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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Najar, M. (2011). Propriétés immunomodulatrices des cellules stromales mésenchymateuses: mécanismes impliqués et comparaison des sources (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Sciences biomédicales, Bruxelles.
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Institut Jules Bordet
Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
Laboratoire d'Hématologie Expérimentale Institut Jules Bordet
ULB - Campus Erasme
Bibliothèque des Sciences de la Santé - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)
B- 1070 Bruxelles Tél.: 02/555.61.70
Propriétés immunomodulatrices des cellules stromales mésenchymateuses: mécanismes
impliqués et comparaison des sources
Promoteur :
Dr. Laurence Lagneaux
Université Libre de Bruxelles
NAJAR MEHDI
00347^ 1 BSS
Année académique 2010-2011
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en
Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
(Pfiotos couverture :
Colonies de lymphocytes
‘T
activés en présence ou non de cellules stromales mésenchymateusesInstitut Jules Bordet
Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
Laboratoire d'Hématologie Expérimentale Institut Jules Bordet
ULB-Campus Erasme
B-1070 Bruxelles Tél.'. 02/555.61.70
Propriétés immunomodulatrices des cellules stromales mésenchymateuses: mécanismes
impliqués et comparaison des sources
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
NA JAR MEHDI
Promoteur :
Dr. Laurence Lagneaux
Année académique 2010-2011
û Q
Je tiens, à Cissue de ce travaiC, à ej(primermes remerciements [es pCus sincères à ceCCes et à ceu\qui, de Coin ou de près, ont contriSué à sa réaCisation.
(Et en particuCier,
J4.uprofesseur<Pfii[ippe (Martiat, pour m’avoir accueiCCi au sein de son ùiBoratoire et permis de réaCiser ma thèse de doctorat.
Jiu (Docteur Laurence LagneaiuÇj à quij’ejçprime toute ma gratitîide pour avoir dirigé ce travaiC avec grande attention et enthousiasme. Ses remarques instructives,
ses discussions enrichissantes mais surtout sa disponiSiCité et sa Sonne humeur ont été des atouts dans CéCaSoration de cette thèse. (Merci Laurence d’avoir pu et su
supporter et sa susceptiSiCité...
ji (^douane (Rouas, toute ma reconnaissance pour avoir égaCement contriSué à ce travaiC avec dévouement. (Merci de m’avoir initié etfamiCiarisé avec Ce monde de
CimmunoCogie et surtout de m’avoir appris de nomSreuses techniques.
JLuocmemSres du CaSoratoire d(KématoCogie ToçpérimentaCe, mes remerciements Ces pCus sincères pour Ceur accueiC, Ceur aide et Ceurs encouragements.
j( toute Ca Sande de potes l Je n’ouSCierais pas ces Seawç^moments de fou rire, ces enrichissantes discussions et ces déCiciewç^repas qu’on a pu partager.
Ln dernier Cieu mais certes pas Ce moindre, mes remerciements et mes pensées sont adressés à toute mafamiCCe sans qui je ne serais pas arrivé à ce stade.
Lt pCus particuCièrement,
(Mon père qui pour moi est un modèCe à suivre (Mon grand frère qui a toujours été à mes cotés
(Ma petite sœur pour tout ce qu ’eCCefait Ma chère épouse pour avoir partagé cette aventure
!Nbtfiing is more stimuCatingfor a researcH wor^r tHan to 6e trappedin contradiction.
Jean (Brachet.
Dr. Laurence Lagneaux Prof. Alain Le Moine
Laboratoire d'Hématologie Expérimentale Institut d'immunologie Médicale (IMI)
Institut Jules Bordet Faculté de Médecine
Faculté de Médecine Université Libre de Bruxelles (ULB) Université Libre de Bruxelles (ULB)
Membres du Jury : Prof. Michel Braun
Institut d'hnmunologie Médicale (IMI) Faculté de Médecine
Université Libre de Bruxelles (ULB) Prof. Anne Demulder
Laboratoire d’Hématologie (Hôpital Brugmann) Faculté de Médecine
Université Libre de Bruxelles (ULB)
Prof. Eric Sariban
Unité d'Onco-Hématologie Pédiatrique
Hôpital Universitaire des Enfants Reine Fabiola Faculté de Médecine
Université Libre de Bruxelles (ULB)
Experts extérieurs :
Prof. Nathalie Rouas-Freiss
Service de Recherches en Hémato-Immunologie- CEA-DSV-PBM
Institut Universitaire d'Hématologie Hôpital Saint Louis
Paris, France Prof. Etienne Sokal
Laboratoire d’Hépatologie Pédiatrique et Thérapie Cellulaire
Faculté de Médecine
Université Catholique de Louvain (UCL)
BrdU : 5-Bromo-2-deoxyUridme CCL : Chemokine (C-C motif) Ligand CD : Cluster of Différentiation
CFDA-SE : CarboxyFluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFU-F : Colony-Forming Unit-Fibroblasts
CMSP : Cellules Mononucléées du Sang Périphérique ConA : Concanavaline A
COX : Cyclooxygenase
CPA : Cellules Présentatrices d’Antigène CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques CSM : Cellules Stromales Mésenchymateuses CTL : Cytotoxic T Lymphocytes
CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 DAF : Decay Accelerating Factor
DC : Dendritic Cells
ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FGF : Fibroblast Growth Factor
FSV : Fraction Stromale Vasculaire GVHD : Graft Versus Host Disease GVL : Graft Versus Leukemia HGF : Hépatocyte Growth Factor HLA : Hum an Leucocyte Antigen HO-1 : Heme Oxygenase 1
ICAM : Intercellular Adhesion Molécule IDO : Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase
IL : Interleukine
EFN-y : Interferon-gamma
IGFBP : Insulin-üke Growth Factor Binding Protein ISCT : International Society for Cellular Therapy LFA : Lymphocyte Function-associated Antigen LIF ; Leukemia Inhibitory Factor
LPS : Lipopolysaccharides MC : Milieu Conditionné
MCP : Membrane Cofactor Protein
M-CSF : Macrophage Colony Stimulating Factor MJF : Macrophage Migration Inhibitory Factor MO ; Moelle Osseuse
NK : Natural Killer NO : Nitric Oxide
PCR ; Polymerase Chain Reaction PD : Programmed Death
PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PGE : Prostaglandine E
PHA : Phytohémagglutinine PMA : Phorbol Myristate Acetate
poly LC : polyinosinic:polycytidylic acid PWM : Pokeweed mitogen
RLM : Réaction Leucocytaire Mixte SP : Sang Périphérique
SCO : Sang de Cordon Ombilical
TCR : T Cell Receptor
TGF-p : Transforming Growth Factor-beta Th : T helper
TLR : Toll-Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor Treg : T-régulateurs
VCAM : Vascular Cellular Adhesion Molécule VLA : Very Late Antigen
Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules dotées de nombreuses propriétés dont les plus importantes sont leur rôle de soutien de l’hématopoïèse, leur potentiel de différenciation midtilignée et leurs pouvoirs immimomodulateurs. Grâce à ces propriétés et à leur facüité d’obtention et d’amplification ex vivo, les CSM sont des candidats prometteurs pour diverses applications thérapeutiques. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé ces pouvoirs immunomodulateurs et étudié les mécanismes sous-jacents.
