Analyse et représentation des résultats sur la viabilité cellulaire

Aucun effet bord n’a été observé dans cette étude. Nous avons donc gardé les DO obtenus dans la totalité des puits.

Toutes les DO ont été normalisées par rapport au contrôle. Pour chaque répétition d’expérience (N), la moyenne des 4 répliquât a été calculée. Ensuite la moyenne obtenue pour chaque « N » a été calculée ainsi que l’écart type. Ces moyennes et ET des DO ont été représentées sur des graphiques de viabilité cellulaire, en fonction de chaque molécule (14). Les ET sont représentés uniquement par leurs valeurs positives. Les 6 lignées y sont à chaque fois représentées. Une ligne rouge horizontale passant par 10 % de viabilité cellulaire (90 % de mort cellulaire) est représentée. Nous avons également représenté la viabilité cellulaire par lignée, en fonction des différentes chimiothérapies. Sur l’axe des abscisses sont représentées les dilutions et non pas les valeurs exactes de concentration de chimiothérapie.

L’analyse spectrophotométrique est une analyse indirecte de la viabilité cellulaire. Parmi les chimiothérapies utilisées, certaines étaient colorées. De plus le RPMI est de couleur rouge. Nous avons donc calculé les DO des drogues pour chaque concentration (C Max et les dilutions avec le RPMI), ainsi que les DO du RPMI seul pour les contrôles, afin d’évaluer le bruit de fond

et permettre le calcul suivant. Seules les DO pour la C Max de la doxorubicine et les 2 premières dilutions ont été modifiées ainsi que les DO pour la C Max du Paclitaxel. La DO du RPMI seul était de 0,009. Ces expériences ont été réalisées 3 à 4 fois (N=3-4).

Les données dose-réponse ont été représentées selon un modèle de régression non linéaire à 4 paramètres, adapté selon l’équation de Hill (Hill 1910).

𝐷𝑂(𝑐) − 𝐷𝑂𝑏𝑎𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒(𝑐)

𝐷𝑂(0) = 𝛼 +

1 − 𝛽 1 + 𝑐𝛾𝛿

Dans cette équation c correspond à la concentration de la drogue, DO (𝑐) à la densité optique (DO) à la concentration de la drogue _{(𝑐) ; 𝐷𝑂𝑏𝑎𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒}(𝑐) correspond à la DO du RPMI et de la drogue seule et (𝛼, 𝛽, 𝛾, 𝛿) aux 4 paramètres estimés. La courbe dose-réponse du raltitrexed présentant une courbe à double plateau, les données du raltitrexed ont été analysées selon une courbe dose-réponse biphasique correspondant à la somme de 2 fonctions de Hill. Le logiciel de traitement de données, Matlab (MathWorks® ; R2018b ; Natick ; Etats-Unis) a permis de réaliser les courbes fitées et d’extraire les IC50 et IC90 qui correspondent à la

concentration de drogue nécessaire pour obtenir 50 et 90% de mort cellulaire respectivement. Ensuite, dans le but de pouvoir comparer les drogues entre elles, nous avons, comme pour les UM, calculé les index de cytotoxicité des drogues pour les IC90, selon la définition de Boulin et al.(Mathieu Boulin et al. 2011). Pour chaque lignée cellulaire, la moyenne des CyI90 était

testée avec une ANOVA à un facteur. Dans le cas de variance significative, un test de comparaisons multiples (post-hoc) était réalisé (HSD Tukey). Une valeur de p<0,05 était considérée comme significative. Les résultats ont été représentés pour chaque lignée (6) sous forme d’histogramme. En cas significativité un astérisque * était positionné entre les conditions concernées. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Statistica (TIBCO® Software ; 13.4.0.14; Palo Alto ; Etats-Unis). Les lignées ont également été regroupées pour la même analyse afin d’obtenir éventuellement la meilleure drogue quelle que soit la lignée.

IV. RESULTATS de l’étude 7

On rappelle ici que les dilutions des drogues sont basées sur une dilution au tiers. Sont représentées ci-dessous les courbes de viabilité cellulaire pour le lipiodol et le bevacizumab (figures 83 et 84).

Figure 83 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le lipiodol. Analyse de la viabilité à J4.

Caco2 HCT 116 HT 29 SW 48 SW 480 SW 620

Figure 84 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le bevacizumab. Analyse de la viabilité à J4

On observe ici, même aux concentrations les plus élevées, une toxicité quasi nulle en dehors du bevacizumab sur CaCO2à la concentration maximale. L’effet plateau est précoce. Il

n’existe pas d’effet dose.

Ci-dessous, sont représentées les courbes de viabilité cellulaire pour les drogues les plus utilisées dans le traitement systémique du CCR et notamment dans le protocole FOLFOX 4 soit le 5-FU et l’oxaliplatine (figures 85 et 86).

Figure 85 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le 5-FU. Analyse de la viabilité à J4.

Figure 86 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec l’oxaliplatine. Analyse de la viabilité à J4

Les lignées HCT 116 et CaCO2 sont rapidement résistantes au 5-FU et à l’oxaliplatine avec

un effet dose. La lignée HCT 116 est rapidement résistante à l’oxaliplatine. Pour les autres lignées, on note un effet cytotoxique maintenu sur les 4 premières concentrations avec le 5- FU alors qu’avec l’oxaliplatine, on note un effet dose après les 2 premières dilutions.

L’irinotecan, drogue utilisée pour le traitement par TACE aux billes chargées est présenté ci-dessous (figure 87). L’irinotecan est également la chimiothérapie associée au 5-FU dans le protocole systémique FOLFIRI.

Pour l’irinotecan, on note un effet dose marqué après 2 dilutions et ce pour toutes les lignées. La lignée Ca CO2 est toujours la plus résistante.

