INTRODUCTION
En janvier 2001, l’ATPase NSF qui semblait dévouée à la seule modulation des SNARE pendant les évènements de fusion membranaire, se voit impliquée dans la régulation de la fonction des récepteurs au glutamate et plus particulièrement du GluR2 (Nishimune et al., 1998; Noel et al., 1999; Osten et al., 1998; Osten and Ziff, 1999; Shi et al., 2001). En septembre de la même année, un récepteur supplémentaire est ajouté à la liste des substrats de cette chaperone des complexes protéiques, le récepteur β2-adrénergique (Cong et al., 2001). Complétant des observations préalables identifiant NSF comme un partenaire de la β-arrestin 1 (McDonald et al., 1999), cette étude conduit à l’hypothèse d’un rôle pour NSF dans le recyclase du β2AR à l’issu de sa désensibilisation et de son internalisation. Une fonction similaire de NSF a part la suite été observée dans le cas du récepteur GluR2 (Hanley et al., 2002; Lee et al., 2004b) et plus récemment dans le cas du récepteur CRLR (Bomberger et al., 2005b). En termes moléculaires, la fonction de NSF dans le cas du GluR2, semble résider dans son habileté à moduler l’interaction du récepteur et d’une protéine à domaine PDZ, PICK-1 (Hanley et al., 2002). Ce faisant, NSF favorise la stabilisation de l’expression à la surface de GluR2 avant (Noel et al., 1999; Shi et al., 2001) et à l’issu de son internalisation (Lee et al., 2004b).
La mise en évidence par le Dr Julia White lors d’expériences de double hybride, d’une interaction potentielle entre GABABR et la protéine NSF, suggérait donc que
cette AAA ATPase puisse également réguler l’activité de ce récepteur. Différentes propriétés du récepteur GABAB en faisait en outre un modèle d’étude
particulièrement intéressant : 1) tout d’abord son statut d’hétérodimère obligatoire, composé de deux récepteurs distincts, GBR1 et GBR2, interagissant au niveau d’une structure coiled coil cytosolique 2) sa capacité d’interaction avec un grand nombre de partenaires de signalisation impliqués dans des cascades de signalisation différentes correspondant aux effecteurs adenylyl cyclase, GIRK, Canaux calcique ou encore PLC (Calver et al., 2002; Couve et al., 2001; Vernon et al., 2001; White et al., 1998; White et al., 2000); 3) enfin, la mise en évidence de sa localisation préférentielle dans des microdomaines de type rafts (Becher et al., 2001). L’ensemble de ces
observations semblaient donc suggérer que l’interaction de NSF et du récepteur GABAB puisse constituer un terrain d’étude adéquat pour étudier les effets
fonctionnels de la modulation des interactions protéiques de ce récepteur par la protéine NSF. Les publications antérieures à ce projet semblaient indiquer que cette régulation puisse être impliquée dans les mécanismes de transport membranaire du récepteur GABAB. Cette hypothèse a néanmoins rapidement perdu de son attrait en
raison de la surprenante stabilité du récepteur à la membrane plasmique (Fairfax et al., 2004; Perroy et al., 2003).
Outre la confirmation et la caractérisation par des expériences de liaison in vitro et de co-imunoprécipitation de l’interaction de NSF et du récepteur GABAB, notre
étude s’est intéressée au rôle fonctionnel de la liaison de ces deux protéines. Les données expérimentales obtenues positionnent ainsi NSF, au sein d’un mécanisme moléculaire dépendant de la protéine kinase C et régulant l’efficacité de couplage du GABABR.
Participation des différents auteurs de la publication N°2 :
SP: Conceptualisation du projet, expériences (Fig 2-9), stratégie expérimentale, analyse des résultats et écriture du papier
NL : Expériences de phosphorylation (Fig 8C et D) HB : Expériences de coIP (Fig 3A, 4A, 6A)
JW: Expérience de YTH (Fig 1)
PUBLICATION N°2 (en préparation pour EMBO Journal)
NSF BINDING TO GABAB RECEPTOR REGULATES SIGNALING EFFICACY THROUGH CONCERTED ATPASE AND PKC ACTION
Stéphanie M. Pontier1, Nicolas Lahaie1, Hélène Bonin1, Julia H White2 and Michel Bouvier1,3
1Département de Biochimie and Groupe de Recherche sur le Système Nerveux
Autonome, Université de Montréal, Montréal, Qc, Canada, H3C 3J7.