Nous avons dans un premier temps, évalué la capacité des CSM de la MO à moduler la prolifération des lymphocytes T purifiés à partir de sang périphérique (SP) ou de sang de cordon ombilical (SCO). Quel que soit le stimulus utilisé pour les activer, les lymphocytes T du SP ou du SCO sont modulés par les CSM d’une manière dose dépendante. Le profil d’inhibition des lymphocytes T du SP ou du SCO par les CSM est différent et vraisemblablement lié à lem composition cellulaire (rapport T naïfs vs mémoires).
Dans le but de comprendre les mécanismes impliqués dans l’immunomodulation et l’influence de l’environnement sur les CSM, nous nous sommes intéressés à l’expression des molécules d’adhésion et de la galectine 1 ainsi qu’à leurs rôles dans l’immunomodulation.
Lors des co-cultures avec les lymphocytes T, il y a augmentation de l’expression du CD54, du CD58 et de la sécrétion de la galectine 1 alors qu’en présence d’im environnement inflammatoire ou infectieux, celles-ci sont différemment modulées. Nous avons ensuite pu démontrer que l’inhibition de la réponse lymphocytaire par les CSM impliquait notamment la galectine 1 comme facteur immunorégulateur.
Le troisième volet de cette thèse, s’est intéressé à l’étude et à la comparaison du pouvoir immunomodulateur des CSM issues du tissu adipeux et la gelée de Wharton, considérés comme des sources potentiellement alternatives à la MO. L’immunomodulation exercée sur les réponses immrmes est indépendante de l’origine des CSM. Les CSM du tissu adipeux et de la gelée de Wharton inhibent l’activation des lymphocytes mise en évidence par l’expression du CD38. La réponse allogénique ou mitogénique des lymphocytes est réduite en présence de CSM et les sous populations (CD4"^ et CD8"^ sont affectées de la même manière par ces effets suppresseurs. Ces effets sont dépendants des concentrations en CSM et sont vraisemblablement liés à l’expression de la PGE2 et du LEF. Durant les co-cultures, les Tregs sont expansés et cela indépendamment des concentrations en CSM.
En résumé, nous avons caractérisé le pouvoir immunomodulateur des CSM issues de trois sources différentes à savoir la moelle osseuse, la gelée de Wharton et le tissu adipeux. Comme le mettent en évidence nos observations, ce pouvoir est clairement dépendant de la concentration en CSM utilisée et est fortement sensible à l’environnement auquel les CSM sont exposées. Sur le plan mécanistique, nous avons démontré la participation de la galectine 1, de la PGE2 et du LIE aux fonctions immimosuppressives des CSM. Nous rapportons également la capacité des CSM à promouvoir l’expansion des Tregs aussi bien au sein d’ime population lymphocytaire que fraîchement purifiés. Nos travaux soulignent l’importance et l’avantage de l’utilisation des CSM issues de ces nouvelles sources dans le cadre des thérapies immunes.
Taôks des matières
l.Introduction...1
1.1. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) : Définition et Historique... 1
1.2. Origine et sources des CSM... 2
1.2.1. La moelle osseuse et les alternatives... 2
1.2.2. Le sang périphérique... 3
1.2.3. Le sang de cordon ombilical... 3
1.2.4. La gelée de Wharton (Wharton's jelly)...4
1.2.5. Le tissu adipeux... 4
1.2.6. Autres sources... 4
1.2.7. Les différences entre les CSM... 5
1.3. Techniques d’obtention des sources, d’isolement et d’expansion des CSM... 6
1.3.1. Obtention des sources...6
1.3.2. Isolement...7
1.3.3. Expansion...9
1.4. Caractérisation des CSM... 10
1.4.1. Aspect morphologique... 11
1.4.2. Critères ISCT...11
1.4.3. Homing : migration et adhésion... 12
1.4.4 Sénescence et transformation...13
1.5. Propriétés des CSM...14
1.5.1. Support de l’hématopoïèse... 14
1.5.2. Potentiel de différenciation multilignée... 15
1.5.3. Immunogénicité des CSM 15
1.5.4. Capacités d’immunomodulation... 19
1.5.5. Régulation de l’immunomodulation... 33
1.5.6. Immvmomodulation des CSM différenciées... 34
1.5.7. Immunomod\alation des CSM issues d’autres sources...34
1.6. Applications thérapeutiques des CSM...34
1.6.1. CSM et greffes de cellules souches hématopoïétiques...35
1.6.2. CSM et transplantation d’organes solides... 36
1.6.3. CSM et maladies auto-immimes... 36
1.6.4. CSM et réparation tissulaire... 36
1.6.5. CSM et thérapies géniques... 37
2. Objectifs de la thèse... 38
3. Résultats/Publications... 40
3.1. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the prolifération of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood; the importance of low cell ratio and rôle of interleukin-6...41
3.2. Modulated expression of adhesion molécules and galectin-1 : Rôle during mesenchymal stromal cell immunoregulatory functions...42
3.3 Mesenchymal stromal ceUs use PGE2 to modulate activation and prolifération of lymphocyte subsets: Combined comparison of adipose tissue, Wharton's Jelly and bone marrow sources... 43
3.4 Adipose tissue and Wharton's Jelly derived mesenchymal stromal cells suppress lymphocyte responses by secreting leukemia inhibitory factor... 44