L’idarubicine (figure 88) était la chimiothérapie la plus cytotoxique sur les tests in-vitro sur lignées cellulaires de CHC, avec un temps de contact identique (30 minutes).

Figure 87 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec l’irinotecan. Analyse de la viabilité à J4

On observe une particulière sensibilité des lignées SW48 et SW620 à l’idarubicine. On note 90 % de mort cellulaire encore après 7 dilutions de la chimiothérapie sur ces 2 lignées. Il est important de noter que la survie de toutes les lignées est quasiment nulle pour les 4 premières concentrations. Deux effets doses sont observés, le premier après la 3 ème _dilution

avec néanmoins une prolifération cellulaire qui ne dépasse pas 50 %, suivie d’un effet cytotoxique sur les 2 concentrations suivantes. Puis le 2 ème _{effet dose cette fois plus évident}

avec une prolifération cellulaire nette notamment sur 2 lignées (CaCO2 et SW480). On souligne

ici l’effet de chimiorésistance modérée suivi d’un nouvel effet cytotoxique, que l’on va nommer « effet rebond »

Intéressons-nous maintenant à la chimiothérapie la plus utilisée dans le monde pour la TACE, la doxorubicine (figure 89).

Figure 88 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec l’idarubicine. Analyse de la viabilité à J4.

Là encore, les lignées CaCO2 et HCT 116 ont des profils rapidement résistants à la

doxorubicine. Un effet dose est observé pour la quasi-totalité des lignées à partir de la 4ème

dilution. Entre la 4ème _{dilution et la C Max, les courbes sont très différentes en fonction des}

lignées, avec déjà 3 lignées (CaCO2, HT29 et HCT116) pour lesquelles on observe moins de 90

% de mort cellulaire à la 1ère _dilution.

Pour l’épirubicine (figure 90), le profil de réponse est assez proche de celui de la doxorubicine (figure 89).

Figure 89 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec la doxorubicine. Analyse de la viabilité à J4.

Figure 90 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec l’épirubicine. Analyse de la viabilité à J4.

La Mitomycine C (figure 91), elle aussi, est superposable à la doxorubicine et à l’épirubicine, toujours avec les lignées CaCO2 et HCT 116 les plus résistantes et un effet dose

à partir de la 3ème _dilution.

Voyons maintenant l’effet de la gemcitabine (figure 92) et du raltitrexed (figure 93).

Figure 91 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CC, mises en contact 30 minutes à J1 avec la mitomycine C. Analyse de la viabilité à J4.

Figure 92 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec la gemcitabine. Analyse de la viabilité à J4.

Pour ces 2 chimiothérapies, les courbes sont très dissociées en fonction du type cellulaire. Les sensibilités sont différentes en fonction des lignées. L’effet plateau est étendu sur la quasi-totalité des dilutions. On notera un effet intéressant de la gemcitabine sur SW 620 et SW 48 sur les 5 concentrations les plus élevées. En revanche, après une dilution, on note un effet dose avec le raltitrexed suivi d’une phase de plateau, quelle que soit la lignée.

Le cisplatine, également relativement fréquemment utilisé en TACE, est présenté ci- après (figure 94).

Figure 93 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le raltitrexed. Analyse de la viabilité à J4

Figure 94 : Courbe de viabilité des 6 lignées de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le cisplatine. Analyse de la viabilité à J4.

Un effet dose marqué (figure 94) est observé à partir de la 2ème _{dilution. Les lignées}

HCT 116 et CaCO2 sont les plus résistantes au cisplatine. Après l’effet-dose, le plateau est

rapidement atteint avec un effet cytotoxique modéré (moins de 50 % de mort cellulaire) dès la 4ème dilution. Mêmes aux plus fortes concentrations, le seuil de 90 % de mort cellulaire n’est pas atteint sur CaCO2, HCT 116, HT29 et SW 480.

Pour la streptozocine (figure 95), une drogue de référence dans les TNE, l’effet est important (mort cellulaire à plus de 90 %) sur la C Max et la 1ère _{dilution. En revanche après la}

1ère _{dilution, on note un effet dose très important donnant lieu à un plateau rapidement}

atteint.

Figure 95 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec la streptozocine. Analyse de la viabilité à J4.

Les courbes de survie cellulaire pour le paclitaxel sont très intéressantes sur les 2 premières concentrations avec une mort cellulaire majeure (plus de 90 %) sur toutes les lignées sauf HCT 116 et SW 620.

En revanche, on observe un effet-dose à partir de la 4ème _{concentration, avec un pic de}

viabilité cellulaire pour SW480 (figure 96). Un peu comme pour l’idarubicine, on observe un effet rebond, net sur SW480, avec une hyperprolifération cellulaire (+250 %) et sur SW 48. Pour SW48, on note un effet cytotoxique majeur après 6 dilutions, maintenu pendant 3 dilutions, puis un nouvel effet dose. On notera que pour toutes les lignées (en dehors de SW48, au profil très différent), on observe plus de 50 % de viabilité cellulaire après 3 dilutions.

Figure 96 : Courbe de viabilité des 6 lignées cellulaires de CCR, mises en contact 30 minutes à J1 avec le paclitaxel. Analyse de la viabilité à J4.

Nous allons maintenant présenter les courbes de viabilité cellulaire par lignée cellulaire (figures 97 à 102). Par soucis de clarté, nous avons retiré le lipiodol et le bevacizumab, qui ne présentaient pas de courbes de toxicité très intéressantes.

5-FU Cisplatine Doxorubicine

Epirubicine Gemcitabine Idarubicine

Irinotecan Mitomycine C Oxaliplatine

Paclitaxel Raltitrexed Streptozocine

d