Les PCR classiques ont été réalisées avec l‘ADN polymérase dérivant de celle de Thermus aquaticus YT-1 et clonée chez E. coli et (Biolabs). Cette enzyme ne possède aucune activité exonucléasique 3’-5’ ce qui permet d’augmenter le rendement de la
réaction. Elle présente de ce fait un taux d'erreur de
3.10-4 substitutions.position-1.réplication-1. Ceci permet d'amplifier des fragments allant jusqu'à une taille d'environ 2 kb. En effet, les erreurs provoquées par l’enzyme induisent des arrêts fréquents de la synthèse ce qui empêche l’amplification efficace
97 de plus grands fragments. Le mélange réactionnel (volume final de 25 µL) comprenait l'ADN matrice (100 ng), les dNTP (250 µM), les oligonucléotides servant d'amorces (0,8 µM pour chacun), le tampon 1X et 0,25 unité d’ADN polymérase.
Les PCR nichées ont été réalisées en deux étapes. La première correspond à une PCR classique, excepté pour le nombre de cycles qui est réduit à 25. Ensuite, une seconde PCR est réalisée utilisant comme matrice le produit de la première ; les amorces utilisées sont internes au premier fragment. Cette technique permet d’amplifier des fragments d’ADN à partir de quantités d’ADN beaucoup plus petites qu’une PCR classique tout en évitant la présence d’amplicons indésirables liée au nombre de cycle trop important après une PCR classique. Tous les fragments obtenus par PCR nichée ont été vérifiés par séquençage.
Les conditions de PCR utilisées au cours de ce travail ont été les suivantes. Après une dénaturation initiale de 4 min de l'ADN à 95°C, 30 cycles ont été réalisés. Chacun de ces cycles comprenait une dénaturation de l’ADN pendant 30 s à 95°C, une fixation de amorces sur l'ADN matrice pendant 30 s à une température dépendant du couple d’oligonucléotides (5°C en dessous du Tm ou température de fusion des amorces). Chaque cycle se terminait par une extension à 72°C dont la durée dépendait de la taille du fragment à amplifier et de la processivité de la polymérase (1 kb/min). A la suite des 30 cycles, une extension finale de 7 min à 72°C a été effectuée, permettant l'élongation des brins partiellement synthétisés.
Enfin, l’ADN polymérase Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo
Scientific) enzyme de Pyrococcus sur laquelle a été ajouté un domaine de processivité
amélioré, a été utilisée pour les amplifications à haute fidélité. Elle possède une activité exonucléasique de 3' vers 5' ce qui diminue son taux d'erreur (4,4.10-7). Ceci augmente la fidélité de la réplication et permet l'amplification de fragments plus longs. Le mélange réactionnel (volume final de 50 µL) comprenait l'ADN matrice (200 ng), les dNTP (200 µM pour chaque), les amorces (0,5 µM pour chacune), Phusion HF Buffer 1X (tampon haute fidélité) et 1 U d’enzyme.
Les conditions de PCR utilisées avec la Phusion DNA Polymerase étaient les suivantes : après une dénaturation initiale de 30 s de l'ADN à 98°C, 30 cycles ont été
réalisés. Chacun de ces cycles comprenait une dénaturation de l’ADN de 10 s à 98°C,
une fixation de amorces sur l'ADN matrice pendant 30 s à une température dépendant du couple d’oligonucléotides (3°C au dessus du Tm ou température de fusion des amorces). Chaque cycle se terminait par une extension à 72°C dont la
98 durée dépendait de la taille du fragment à amplifier et de la processivité de la polymérase (30 s/kb). A la suite des 30 cycles, une extension finale de 10 min à 72°C a été effectuée, permettant l'élongation des brins partiellement synthétisés.
Les séquences des différentes amorces de synthèse, choisies pour avoir des températures de fusion proches, sont présentées dans le tableau 4. Toutes les amorces ont été dessinées grâce au logiciel Vector NTI version 10. Les températures de fusion, l’auto-complémentarité et la formation des dimères d’amorces lors des PCR ont été estimées via le même logiciel.