4. Discussion et conclusions...45
5. Perspectives 56
6, Références 60 7. Annexes...81
7.1. Intitulé de la thèse annexe...
7.2. Curriculum vitae...
7.3. Version électronique de la thèse...
Figure 1 : Un bref historique des CSM
1860s -- Cohnheimpositsmarroworiginsof stromal cells
Maximow observes relationship betv/een 1920s hematopoiesis and the mesoderm during
development
Friedenstein et al. demonstrate ectopic bone 1960s -|- marrow formation bytransplantingmarrow
stromal cells
1970s - - Friedenstein et al. isolate adhèrent cells from whole bone marrow in culture
1980s - -
Owen, Caplan, and colleagues further refine isolation methods and identify mesenchymal stem cell markers
First trials of MSC Tx for patients with bone 1990s + marrow Tx;firstevidenceofMSCsevading
immune rejection
2000s -- Trials of MSC Txtotreatimmunologicaldiseases
Parekkadan et al, Annu Rev Biomed Eng. 2010
Figure 2 : CFU-F (colony-forming imit-fibroblasts)
Friedenstein et al. Cellular Therapy and Transplantation 1989
1.Introduction
1.1. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) : Défmition et Historique L’histoire (Figure 1) et la définition des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) furent initialement liées aux concepts de l’hématopoïèse, du microenvironnement et de l’ostéogenèse médullaire ^ A partir des années 1960, Alexander Friedenstein entama une série de travaux et d’expériences aboutissant à l’identification au niveau de la moelle osseuse (MO) d’une population de cellules dotées d’un potentiel ostéogénique. En réalisant des cultures de MO à faible densité, il parvint à observer l’apparition de petites colonies composées de cellules d’aspect fibroblastique, adhérentes au plastique et capables de se différencier en précurseurs de cellules osseuses. 11 baptisa ces cellules : CFU-F pour colony- forming unit-fibroblasts (Figure 2) Ashton et al, ^ démontrèrent par la suite que la culture de cellules de moelle (modèle animal) permettait uniquement la prolifération d’une population cellulaire stromale de type fibroblastique. Une fois placées dans une membrane poreuse implantée dans le péritoine, ces cellules généraient un mélange de tissus osseux, cartilagineux et fibreux.
Ces cellules capables de se différencier en os et cartilage prirent au cours du temps une multitude de noms. Initialement décrites par Friedenstein comme des CFU-F il les nomma ensuite cellules souches ostéogéniques ® tandis que Owen ^ utüisa le terme de cellules souches stromales. C’est en 1991, que Caplan introduisit le terme de cellules souches mésenchymateuses en référence à leur potentiel de différenciation en cellules (ostéoblastes, chondrocytes, adipocytes) de la lignée mésodermique Ce terme prédomina dans la littérature jusqu’à nos jours malgré les controverses liées au caractère souche de ces cellules.
En effet, le caractère souche de ces cellules n’a jamais été réellement prouvé et certains
Tableau 1 : Exemples représentatifs de noms donnés aux CSM
Tenu on type(s) identified Animal Soiuxe,'Reference(s)
Precursors of non-hematopoiehc Adhèrent cellsofbonemarrowtiiatinchide Guinea pig [6] Mouse [88]
tissue fibroblast-like cells. endcthehal cells, and monocytes, macrophage
Colony fomung unit-fibroblast Colonies of fibroblastic cells. with the occa-
(CFU-F) sional monocyle/macrophage présent
Human [8] Mouse [89, 90]
Rabbit [91]
Mesenchymal stem cells Cells defîaed by their sebctive attachment to a Human [92]
(MSCs) sohd surface
Marrow stromal cells Adhèrent cells ofbone marrow that mclude Mouse [39, 93, 94]
and or adhèrent fibroblast-like cells. endothélial
cells and colonies monocytes'macrophage
Bone marrow stromal [stem] Non-hematopoietic cells of mesenchymal ori- Mouse [95] Human [86, 96]
cells [BMSSCs] andor SComal gin, displaying fibroblastic motphology precursors cells (SPCs)
RS-1. RS-2, mMSCs (RS:
Recyclmg stem ceU) (m;
Multipotent adult progeniior cells (M-APCs)
RS-1: Üim. spindle-shaped cells RS-2: moder- Human [27, 97]
ately thin, sptndle-shapec cells mMSCs: wider, spmdle-shaped cells
Culture-derh'ed bone man’ow-derived progeni- Humans [98] Murine [25] Rat
tor cells [25]
Baksh et al, J Cell Mol Med 2004
Figure 3 : La moelle osseuse
Innervation
Progéniteurs tissulaires circulants
I Périoste
^ Os spongieux
Ceilutes souches hématopoiétiques MAPC
Vascularisation
CS mésenchymateuses Progéniteurs /précurseurs Coulombel L, Flammarion Médecine-Sciences 2003
un tissu (mésenchyme) de soutien et de support Certaines publications ont omis de faire référence au terme souche préférant l’appellation cellules adhérentes ou stromales ou mésenchymateuses toutes dérivées de la moelle osseuse (Tableau 1) Dans un souci de clarification et d’uniformisation, Tlntemational Society for Cellular Therapy (ISCT) a proposé de nommer les cellules adhérentes au plastique et d’aspect fibroblastique indépendamment de leur origine, comme étant des cellules stromales mésenchymateuses remplaçant ainsi le terme « cellule souche mésenchymateuse » mais préservant l’acronyme anglophone de MSC
1.2. Origine et sources des CSM
L’origine ontogénique des CSM n’est toujours pas formellement établie et reste à déterminer. Schipani et Kronenberg ont passé en revue les différents argiunents et hypothèses évoquant l’origine des CSM. Bien que leur origine mésodermique soit la plus populaire, il en ressort que les CSM pourraient provenir en partie du tissu neuroépithélial ou du tissu périvasculaire Ainsi, on considère que les CSM sont virtuellement présentes au niveau de tous les organes et tissus qu’elles partagent les mêmes caractéristiques (morphologie, phénotype et multipotentialité) et qu’elles peuvent donc être isolées à partir de différentes sources.
