Analyses biochimiques de l’expression de ClC-5

La luminescence de surface est une technique utilisée afin d'évaluer l'expression de ClC- 5 à la membrane plasmique de l'ovocyte de Xénope. Pour cela, les ovocytes sont incubés 30 minutes à 4 °C dans une solution ND96 contenant (en mM)96 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 1.5 CaCl2, 5 HEPES, pH 7.4 dans laquelle est ajoutée 1 % de BSA (Bovine Serum Albumin). Ensuite, les ovocytes sont placés 1 heure à 4 °C dans une solution ND96 + 1 % BSA contenant 1 μg/ml de l'anticorps monoclonal rat anti-HA 3F10 (Sigma-Aldrich, 1:100ème). L'anticorps se fixe alors spécifiquement sur le tag HA extracellulaire de ClC-5. Les ovocytes sont lavés 8 fois 3 minutes à 4 °C avec une solution ND96 + 1 % BSA sans anticorps, puis sont incubés 45 minutes à 4 °C dans la même solution contenant 2 μg/ml d'anticorps 112-035-062 de chèvre anti-rat couplé à l'enzyme HRP (Horseradish Peroxydase) (JacksonImmunoresearch, 1:400ème). Après 6 lavages de 3 minutes, les ovocytes sont placés individuellement 1 minute à température ambiante dans une solution "SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate Solution" (Pierce). Cette solution alcaline contient de l'H2O2 (substrat de la HRP) et du luminol. Ce dernier est oxydé par la HRP et entre dans un état excité d'où il revient à son état initial en émettant un photon du domaine visible: il est luminescent. C'est pourquoi l'ovocyte est ensuite placé dans la chambre d'un luminomètre Turner TD-20/20 (TurnerDesign) qui quantifie son émission lumineuse durant 10 secondes pour en faire une valeur en unité arbitraire ULR (Unité Lumineuse Relative). La valeur ULR obtenue est une fonction linéaire et proportionnelle de la quantité d'ARNm artificiel de ClC-5-HA injectée dans les ovocytes [voir Figure 32].

Figure 32: Représentation schématique de la méthode de détection de ClC-5 à la surface des ovocytes de Xénope par immunomarquage luminescent de son tag HA extracellulaire

2. Biotinylation de surface des cellules HEK293T

La biotinylation des protéines de surface est une méthode de liaison des protéines de la membrane plasmique avec la protéine appelée biotine. Son principe repose sur l'utilisation d'une biotine couplée à un réactif soluble se liant à pH 8.0 aux résidus lysine des protéines (Sulfo- NHS). La forte affinité de la biotine pour la streptavidine/neutravidine est ensuite utilisée afin de marquer ou d'isoler les protéines biotinylées. Durant cette étude, deux types de biotinylation ont été réalisées. La première permet créer une liaison covalente irréversible entre la biotine et le complexe Sulfo-NHS/protéine à l'aide du composé "Sulfo-NHS-LC-Biotin" (Pierce). L'ensemble sera marqué par une streptavidine couplée à un fluorochrome. La seconde nécessite l'emploi du composé "Sulfo-NHS-SS-Biotin" (Pierce) dont la liaison disulfure entre la biotine et le complexe Sulfo-NHS/protéine est réductible. Cela permettra, après leur liaison à des billes de neutravidine-agarose, de séparer les protéines membranaires isolées de la biotine afin de les faire migrer par électrophorèse [voir Figure 33].

Figure 33: Représentation schématique des méthodes de biotinylation irréversible (à gauche) et réversible (à droite) des protéines de surface à l'aide de la Sulfo-NHS-Biotine

En pratique, 48 heures après transfection les HEK293T sont placées 30 minutes dans leur milieu à 4 °C afin d'abolir toute fluidité membranaire, puis sont lavées 3 fois dans un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) froid au pH 8.0 contenant 100 mM de CaCl2 et 1 mM de MgCl2 (PBS++). Les cellules sont ensuite incubées 1 heure à 4 °C dans du PBS++ pH 8.0 contenant 1.5 mg/ml de Sulfo-NHS-Biotin. La biotine en excès est rincée 1 heure à 4 °C dans du PBS++ pH 8.0 + 3 % BSA, puis les cellules sont lavées 3 fois 5 minutes à 4 °C au PBS++.

3. Extraction et dosage des protéines totales et biotinylées

Les protéines ont été extraites de cellules HEK293T transfectées depuis 48 heures. Les cellules sont incubées 10 minutes à 4 °C dans un tampon de lyse au pH 7.4 contenant (en mM) 150 NaCl, 50 Tris-HCl, 1 EDTA ainsi que 1 % de NP-40, 0.2 % de SDS et le mix d'inhibiteurs de protéases "Complete EDTA Free protease inhibitor mix" (Sigma-Aldrich). Elles sont ensuite lysées mécaniquement et les protéines des extraits cellulaires sont solubilisées par agitation à 4 °C sur roue durant 30 minutes dans la solution de lyse. Les extraits sont alors centrifugés à 5000 g durant 10 minutes à 4 °C. Les surnageants protéiques sont récupérés, dosés par spectrophotométrie à l'aide du kit "BCA Protein Assay quantification kit" (Pierce) et d'une gamme étalon de BSA, puis stockés à -80 °C avant utilisation.