99 Tableau 4 : Caractéristiques des oligonucléotides utilisés au cours de ce travail
Amorceb Séquencea (5’-3’) Utilisation
ICE2603Lys1 (A) CAACTCTCTTAGTCATCGGT Détection du site attI d’ICE_2603_tRNALys (PCR nichée)
ICE2603Lys2 (B) GAGTAATACCTGAACCAACAA Détection du site attI d’ICE_2603_tRNALys (PCR nichée)
ICE2603Lys3 (C) AGGAATATGAAACGGTCAG Détection du site attI pour les 5 ICE putatifs et pour le tandem
CIME-ICE (PCR nichée)
ICE2603Lys4 (D) GCTCATATCATTTAGAATTGGT Détection du site attI pour 4 ICE putatifs (PCR nichée)
ICE2603Lys5 (E) GAAAGCCAAATCCTAAGTG Détection du site attI d’ICE_2603_tRNALys (PCR nichée)
ICE2603Lys6 (F) CACTAGTTCTTGTCCTCATCT Détection du site attI d’ICE_2603_tRNALys (PCR nichée)
ICE2603Lys7 (G) CTTCTAGAACAAATCTGCTGA Détection du site attI d’ICE_2603_tRNALys (PCR nichée)
ICE2603Lys8 (H) CAGACAGCAACCTATCCA Détection du site attI pour les 5 ICE putatifs (PCR nichée)
attRtRNALys515 (I) GAACAAATCTGCTGAAAC Détection du site attI des ICE intégrés à l’extrémité 3’ de
l’ARNtLys des souches 515, COH1 et 18RS21 ainsi que pour le
tandem CIME-ICE (PCR nichée)
attL LMG1 (H’) CAATTGATGACACTACTTAAC Détection du site attI d’ICE_2603FSL S3-026_tRNALys (PCR
nichée)
attL LMG2 (D’) CCCTCTTAAACACCTAATCAC Détection du site attI d’ICE_2603FSL S3-026_tRNALys (PCR
nichée)
SAG2026-1-HindIII (J) AAAAAAAGCTTCATTCCATTTAATAACC
ATC S. agalactiaeAmplification d’un fragment du gène SAG2026 de , détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys et test des transconjugants putatifs
SAG2026-2-AvrII AAAAACCTAGGTCACTCGTTGTTCTACA
GTA
Amplification d’un fragment du gène SAG2026 de S. agalactiae
SAG2026-3-AvrII (T) AAAAACCTAGGAAATAGTGAATATCCCC
100
SAG2026-4-EcoRI AAAAAGAATTCTGTTAGGATTGGAGTTT
AG Amplification d’un fragment du gène SAG2026 de et test des transconjugants putatifs S. agalactiae
intICESa03 Fwd (K) AAGCGTGAAGCTATGAATGA Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
SAG1986 Fwd (L) TCTCAAATCAGACCTAGTGA Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
SAG1986 Rev (M) CCTTATCAGCAATAGCCA Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
SAK1967Rev (N) GGAAAGCTCGACAAGGATATCT Détection du site attB chez S. agalactiae (PCR nichée)
attBRev (O) CCAATACAGCTTCCTAGCC Détection du site attB chez S. agalactiae (PCR nichée)
Gbs1987Fwd (P) CAAGGAGAATACCAATCAGC Détection du site attB chez S. agalactiae (PCR nichée)
tRNALys (Q) TCTTAATCTATGGGTCACAG Détection du site attB chez S. agalactiae (PCR nichée)
attICIMENem (R) ATTACAATTGTTCTTGGGCT Détection du site attI des tandems CIME-ICE (PCR nichée)
attI2CIMENem (S) TCTTCATTCCATCTCCACT Détection du site attI des tandems CIME-ICE (PCR nichée)
gbst014-064 Fwd CAGTTGGTAGAGCAATTGACTT Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
tRNAMet Rev GTATGAACCGGACGCTCT Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
tRNA16S Rev TCAGCGTTCTACTTGCATG Détection du site d’intégration d’ICE_515_tRNALys
Sod-d1 CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC Amplification du gène sodA
Sod-d2 ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC Amplification du gène sodA
Ery Fwd TCAGGATCCTCTAGAGTCGC Amplification du gène ery
Ery Rev Ter GCGACTCTAGAAAAAACAAGATCCTTTCT
GGATCTTGTTTTTGCTAGGGACCTCTTTAG
CTC
Amplification du gène ery, le terminateur est en italique
a Les sites de restriction introduits dans les oligonucléotides sont soulignés
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