1.2.1. La moelle osseuse et les alternatives
Historiquement les CSM furent initialement identifiées dans la moelle osseuse ^ qui, à l’heure actuelle, représente la source principale des CSM pour les essais et/ou études cliniques ainsi que pour les recherches in vitro (Figure 3).
Les CSM sont rares et ne représentent qu’une petite fraction (entre 0,0001% et 0,01%) de la population des cellules nucléées de la MO L’isolement et l’amplification des CSM in
Tableau 2 : Inconvénients majeurs de la moelle osseuse comme soxirce de CSM
- procédure invasive d’obtention de la moelle osseuse - haut degré d’exposition virale
- possibilité de morbidité du donneur
- diminution du nombre de CSM et de leurs capacités de prolifération/différenciation avec l’âge
- anomalies des CSM dans certaines pathologies
Tableau 3 : Paramètres critiques pour l’isolement des CSM à partir du sang de cordon ombilical
Critical parameters Success rate P value
Total LiCB units 17/59 (29 clones) 28.8%
UCBunits<15h 17/44 (29 clones) 38.9% .03 üCBunits^3ml 17/47 (29 clones) 36.2% .03 UCB units >10* MNC 16/40 (27 clones) 40.0% .01 UCB units <15 h,>33 ml,>10* 17/38 (29 clones) 44.7% .01 UCB units of optimal quality* 17/27 (29 clones) 63.0% .01
Data represent the ratio of units that gave rise to MSC-Hke cells to the total number of units exploiting spécial characteristics .p values were calculated by %- analysis comparing the frequency distributions of units according to critical quali ty parameters.
‘<15 hours,>33 ml, and >10*MNC,fêtai calf sérum coat, no coagula, and nohemolysis, respectively.
Bieback K et al. Stem Cells 2004
vitro sont aisés, cependant l’utilisation de la MO présente des inconvénients incitant la recherche de sources alternatives à la MO (Tableau 2).
1.2.2. Le sang périphérique
Il a été démontré que des CSM circulent en faible nombre dans le sang périphérique mais l’origine de leur présence à ce niveau est toujours contreversée La présence des CSM dans le sang périphérique a été observée chez des patients présentant des brûlures aiguës invoquant un rôle potentiel de ces cellules dans la régénération des tissus lésés. L’observation des CSM circulantes après mobilisation du sang périphérique grâce à des facteurs de croissance n'est pas consensuelle et diverge entre les différentes études . Cependant, l’utilisation des techniques de sélection positive (CD 133 ou microbilles de fibrine) à partir de sang périphérique mobilisé a permis l’isolement des CSM La rareté des CSM circulantes et les contradictions sur leur existence pourraient être liées à la diversité des méthodes d’isolement, de culture et de caractérisation utilisées dans les différentes études conduisant ainsi à une disparité des résultats
1.2.3. Le sang de cordon ombilical
L’utilisation du sang de cordon ombilical comme source de CSM présente des avantages par rapport aux autres sources cependant certaines équipes n’ont pas pu confirmer ni isoler •71
des cellules ayant les mêmes caractéristiques que les CSM médullaires . Néanmoins, Lee et al sont parvenus, grâce aux techniques de sélection négative et de dilution limite, à obtenir des CSM à partir du sang de cordon mais certains paramètres critiques doivent être observés pour assurer un isolement optimal des CSM (Tableau 3).
Figure 4 : La gelée de Wharton
placental
• artéry
■É
allantois
V
Wharton’s
■jelly
placental artery
Placental Cord
placental vein
www.embrvology.med.unsw.edu.au
Figure 5 : Le tissu adipeux
www.planet-techno-science.com
Tableau 4 : Diverse sources de CSM
■Bone Marrow ■Adipose Tissue
■Trabecular Bone ■Tendons
■Periosteum ■ Blood and blood vessels
■Articular Cartilage ■Umbilical cord Vasculature
■Synovium ■ Fêtai tissues
■Synovial Fluid ■Skin
■Muscles ■Spleen and Thymus
1.2.4. La gelée de Wharton (Wharton's jelly)
Dans la quête d’une nouvelle source de CSM comme alternative à la MO vu ses limitations et inconvénients, est apparue l’idée d’utiliser le cordon ombilical (CO) comme source potentielle de CSM Les vaisseaux ombilicaux sont protégés par la gelée de Wharton décrite initialement par Thomas Wharton comme étant un tissu conjonctif. Elle constitue le composant majeur de la matrice extracellulaire du CO et représente une source importante de CSM ‘ . L’abondance et la facihté d’obtention des cordons ombihcaux renfermant la gelée de Wharton (Figure 4) en font un matériel précieux dont il faut optimiser la récupération.
1.2.5. Le tissu adipeux
Le tissu adipeux est « malheureusement » un tissu quasiment inépuisable renfermant une multitude de cellules parmi lesquelles des CSM Ce tissu (Figure 5) constitue depuis longtemps une source facile à obtenir, en grande quantité et sans trop d’inconfort en vue d’isoler les CSM. Il constitue donc une alternative à l’utilisation de la MO'*^.
1.2.6. Autres sources
Les CSM ont été isolées dans de nombreux autres tissus (Tableau 4) mais les études les concernant sont assez rares comparées aux autres sources de CSM. Il ne s’agit pas d’une liste exhaustive mais d’xm petit tour d’horizon ! Les sources d’origine fœtale sont aussi convoitées pour l’isolement des CSM : le placenta les membranes fœtales (amnios et chorion) le liquide amniotique La présence de CSM a été décrite au niveau du tissu synovial du cartilage des tissus dentaires et du sang menstmel^'*.