L'extraction des protéines issues des cellules HEK293T biotinylées est effectuée après leur dernier lavage au PBS++ à 4 °C. L'extraction est réalisée comme en l'absence de biotininylation mais avec une solution de lyse contenant (en mM) 50 Tris-HCl, 2 EDTA, 2 EGTA, 30 NaF, 30 NaPPi ainsi que 1 % de Triton-X100, 0.1 % de SDS et le mix d'inhibiteurs de protéases. Les extraits cellulaires sont centrifugés durant 3 minutes à 15.000 g puis les surnageants sont dosés comme indiqué précédemment. Les protéines biotinylées (de surface) sont isolées des protéines non-biotinylées (intracellulaires) à l'aide de billes d'agarose couplées à la neutravidine appelée "NeutrAvidin–agarose beads" (Pierce). La neutravidine, dérivée de la streptavidine, a une forte affinité à pH neutre pour la biotine. Pour cela, 110 μl de billes sont préalablement lavés puis dilués dans 500 μl d'une solution TLB contenant (en mM): 50 Tris HCl, 100 NaCl, 5 EDTA et le mix d'inhibiteurs de protéases. À cette solution, 100 μg de protéines totales sont ajoutées et l'ensemble est mis sous agitation constante pendant 16 heures à 4 °C. Durant cette étape, la neutravidin-agarose se lie à la biotine. Ensuite, la solution est centrifugée 2 minutes à 2500 g de façon à culoter les billes d'agarose. Le surnageant de protéines intracellulaire est jeté, les billes associées aux protéines biotinylées sont lavées et resuspendues dans la solution TLB. Après 6 cycles de lavage/centrifugation/resuspention, les billes sont incubées 10 minutes à 95 °C dans 50 μl du tampon Laemmli L2X pur utilisé en Western blot et vortexées. Cette incubation dans un milieu réducteur à chaud clive le pont disulfure du Sulfo- NHS-SS-Biotin [voir Figure 33], séparant les protéines biotinylées des billes d'agarose et de la biotine. La préparation est centrifugée une dernière fois 2 minutes à 2500 g puis le surnageant contenant les protéines biotinylées (de surface) est conservé à – 80 °C jusqu'à utilisation.

4. Analyse des échantillons protéiques par Western blot

Les protéines sont dénaturées par incubation 10 minutes à 95 °C dans 1 volume de tampon Laemmli L2X contenant 125 mM de Tris-HCl pH 6.8, 5 % de SDS, 2.5 % de β- mercapto-ethanol, 13.6 % de sucrose et 0.0125 % de bleu de bromophénol. Le mélange visible et dense permet de déposer 20 μg de protéines totales ou 35 μl de protéines biotinylées au fond du puits d'un gel de polyacrylamide à 10 % contenant du SDS. Les protéines sont séparées dans ce gel selon leur taille par électrophorèse puis sont transférées à 4 °C par électrophorèse liquide sur une membrane de nitrocellulose. Enfin, un immunomarquage du tag HA de ClC-5 et de la β-actine (qui sert de témoin de dépôt des protéines dans les puits) est réalisé sur la membrane. Pour cela, la membrane est saturée 1 heure sous agitation dans un tampon TBS (Tris Buffer Saline) contenant 0.2 % de NP-40 et 5 % de protéines de lait de vache déshydratées. La membrane est alors incubée dans cette solution contenant un anticorps primaire (une nuit à 4 °C) puis contenant un anticorps secondaire couplé à la HRP (1 heure à température ambiante). Après chaque incubation la membrane est lavée 3 fois 15 minutes dans du TBS + 0.2 % NP-40. Enfin, les complexes immuns sont révélés par chimioluminescence en chambre noire à l'aide de l'"ECL Western Blotting Substrate" (Pierce) et quantifiés à l'aide du logiciel Imagej. Les anticorps utilisés pour révéler le tag HA de ClC-5 sont le rat anti-HA 3F10 à 0.67 μg/ml (Sigma- Aldrich) et le chèvre anti-rat HRP 112-035-062 à 0.08 mg/ml (JacksonImmunoresearch).

5. Immunofluorescence indirecte sur les cellules HEK293T

L'immunofluorescence est réalisée sur des cellules transfectées 48 heures (et si besoin biotinylées) sur des lamelles de verres tapissées de Poly-L-Lysine. Les cellules sont lavées au PBS, fixées 15 minutes au PBS + 4 % de PFA (paraformaldéhyde) puis perméabilisées 1 minute dans du PBS + 0.1 % Triton-X100 + 0.1 % BSA. Les sites de liaison non-spécifiques des anticorps sont saturés 30 minutes par incubation des cellules dans une solution de blocage contenant (en mM): 20 Na2HPO4, 450 NaCl, 0.1 % de Triton-X100 et 10 % de sérum de chèvre (Sigma-Aldrich). Les cellules sont alors incubées 1 heure dans cette solution supplémentée avec l'anticorps de souris anti-HA H3663 (Sigma Aldrich) et/ou de lapin anti-EEA1 Ab2900 (Abcam) à 5 μg/ml. Après lavage au PBS, les cellules sont incubées avec des anticorps anti- lapin et/ou anti-souris couplés à des fluorochromes et si besoin de la streptavidine fluorescente (ThermFischer, 1:200ème) liant la biotine. Après lavage au PBS, les lamelles sont montées sur lame au Glycergel (DAKO) et observées au microscope confocal LSM710 (Zeiss).