2Pathway Discovery, Genomics and Proteomic Sciences, GlaxoSmithKline Medicines
Research Centre, Gunnels Wood Road, Stevenage, UK.
3To whom correspondence should be addressed: email: michel.bouvier@umontreal.ca
Running title: NSF regulates GABAB receptor signaling efficacy
Key words: GABAB/ heterodimer/ NSF/ PKC/ desensitization
Subject categories: Signal transduction
Abstract
The obligatory heterodimerization mode of activation of the GABAB receptor
(GBR) raises fundamental questions about the molecular mechanisms controlling its signaling efficacy. Here, we show that the AAA ATPase, NSF, interacts directly with GBR and is released following agonist stimulation of the receptor. Inhibition of NSF binding using peptides derived from the NSF interacting domain of GBR2 or GluR2 did not affect basal signaling activity but almost completely abolished GBR desensitization. The agonist-promoted receptor phosphorylation and desensitization could also be blocked by PKC inhibition indicating a concerted action of the ATPase and PKC in regulating the signaling efficacy of GBR. Such model, is further supported by the observation that direct PKC activation led to NSF release from GBR and mimicked the agonist-promoted desensitization as revealed by the blunted baclofen-stimulated [35S]GTPγS binding observed following PMA treatment. Given the classical function of NSF in the regulation of protein complex assembly and the lack of agonist-promoted internalization accompanying GBR desensitization, our results suggest the existence of a novel regulatory role of NSF in GPCR signaling.
Introduction
Ionotropic and metabotropic receptors mediate the action of the inhibitory neurotransmitter γ-amino-butyric acid (GABA) in the central nervous system. The metabotropic GABAB receptor (GBR) consist of an obligatory heterodimer between
two homologous seven transmembrane domain (7TM) receptors, known as GBR1 and GBR2 (Jones et al. 1998;Kaupmann et al. 1998;Kuner et al. 1999;White et al. 2000). In addition to play a role in ER export(Couve et al. 1998;Margeta-Mitrovic et al. 2000), the GBR1/GBR2 heterodimerization is required for the formation of a functional receptor. Indeed, while only GBR1 can bind GABA, GBR2 appears to be the subunit engaging the heterotrimeric G protein for down-stream signaling (Galvez et al. 2001;Robbins et al. 2001;Margeta-Mitrovic et al. 2001). Such transactivation across two distinct 7TM receptors raises fundamental questions about the molecular mechanisms controlling their signaling efficacy.
Among the mechanisms controlling 7TM receptor activity, agonist-promoted desensitization is one of the best characterized at the molecular level. As for most receptors, sustained stimulation of GBR can lead to functional desensitization (Couve et al. 2002;Gonzalez-Maeso et al. 2003;Perroy et al. 2003;Tosetti et al. 2004). However, βarrestin recruitment to the receptor and the ensuing endocytosis of the complex, which are classically associated to agonist-promoted desensitization, do not appear to contribute to the regulation of GBR responsiveness (Perroy et al. 2003;Fairfax et al. 2004). We recently reported that a phosporylation-independent mechanism involving the G protein receptor kinase 4 (GRK4) can regulate GBR activity in the cerebellum (Perroy et al. 2003). However, the restricted expression pattern of GRK4, mainly found in testes and cerebellum (Sallese et al. 2000;Virlon et al. 1998), suggests that other mechanisms may modulate GBR signaling efficacy in other tissues. PKC activation has previously been shown to regulate GBR activity (Dutar and Nicoll 1988;Thompson and Gahwiler 1992)but its direct role in agonist- promoted desensitization has not been documented yet.
In an effort to identify new protein that could regulate receptor function, we performed a yeast two-hybrid screen using the GBR2 carboxyl tail as bait that