1.2.7. Les différences entre les CSM
Les CSM, en fonction de leur source, peuvent présenter des profils d’expression génique distincts et donc posséder un transcriptome unique Ces différences géniques reflètent l’origine et les capacités de différenciation de chaque population cellulaire permettant ainsi de les discriminer entre elles Bien que les CSM issues des différentes sources présentent les mêmes caractéristiques (morphologie, phénotype), leur potentiel de différenciation est variable et dans certains cas, on observe l’absence d’une des voies de différenciation Des différences également au niveau des protéines et cytokines exprimées par les différents types de CSM ont été rapportées Parmi tous les types de CSM, celles issues du tissu adipeux et de la gelée de Wharton présentent de nombreux avantages ^ :
> Taux d’isolement de 100%
> Fréquence élevée en CFU - F
> Temps de doublement très court
L’avantage du cordon ombilical est qu’il génère une quantité importante de CSM par rapport aux autres sources. En effet, la fréquence des CSM dans les tissus conjonctifs du cordon (gelée de Wharton) est de 1/300 alors que celle-ci avoisine 1-2 CSM pour 200 millions de cellules dans le sang de cordon. De plus le cordon, comme le sang qui en dérive, et le placenta sont considérés comme des « résidus opératoires » et ne devraient pas susciter de questions éthiques spécifiques. Le tissus adipeux présente aussi une proportion élevée de CSM ; environ 5% des cellules de la fraction vasculaire, soit lOOX plus que dans la moelle.
De plus, sa facilité de prélèvement par lipoaspiration, technique inmi-mvasive, non agressive pour le donneur est un atout majeur.
5
Figure 6 : Prélèvement de la moelle osseuse
http://fr.wikipedia.org
Biopsy needle
Bone
Bone www.healthkev.com
Figure 7 : Prélèvement du cordon ombilical
Seshareddy K et al De Bruyn et al, Methods Cell Biol. 2008 Stem Cells Dev 2011
Ainsi il apparaît que le tissu adipeux et la gelée de Wharton sont les tissus les plus abondants et les plus faciles à obtenir sans trop de contraintes pour les donneurs. De même, grâce à leur capacité élevée d’expansion et de prolifération, les CSM qui dérivent de ces tissus sont les plus intéressantes pour une amplification ex vivo à visée clinique. Ces sources sont donc d’excellentes alternatives à la MO.
1.3. Techniques d’obtention des sources, d’isolement et d’expansion des CSM 1.3.1. Obtention des sources
1.3.1.1. Prélèvement de la moelle osseuse
La MO (Figure 6) est généralement prélevée sous anesthésie locale par ponction au niveau du sternum ou de la crête iliaque. La moelle est aspirée dans ime seringue contenant de r héparine utilisée comme anticoagulant. Le volxune de moelle prélevée varie généralement entre 10 et 20 ml mais certains préconisent de plus petits volumes (<4ml) afin d’éviter toute hémodilution. Ce prélèvement est homogénéisé par passage au travers d’une aiguille fine pour éliminer les agrégats. Les cellules mononucléées de la MO obtenues après centrifugation par gradient de densité, sont mises en culture en vue d’isoler les CSM qui y sont présentes
1.3.1.2. Prélèvement du cordon ombilical
Immédiatement après l’accouchement, le cordon ombilical (Figure 7) est récupéré et conservé dans un tampon stérile pour une durée de 1 à 24 heures. Notre groupe a récemment développé une méthode alternative à celles rapportées dans la littérature pour la manipulation du cordon. Cette méthode consiste simplement à couper le cordon longitudinalement et à récupérer les CSM grâce à leurs capacités de migration et d’adhésion au plastique. Dans le passé, deux méthodes étaient principalement décrites pour la manipulation de la gelée de Wharton afin d’isoler les CSM. La première est dite non
6
Figure 8 : Prélèvement du tissu adipeux Lipoaspiiale
enzymatique et consiste à couper les cordons en petites pièces déposées dans une boite de Pétri remplie de milieu de culture La deuxième méthode dite enzymatique repose sur l’utilisation d’enzymes qui assurent la digestion des eomposants de la matrice extracellulaire.
Préalablement à cette digestion, il faut débarrasser la gelée de Wharton des vaisseaux sanguins afin d’exposer les CSM au milieu de culture
1.3.1.3. Prélèvement du tissu adipeux
Le tissu adipeux (Figure 8) peut être obtenu par lipoaspiration (liposuccion) ou après résection chirurgicale des graisses. Dans le cadre des CSM, la lipoaspiration est la technique la plus fi-équemment utilisée. Après avoir lavé la lipoaspiration, on procède à la digestion de la matrice extracellulaire à l’aide de collagénase. Finalement, l’échantillon est lavé par centrifugation et la fraction stromale vasculaire (FSV) contenue dans le culot est récupérée et mise en culture ’ . Cette fraction (Figure 9) contient une population cellulaire hétérogène.
On y distingue d’une part le compartiment hématopoïétique CD45'^ composé de lymphocytes, macrophages et progéniteurs hématopoïétiques et d’autre part le compartiment stromal CD45“
, composé majoritairement de cellules stromales ou préadipocytes, de cellules endothéliales matures et immatures et de progéniteurs qui restent à caractériser.
1.3.2. Isolement
Les CSM, comme décrites précédemment, constituent une population rare dont la fréquence est très faible. Afin d’optimaliser leur isolement, différentes techniques de sélection ont été développées. Il en existe trois principales :
7
Figure 10 : Sélection classique par adhésion au plastique et « passages »
Figure 11 : Sélection négative des CSM par « RosetteSep® »
Figure 12 : Sélection positive des CSM
CMN
Billes
magnétiques
1^© ©
© O
Passage sur colonne
1.3.2.1. Sélection classique par adhésion au plastique
Basée sur les capacités d’adhérence au plastique des CSM, cette technique fut initialement décrite par Friedenstein et est devenue la technique de référence la plus répandue pour l’isolement des CSM (Figure 10). A chaque renouvellement du milieu de culture, les cellules non adhérentes sont éliminées alors que les CSM restent accrochées au plastique et prolifèrent
72
1.3.2.2. Sélection négative (déplétion)
Ce type de sélection est une combinaison de deux méthodes permettant un enrichissement en CSM dès le départ . Brièvement, l’échantillon est incubé avec un cocktail d’enrichissement « RosetteSep™ » à base d’anticorps monoclonaux (anti-Glycophorin A, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD19, anti-CD66b, anti-CD38) reconnaissant les cellules non mésenchymateuses, suivi d’une centrifugation sur gradient de densité (Figure 11). Ces anticorps tétramériques permettent la liaison des cellules non désirées aux globules rouges qui formeront un culot après cette centrifugation. Les cellules d’intérêt non marquées sont aisément collectées à l’interface plasma/milieu de gradient de densité et mises en culture.
