Analyses des propriétés de transport de ClC-5

1. Voltage-clamp en double microélectrodes dans l’ovocyte de Xénope

Le voltage-clamp en double microélectrodes est une technique qui permet de mesurer le courant global (I) généré par les canaux et transporteurs ioniques présents à la membrane plasmique de cellules (telles que les ovocytes de Xénope) à différents potentiels de membrane imposés par l'expérimentateur (Vi) [voir Figure 34]. Pour ce faire, un ovocyte de Xénope est placé dans une chambre de perfusion contenant la solution ND96 (Voir Section Matériel et Méthodes n°2 III.1). Si besoin, cette solution est remplacée en cours de mesure par une solution

ND96 dont le pH est ajusté à 5.5, 6.5, 7.0 ou 8.0 en remplaçant les 5 mM d'HEPES par 5 mM

de MES ou de Trizma Base. Deux microélectrodes en borosilicate de résistance 0,1-1 MΩ sont étirées depuis des capillaires, remplies d’une solution conductrice de KCl 3M, reliées à un amplificateur TEV-200 (Dagan) par l’intermédiaire de filaments d’argent chlorurés et enfin introduites dans l'ovocyte. L’une des 2 mesure le potentiel de membrane (Vm), qu'un amplificateur compare au Vi. L'autre, située à la sortie de l'amplificateur, injecte dans l’ovocyte un courant i permettant d’amener le potentiel Vm au potentiel Vi. L'amplificateur est connecté à une interface analogique/numérique Digidata 1320A (Axon Instruments). Après leur conversion, les données sont analysées sur ordinateur grâce au logiciel PClamp 10 (Axon Instruments). L'ensemble du dispositif est placé sur une table antivibratoire entourée d'une cage de Faraday qui isole électriquement le circuit. Notre protocole de voltage-clamp impose à l’ovocyte des potentiels allant de -100 à +100 mV par pas de 20 mV durant 800 ms chacun.

Figure 34: Représentation schématique du dispositif de voltage-clamp

2. Mesures du transport de H

de ClC-5 dans les cellules HEK293T

Des mesures de patch-clamp en configuration cellule entière appliquées aux cellules HEK293T ont permis de mesurer la capacité de transport des protons par le ClC-5 sauvage et le mutant E211G. Elles ont été réalisées par le Dr. Alexi Alekov (Institut de neurophysiologie, Hanovre, Allemagne). Cette technique électrophysiologique constiste, comme le voltage-clamp en double microélectrodes, à imposer différents potentiels à une cellule et à mesurer le courant généré en retour par les canaux et transporteurs ioniques exprimés à sa surface. Pour ce faire, une pipette de verre est remplie d’une solution contenant (en mM): 110 NaCl, 5 MgCl2, 5 EGTA, 10 HEPES, pH 7.4. La solution de la pipette est connectée à un amplificateur par un filament d’argent chloruré. L’autre borne du circuit est constituée par une électrode de référence. Les signaux provenant de l’amplificateur sont visualisés et analysés sur ordinateur après filtrage à 3 KHz et conversion analogique/numérique à 100 KHz. Les cellules sont placées dans une solution physiologique contenant (en mM): 145 NaCl, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0.25 HEPES, pH 7.4. L’application d’une pression négative dans l’électrode préalablement attachée à la surface de la cellule permet de mettre en continuité électrique cette dernière et l’intérieur de la cellule, et ainsi d’obtenir la configuration de patch-clamp en cellule entière. Les courants globaux traversant la membrane de la cellule peuvent alors être enregistrés. En outre, 37.5 μM de BCECF (2′,7′-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluoresceine), qui est un composé qui fluorescent, ont été rajoutés dans la solution de pipette. Le BCECF émet de la fluorescence à 530 nm dont l'intensité est proportionnelle au pH lors d’une excitation par une longueur d'onde de 490 nm. De plus, son émission de fluorescence à 530 nm ne dépend pas du pH lorsqu'il est excité par une longueur d'onde de 440 nm (c'est un point isobestique) [voir Figure 35].

Figure 35: Spectre d'excitation/émission idéalisé du BCECF (à gauche) et schéma du principe de la mesure du transport des protons par ClC-5 dans les cellules (à droite)

En pratique, l’expérimentateur s’attend à ce que l’application de différences de potentiel transmembranaires positives provoque un fort courant rectifiant sortant, suite à l’activation du ClC-5 sauvage surexprimé par la cellule. Une telle dépolarisation de la membrane plasmique conduira alors à un flux sortant important de H+ et donc à une alcalisation du cytoplasme. Cette alcalinisation est mesurable grâce à la fluorescence émise en parallèle par le BCECF. Le ratio de fluorescence émise à 530 nm par 2 excitations successives à 490 et 430 nm est mesuré à l'aide d'un microscope à fluorescence combiné au poste de patch-clamp. Le ratio augmente si le cytoplasme est alcalinisé (Alekov & Fahlke, 2009).

3. Détermination du pH endosomal dans les cellules HEK293T

Les mesures de pH endosomal dans les cellules HEK293T ont été effectuées par le Dr. Alexi Alekov (Institut de neurophysiologie, Hanovre, Allemagne). Ces cellules exprimaient à la fois un ClC-5 fusionné à son extrémité C-terminale avec la protéine fluorescente mCherry et la protéine de fusion synapto-pHluorin2. Cette dernière, comme le BCECF (voir Section Matériel et Méthodes n°2 IV.2) est une sonde ratiométrique sensible au pH: son excitation à 488 nm provoque une émission fluorescente à 500-550 nm dont l'intensité est inversement proportionnelle au pH, alors que son excitation à 405 nm provoque une émission de fluorescence à 500-550 nm indépendante du pH (Mahon, 2011). La synapto-pHluorin2 étant adressée aux endosomes précoces (Alekov, 2015), y mesurer le ratio des intensités de fluorescence émises à 500-550 nm suite à 2 excitations successives à 405 et 488 nm (ratio 405/488) permet de mesurer le pH luminal. Les valeurs absolues de pH sont déterminées par comparaison des ratios 405/488 à ceux obtenus dans des vésicules néoformées depuis un milieu extracellulaire de pH connu. En pratique, des cellules HEK293T vivantes maintenues à température ambiante dans du PBS++ _{ont été photographiées à l'aide d'un microscope confocal} LSM780 (Zeiss). Les ratios 405/488 ont été mesurés au niveau d'endosomes précoces exprimant à la fois la synapto-pHluorin2 et le ClC-5-mCherry (sauvage ou E211G) qui fluoresce en rouge à 560-650 nm. Ces ratios ont été comparés à ceux d'endosomes n'exprimant pas ClC-5.