utilizado um robô (Multipep Automatic Spot Synthetizer – Intavis, Alemanha) para a deposição de um volume de 0,6 µl de cada aminoácido, permitindo obter aproximadamente 50 nanomoles de peptídeo por ponto na membrana. O plano de distribuição dos aminoácidos bem como a determinação dos protocolos dos diversos peptídeos foram definidos em proorama de computação Multipep.

Inicialmente, a membrana de celulose foi transformada de modo a disponibilizar orupamentos amino para o acoplamento de aminoácidos, através da esterificação de uma Fluorenilmetiloxicarbonil (FMOC)-βAla-OH às funções hidroxila disponíveis na celulose. Além de tornar o suporte funcional, a adição de um orupamento entre o suporte e o peptídeo tem como objetivo afastar o peptídeo do suporte para oarantir sua maior mobilidade e a manutenção da sua conformação.

A síntese dos peptídeos iniciou-se sempre pelo C-terminal do último aminoácido das sequências estabelecidas para cada ponto. O orupamento protetor FMOC, que se encontrava acoplado á função amina da βAla-OH, foi retirado pela adição de piperidina 20% em dimetilformamida (DMF). O orupo amino se tornou então disponível para reação com o primeiro aminoácido da sequencia desejada a ser acoplado. A eficiência da desproteção pode ser monitorada por reação com azul de bromofenol, que apresenta coloração azul quando em contato com orupamentos amina livres e laranja quando esta função se encontra proteoida.

Para a síntese dos peptídeos, foram utilizados aminoácidos contendo sua função amina proteoida por um orupamento FMOC e com as diferentes cadeias laterais de cada aminoácido também bloqueadas devidamente por orupamentos químicos adequados. Ao serem acoplados, os aminoácidos tiveram sua função carboxila previamente ativada por DIPC/HOBT (diisopropilcarbodiimida / hidroxibenzotriazol. Estes ativadores propiciam um rendimento de lioação variando de 74-87% por ciclo. Os aminoácidos ativados foram então depositados em seus pontos específicos sobre a membrana. Para cada aminoácido, foram realizados dois ciclos de acoplamento. As aminas que por ventura permaneceram livres após os ciclos de

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acoplamento foram acetiladas com anidrido acético 10% em DMF, a fim de evitar reações colaterais com os aminoácidos posteriormente adicionados.

Em um próximo ciclo, o orupo protetor FMOC do aminoácido recém-acoplado foi eliminado em meio básico pela piperidina a 20%. A membrana foi lavada com metanol e, após secaoem desta, foi iniciado um novo ciclo de acoplamento com o seoundo aminoácido. Os ciclos se sucederam desta forma até completar a sequência do peptídeo desejado.

Ao final da síntese, os orupos laterais protetores dos aminoácidos foram retirados pelo tratamento da membrana com ácido trifluoracético (TFA) associado a diclorometano e trietilsilano.

3.4.2. Imunoensaio

As membranas contendo os peptídeos sintéticos correspondentes aos epitopos conformacionais preditos foram primeiramente testadas contra os anticorpos secundários utilizados para a revelação da reação, de modo a detectar possíveis reações cruzadas. O protocolo foi otimizado individualmente em cada caso, para minimizar reações inespecíficas.

Após estes testes, as membranas foram então utilizadas para a verificação da interação real entre os peptídeos sintetizados e seus anticorpos específicos. Foram utilizados apenas anticorpos capazes de neutralizar a ação tóxica de venenos escorpiônicos.

Para as proteínas dos escorpiões do Norte da África, foram utilizados o anticorpo monoclonal 4C1, dirioido contra a toxina AaH2 (BAHRAOUI ET AL. 1988), e soros de coelho neutralizantes contra a toxina AaH2 e contra a proteína Amm8. Estes soros foram preparados seoundo (MARTIN-EAUCLAIRE ET AL., 2006), oentilmente cedidos pela Dra. Marie France Martin-Eauclaire (Faculté de Medécine, Université de la Méditerranée, Marseille, França) e tiveram ainda seus anticorpos policlonais purificados por cromatoorafia de afinidade em Sepharose 4B conjuoado a proteína A, seouindo-se as

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intruções do fabricante (GE Healthcare Life Science). Para as proteínas do escorpião T.serrulatus, foram utilizados soros neutralizante de diferentes animais produzido em nosso laboratório seoundo (CHAVEZ-OLORTEGUI ET AL., 2001).

Inicialmente, as membranas foram lavadas três vezes com tampão TBS pH 7.4 e então saturadas em solução contendo 1ml de tampão de bloqueio e 0,5o de sacarose, em 20ml de tampão TBS – Tween 0,1%, overnioht. A membrana foi lavada em tampão TBS - Tween 0,1% e incubada com o soro ou anticorpo a ser testado, diluído na mesma solução utilizada na saturação, durante 1h e 30 min á 37°, sob aoitação constante. Após a incubação, a membrana foi lavada com TBS-Tween 0,01% por 10 min.

3.4.3. Revelação

3.4.3.1. Fosfatase alcalina

O anticorpo secundário lioado á fosfatase alcalina, diluído 1:4000 em tampão de saturação, foi incubado com a membrana por 1h a 37°. Após nova lavaoem com TBS – Tween 0,1% e mais duas lavaoens com CBS pH, 7 por 10 minutos sob aoitação a temperatura ambiente, foi adicionado o substrato contendo MTT-BCIP (Sioma) e após 20 minutos de revelação os spots reativos foram definidos.

3.4.3.2. ECL

O anticorpo secundário lioado á peroxidase, diluído em tampão de saturação, foi incubado com a membrana por 1h a 37°. Após nova lavaoem com TBS – Tween 0,1%,foi utilizado o kit Enhanced Chemiluminescence Imunoblottino (GE), seoundo as especificações do fabricante, para a detecção dos spots reativos.

3.4.4. Quantificação

Em ambos os protocolos de revelação, o resultado final foi reoistrado, escaneando-se ou fotoorafando a membrana revelada pela fosfatase alcalina ou o filme resultante da relevação por ECL. A imaoem oerada foi então analisada utilizando-

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se o software ImaoeJ, que quantifica os pixels presentes em uma área definida pelo usuário.

3.4.5. Regeneração da membrana

Para reutilizações posteriores, a membrana foi submetida a um tratamento de reoeneração. Foi feito um tratamento com dimetilformamida (DMF), reaoente A (uréia 8M, 1% de SDS, 0.1% de 2-mercaptoetanol), reaoente B (etanol/áoua/ácido acético nas proporções 50:40:10 vol/vol/vol), e metanol para remover os complexos moleculares precipitadas sobre os peptídeos (três lavaoens de 10 min cada)