1.3.2.3. Sélection positive
Grâce à cette technique, il est également possible d’avoir une population enrichie en CSM dès le début de l’isolement (Figure 12). Les CSM vont être purifiées sur base de l’expression spécifique de certains antigènes de surface en utilisant le tri cellulaire par cytométrie de flux.
Parmi les marqueurs qui ont servi à purifier les CSM par sélection positive, nous pouvons citer ; VCAMl/STRO-1, CD133, CD271 (p75LNGFR), CD73, CD49a, SSEA-4, G2, CD105 et CD56
8
Tableau 5 : Marqueurs pour l’isolement des CSM
SELECTION POSITIVE SELECTION NEGATIVE
CD9, CDIO, CD13,CD29 CD45, CD34, CD14
CD44, CD49a, CD49b CDlla,CD19, CD86
CD49c, CD49e, CD51 CD80/CD40, CD 15
CD54, CD58, CD61 CD 18, CD25
CD62L, CD71, CD73 CD31,CD49d
CD90, CD 102, CD 104 CD50,CD62E
CD105, CD106, CD119 CD 120a, CD 120b, CD 121 CD123, CD124, CD126 CD 127, CD 140a, CD 166 CCRl, CCR4, CCR7, CXCR5 CCRIO, VCAM-1,CD166, AL-CAM lCAM-1, STRO-1 (CD 140b)
HER-2/erbB2 (CD340), frizzled-9 (CD349), W8B2, W3D5, W4A5
CD62P, CD117
Salem et al. Stem Cells 2010
Figure 13 : Le test CFU-F est utilisé pour évaluer le nombre de CSM dans une population cellulaire hétérogène
BASIC CFU-F PROTOCOL
IncutMte in 100mm tissue cuiUird>ti««tftd P«tri dWies 1ncub«(* for 14 days
1
at37*C in5%C02
i
Wash plat» to ramovo non<adhofMit calts.
Fa with mothanol and stain with Giamsa.
Nombre de colonies de CFU-F pour 5000 cellules mononucléées en primoculture (A) et après 2 passages (B)
www.hemogenix.com
Un large panel de marqueurs peut être utilisé dans les techniques de sélection négative et positive comme l’illustre le Tableau 5. Cependant, ces deux techniques n’ont pas encore été appliquées pour l’isolement des CSM à partir de la gelée de Wharton.
1.3.3. Expansion
L’utilisation des CSM à des fins thérapeutiques requiert leur amplification ex vivo afin d’éliminer les populations cellulaires non mésenchymateuses et en même temps d’augmenter le nombre de CSM. Cette expansion repose sur la capacité élevée des CSM à proliférer dans des milieux de culture appropriés.
1.3.3.1. Amplification in vitro par passages
Après avoir isolé les CSM, celles-ci sont mises en culture à faible densité jusqu'à atteindre 80-90 % de confluence. L’expansion est ensuite réalisée par des passages successifs. Quand les CSM atteignent la confluence, elles sont détachées, diluées et remises en culture. Au bout de quelques jours, les CSM forment des colonies dites CFU-F composées de cellules à l’aspect fibroblastique (Figure 13). Le nombre de colonies CFU-F énumérées au microscope après coloration au May-Grünwald Giemsa (MGG) permet d’évaluer le nombre de CSM. En culture, les populations de CSM sont hétérogènes et présentent trois phases de croissance : latente, rapide et stationnaire Les CSM peuvent présenter une expansion limitée car elles ne se répliquent pas indéfiniment et peuvent entrer en sénescence .
1.3.3.2. Conditions de cultures
L’expansion des CSM est dépendante des conditions de culture quelle que soit leur source. Plusieirrs paramètres tels que l’utilisation de cellules fi-aîches ou congelées, la densité cellulaire, le taux d’oxygène, les milieux de culture avec ou sans sérum et l’addition de
9
facteurs de croissance ou de cytokines peuvent significativement influencer le déroulement de la culture et donc l’amplification des CSM
La croissance optimale des CSM est étroitement liée à la densité des cellules mise en eulture. L’initiation des cultures avec des faibles densités cellulaires permet ime meilleure expansion des CSM due à l’augmentation de la prolifération et du nombre de doublements
85*86
’ . Le taiix d’oxygène peut aussi avoir im impact sur la culture et les fonctions des CSM. La culture en hypoxie permet d’accroître la durée de vie ainsi que le pouvoir prolifératif des CSM mais on observe également une modulation réversible (stimulation vs inhibition) du potentiel de différenciation des CSM
Le milieu de culture est un élément cmcial pour l’amplification optimale des CSM Les milieux commercialisés peuvent avoir différentes formulations et leur utilisation pour la eulture des CSM nécessite généralement l’addition de suppléments. Initialement c’est le sérum (animal ou humain) riche en facteurs de croissance et protéines qui fut utilisé comme eomplément. Cependant, il existe des variabilités entre les lots de sérum et les risques de transmission infectieuse ou de réaction immunologique limitent leur utilisation pour des amplifications à visée clinique. Des milieux de culture sans sérum (sérum free media) auxquels on ajoute des facteurs de croissance, des cytokines ou du lysat plaquettaire ont permis de soutenir et de potentialiser la croissance des CSM CSM présentent des protéomes et des transcriptomes distincts en fonction des milieux de culture Les eonditions de culture peuvent entre autre modifier le phénotype, le potentiel de différenciation et surtout le pouvoir immunomodulateur des CSM
1.4. Caractérisation des CSM
L’identification des CSM est une étape primordiale avant leur utilisation dans les tests in vitro ou dans les essais cliniques. La multitude des recherches sur les CSM, sans avoir im
Tableau 6 : Récapitulatif des critères définissant les CSM
1 Adhérence to plastic in standard culture conditions
2 Phenotype Positive (> 95%+) Négative (<2%+)
CD105 CD45
CD73 CD34
CD90 CD14 or CDllb
CD79a or CD19 HLA-DR
3 In vitiv différentiation: osteoblasts, adipocytes, chondroblasts (demonstrated by staining of in vitro cell culture)
Dominici et al, Cytotherapy 2006
consensus sur leurs caractéristiques a conduit à des observations diverses et des résultas contradictoires. Comme les CSM ne sont pas morphologiquement distinguables des autres cellules stromales, qu’il n’existe pas de marqueur unique pour les reconnaître, il fallait donc trouver un consensus permettant leur identification.
