L’exploration par imagerie TEP-scan sur petit animal, réalisée dans l’unité Inserm U1253 à Tours, a permis de visualiser à 11 mois les dépôts amyloïdes et un marqueur de la neuroinflammation, le TSPO (18 kDa Translocator protein) dans différentes régions du cerveau des souris APPswePS1dE9 avant leur euthanasie. Le TEP-scan, utilisé à la fois pour le diagnostic et le suivi de maladies du SNC ainsi que dans des modèles animaux de ces affections, associe l’injection d’un produit radioactif visible en imagerie et la prise d’images par un scanner. Ainsi, deux
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radiotraceurs ont été utilisés dans cette étude, le [18F]Florbetaben, qui permet de visualiser les dépôts amyloïdes, et le [18F]DPA-714 qui cible la TSPO, un récepteur situé dans la membrane externe des mitochondries dont l’augmentation est considérée comme une caractéristique de l'activation microgliale. La TSPO est une cible pertinente pour l'imagerie de l'inflammation cérébrale car elle n'est que modérément exprimée dans le parenchyme cérébral normal, mais est considérablement augmentée lors d’un processus neuroinflammatoire (Hommet et al., 2014).
Figure 35 : μPET SUPER ARGUS de l’unité Inserm U1253, Tours
Pour réaliser ces explorations, les souris du volet 1 ont été transportées depuis Poitiers jusqu’au laboratoire de Tours par un transporteur agréé, puis prises en charge par le Dr Sylvie Chalon et ses collaborateurs. La proximité d’un cyclotron produisant le fluor 18 associé à une structure de radiochimie dédiée à la préparation des traceurs, le centre d'études et de recherches sur les radiopharmaceutiques (CERP), permet la réalisation de l’imagerie rapidement, ce qui est indispensable car la demi-vie du fluor 18 est très courte (109,77 min). Après 1 semaine d’adaptation, chaque souris a été explorée à l’aide des 2 traceurs, avec un délai d’au moins 3 jours entre chaque étude permettant la décroissance de la radioactivité, selon le protocole décrit dans Sérrière et al. (Sérrière et al., 2015). Les animaux ont reçu une injection intraveineuse de [18F]Florbetaben ou [18F]DPA-714 à la dose de 15-20 MBq dans la veine caudale sous anesthésie à l’isoflurane. Une tomodensitométrie a d'abord été acquise pendant 5 min pour la correction de l'atténuation, puis les animaux ont été scannés pendant 61 min en utilisant le système PET du Super Argus. Les acquisitions TEP ont été regroupées en 33 images séquentielles et les 30 dernières minutes d'acquisition ont été extraites pour la reconstruction, puis analysées à l'aide du logiciel PMOD (3.403, PMOD Technologies, Zurich, Suisse). Ensuite, une analyse basée sur le voxel correspondant à l’intensité de chaque pixel volumétrique a été utilisée pour évaluer les différences de liaison des radiotraceurs entre les cerveaux des souris traitées selon une méthode décrite dans Nicolas et al. (Nicolas et al., 2017).
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1.8
Analyses biochimiques
Plusieurs analyses biochimiques durant cette étude ont été réalisées. Toutes ces techniques de western blot, d’immunofluorescence et d’ELISA sont très utilisées en biologie et leur description a été intégrée dans les articles ci-après et donc ne seront pas détaillées dans cette partie.
2 Etude in vitro
Dans cette étude, divers polyphénols ont été utilisés pour rechercher leur éventuel effet sur le métabolisme de l’APP dans un modèle cellulaire de la MA. Le niveau d’expression et l’activité des différentes sécrétases impliquées dans les deux voies de dégradation de l’APP ont été quantifiés par des techniques biochimiques, le western blot et des tests enzymatiques utilisant des substrats spécifiques. Le taux d’expression des produits résultant de l’activité des sécrétases (α, β et γ) a également été évalué par western blot (C83, C99 et NOTCH1 clivé respectivement).
2.1
Polyphénols utilisés
Le resvératrol et la trans ε-viniférine, fournis par le Pr Jérôme Guillard (IC2MP, UMR CNRS
7285, Poitiers), sont les mêmes molécules que celles utilisées pour l’étude in vivo. La gnétine C a été gracieusement fournie et envoyée par Yasuro Suzuki de la société japonaise Hosoda SHC. La quercétine, la myricétine et l’EGCG ont été achetées chez le fournisseur Sigma-Aldrich.
2.2
Modèle SH-SY5Y
APPsweLa lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y est un modèle très utilisé en neuroscience. Dans notre étude, nous avons utilisé les cellules SH-SY5YAPPswe, qui nous ont été gracieusement fournies par le Dr Frédéric Checler, directeur de recherche à l’institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire (IPMC) à Nice. Ces cellules expriment le gène APP695 comportant la mutation « swedish » et la protéine codée par ce gène. Cette mutation est responsable de l’augmentation de l’expression de l’APP ainsi que des niveaux d’Aβ1-40 et Aβ1-42. Pour cela, les cellules SH-SY5Y ont été transfectées de manière stable avec un plasmide comportant la séquence codante de ce gène, associée à un gène de résistance à la généticine et un clone a été sélectionné grâce à cet antibiotique. Durant leur culture, l’utilisation d’une faible concentration de généticine permet de maintenir la pression de sélection.
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2.3
Le traitement
Les cellules SH-SY5YAPPswe ont été traitées par l’un des 6 polyphénols à la concentration de 20 µM pendant 24 heures. Cette concentration est non toxique pour les cellules et a été choisie en fonction des données de la littérature. Le dantrolène, à la concentration de 10 et 50 µM a été utilisé dans cette étude comme contrôle positif en tant qu’inhibiteur de la β-sécrétase. En effet, cette molécule a été décrite comme induisant une réduction du fragment C99 et de la production d’Aβ1-42 dans les cellules SH-SY5YAPPswe (Oulès et al., 2012).
Seuls la viniférine et le resvératrol ont été utilisés pour étudier leurs effets sur l’activité enzymatique des α- et β-sécrétases à l’aide de kits enzymatiques utilisant des substrats spécifiques, commercialisés, par Eurogentec et Enzo life sciences respectivement.
2.4
Analyses biochimiques
Les anticorps utilisés pour révéler le niveau d’expression des sécrétases ADAM 10 et BACE 1, ainsi que celui de leurs produits d’activité sont répertoriés dans la table 5.
Anticorps
Fournisseur
Référence
Dilution
ADAM10 Cell signaling 14194 1/500
BACE1 Ozyme 5606S 1/1000
C83 Sigma-Aldrich A8717 1/1000
C99 Sigma-Aldrich A18717 1/1000
NOTCH1 clivé Cell signaling 3608S 1/1000
Table 5 : Liste des anticorps utilisés dans l’étude in vitro
Le principe des kits enzymatiques pour mesurer l’activité des sécrétases est le suivant : le substrat synthétique, dont la séquence est reconnue spécifiquement par la sécrétase étudiée, est marqué à ses deux extrémités par deux fluorochromes, appelés EDANS et DABCYL. Lorsque le substrat n’est pas clivé, la fluorescence d’EDANS n’est pas émise à 495 nm (longueur d’onde de détection) en raison de la proximité du fluorochrome DABCYL. Le clivage du substrat par la sécrétase conduit à une séparation physique d’EDANS et de DABCYL, permettant l’émission de la fluorescence du fluorochrome EDANS. L’intensité de fluorescente émise est proportionnelle à l’activité de la sécrétase (figure 36).
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Figure 36 : Principe de détection de l’activité enzymatique des sécrétases
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