1.4.1. Aspect morphologique
Les cultures de CSM sont composées d’une population hétérogène tant au niveau morphologique que pour leur capacité de division Différentes sous populations ont été identifiées avec des cellules de tailles différentes, généralement d’aspect fibroblastique ou fusiforme avec parfois des granulations
1.4.2. Critères ISCT
L’impossibilité de comparer les résultas concernant les CSM ainsi que la diversité des observations est en partie due à l’absence de critères définissant les CSM. Dans un but d’harmoniser l’identification des CSM, le comité « Mesenchymal and Tissue Stem Cell » de riSCT a élaboré un ensemble de critères standards définissant les CSM (Tableau 6). Ces critères minima au nombre de trois incluent
> Capacité d’adhérence au plastique
Les CSM doivent adhérer au plastique lorsqu’elles sont maintenues en culture dans un milieu standard.
> Phénotype
Ce phénotype est établi par cytométrie de flux sur base de l’expression et de l’absence d’expression de certains antigènes de surface. Les cellules doivent exprimer (>95% positives) le CD 105 {endoglin/TGFP receptor), le CD73 (5'-ectonucleotidase) et le CD90 (Thy-1).
Figure 14 : Pouvoir de multipotentialité des CSM
Déxaméthasone Insuline
Accumulation lipidique
adipocytes
I TGPP
Collagène U
Déxaméthasone Pglycérophosphate Acide ascorbique
Dépôts calciques
B
chondrocytes ostéoblastes
Pittenger, Science 1999
Figure 15 : Mécanismes potentiels impliqués dans le homing et la mobilisation des CSM
(B)C^ Actmtioa
TCAM-l S KTAU-tA
CC)Ro11bi( tndftnn Adluaon
Salem et al. Stem CeUs. 2010
Par contre, elles ne doivent pas exprimer (<2%) le CD45, le CD34, le CD 14 ou CDl Ib, le CD79a ou CD19, le HLA (human leucocyte antigen)-DR.
> Pouvoir de multipotentialité
Le potentiel de différenciation vers les trois lignées mésenchymateuses est le critère qui caractérise le plus les CSM. En présence de milieux d’induction spécifiques, les CSM doivent se différencier in vitro en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes. La différenciation vers une de ces lignées est mise en évidence par des colorations spécifiques (Figure 14).
Les CSM isolées à partir de la moelle osseuse, de la gelée de Wharton et du tissu adipeux répondent aux critères de l’ISCT et semblent donc similaires 37402-i03^
1.4.3. Homing : migration et adhésion
Le homing cellulaire est un ensemble de phénomènes permettant aux cellules de changer de localisation et d’aller s’implanter dans un autre tissu. Le fait que des CSM ont pu être observées dans le sang ou au niveau de tissus lésés et que de nombreuses études aient montré qu’elles pouvaient, après transplantation ou infusion, se retrouver dans divers tissus suggère que les CSM sont recrutées ou mobilisées dans certaines circonstances pour aller s’implanter au niveau d’un tissu spécifique. Ce homing, est défini comme étant un arrêt des CSM à l'intérieur du système vasculaire d'un tissu, suivi par vme transmigration à travers l'endothélium pour finalement s’implanter dans le tissu. Les signaux et les mécanismes à l’origine du homing des CSM vers d’autres tissus ne sont pas encore complètement élucidés
Le homing des CSM est étroitement lié à leurs capacités de migration et d’adhésion
Plusieurs mécanismes (Figure 15) potentiellement impliqués dans le homing ont été décrits et les molécules d’adhésion, les chémokines et leurs récepteurs y joueraient un rôle fondamental
107;108
Tableau 7 : Molécules d’adhésion (A) et récepteurs aux chémokines (B) exprimées par les CSM de la moelle osseuse et du placenta (microarray)
Adhesion molécule hbmM.SC hpMSC
ICAX4-1 CD54 + +
E-selectin CD62E — —
P-selectin CD62P — —
L-selectin CD62L — —
integrin cxL CDlla — —
LFA-3 CE>58 — —
E-Cadherin CD324 -I- H-
\^-Cadherin CD144 — —
PECAM-1 CD31 — —
ALCAM CD166 H- -h
NCAM CD56 + +
VCAM CD106 H- 4-
CD34 — —
CD44 H- +
integrin al CD49a + H-
integrin ot2 CD49b -f- +
integrin ct3 CE>49c H- 4-
integrin a4 CD49d — +
integrin «5 CD49e H- H-
integrin ct6 CD49f +
integrin otll +
integrin oM CDllb — —
iritegrin aV CD51 H- +
integrin otX CDllc H- +
integrin pl CD29 + +
integrin p2 CD18 -t- 4*
integrin p3 CE>61 — —
integrin p4 CD104 H-
integrin p5 H- -ï-
integrin p6 — —
integrin p7 -h H-
integrin p8 +
CJwnokine receptor hbniMSC hpMSC
CCRl — +
CCR2 - -
CCR3 - +
CCR4 - -
CCR5 + -
CCR6 - -
CCR7 - -
CCR8 + +
CCR9 - -
CCRIO CCRLl
+ +
(CCRll) + +
CXCRl - -
CXCR2 - -
CXCR3 - -
CXCR4 — -
CXCR5 — -
CXCR6 — -
CX3CR1 - -
Brooke et al. Stem Cells Dev 2008
Les signaux à l’origine de la migration des CSM sont diverses et peuvent correspondre à des situations de stress, de danger, d’inflammation ou de lésions. Les CSM expriment plusieurs familles de molécules d’adhésion intervenant dans les contacts intercellulaires et dans le homing (Tableau 7A). Les chémokines constitueraient un des principaux signaux induisant la migration des CSM. Plusieurs études ont démontré que les CSM expriment xm vaste répertoire de récepteurs aux chémokines (Tableau 7B) dont l’expression est variable et modulable D’autres voies secondaires semblent aussi contribuer aux mécanismes de migration des CSM :
^ le système FPR {Formyl Peptide Receptor ) et ses agonistes *
> le système TRAIL {TNF-réisiQà-apoptosis-inducing-ligand) et ses récepteurs ’
> l’IL-6 (effet paracrine) et la PGE2
Grâce au homing, les CSM peuvent migrer vers les tissus lésés ou inflammatoires et participer au processus de réparation tissulaire et de modulation de l’inflammation.
1.4.4 Sénescence et transformation
La culture in vitro des CSM n’est pas illimitée puisque, au fur et à mesure des passages, les cellules vieillissent et prolifèrent de moins en moins. Les CSM possèdent donc un potentiel prolifératif limité, et avec le temps elles arrêtent de se diviser voies utilisées par les CSM pour limiter leur potentiel prolifératif est la sénescence cellulaire. Après un certain nombre de divisions, il se produit un arrêt de la croissance cellulaire, on parle alors de sénescence réplicative. La principale cause de sénescence des CSM est l'apparition de télomères très courts et l’absence de télomérase ^*^420 CSM sénescentes présentent diverses modiflcations/altérations de leur morphologie, de leur phénotype, de leur potentiel de différenciation et de leur profil d’expression génique
LongboneTrabecularbone
Figure 16 : Niche hématopoïétique
Sinusoraa
Vascular niche
niche
Endosteal Bone Bone marrow
C04S-negative MSCs CD45-|>osltive
a HSCs CS Progenitors
Fibrobiaets
& Osteodasls
« Osteobtasts Lining ceiis Endotbeiial
celte Adipocytes ECM. Mosây collagen 1
Grassel et al. Front Biosci. 2007
Plusieurs études ont démontré la capacité des CSM à sortir de la sénescence et à se transformer en cellules malignes après une longue période de culüire mais cette observation n’a pas été confirmée par d’autres équipes C’est en sortant de la sénescence et ensuite par l’acquisition d’une activité télomérase, que se ferait la transformation maligne des CSM Les CSM transformées sont morphologiquement distinctes des CSM normales et sont caractérisées par une modification d’expression génique, un changement de phénotype, des aberrations chromosomiques et l’acquisition d’une activité télomérase H est donc conseillé d’amplifier les CSM sur un petit nombre de passages et de réaliser un contrôle caryotypique avant toute application clinique.
1.5. Propriétés des CSM
1.5.1. Support de l’hématopoïèse
La moelle osseuse est le siège de l’hématopoïèse : elle contient les précurseurs des cellules sanguines (cellules souches hématopoïétiques, CSH) soutenues par le microenviroimement médullaire (Figure 16). Ce sont les CSM qui sont à l’origine de ce microenvirormement composé d’un tissu stromal (fibroblastes, cellules endothéliales, fibres musculaires lisses, adipocytes) baignant dans une matrice extracellulaire On y trouve également des facteurs de croissance et des cytokines indispensables au maintien et à la régulation de l’hématopoïèse Les CSM agissent sur les progéniteurs hématopoïétiques en favorisant leur renouvellement Depuis les travaux de Friedenstein d’autres études réalisées sur des modèles humains ou animaux ont confirmé l’importance des CSM à l’origine du microenvironnement dans le soutien et le support de l’hématopoïèse Les CSM isolées à partir du cordon ombilical ou du tissu adipeux peuvent également soutenir l’hématopoïèse favorisant ainsi la prise de greffe des CSH
Figure 17 : Potentiel de différenciation des CSM
Bone
Ectoderm
Bone maiTOw Epinolta cetl
* /i Netinoo
Osreobiast
Mesoderm
Uccelli et al, Nat Rev Immunol. 2008
1.5.2. Potentiel de différenciation multilignée
Suite axox travaux de Friedenstein et de Ashton décrivant les capacités de différenciation des CSM, d’autres études sont venues confirmer le caractère mxiltipotent de ces cellules. Elles ont la capacité de se différencier en cellules de la lignée mésodermique incluant les chondrocytes, les adipocytes, les ostéoblastes et les myoblastes ’ . Indépendamment de leur source d’isolement, les CSM partagent le même potentiel de différenciation vers ces trois lignées cellulaires mais à des degrés divers Bien que les CSM aient été définies par leur capacité de différenciation en chondrocytes, adipocytes et ostéoblastes, elles possèdent un potentiel de différenciation plus large (Figure 17 ). En effet, plusieurs autres voies de différenciation non mésodermique (neuronale, hépatocytaire, cardiaque, musculaire,...) ont été décrites mais des différences sont observées entre les CSM issues de diverses sources Ces capacités de différenciation ont été mises en évidence suite à la culture in vitro des CSM dans des milieux d’induction spécifiques et confirmées par des colorations, l’expression de gènes spécifiques à la voie de différenciation, le profil de sécrétion et des critères morphologiques
1.5.3. Immunogénicité des CSM
Le succès d’une greffe ou transplantation est tributaire du caractère et du degré immunogénique des cellules. L’immimogénicité est liée à l’expression des molécules HLA ainsi qu’aux molécules de co-stimulation des lymphocytes T. Il est donc important que les CSM utilisées à des fins thérapeutiques soient histocompatibles, hypo-immunogéniques et donc tolérées par le receveur Les molécules HLA de classe I sont retrouvées à la surface de toutes les cellules nucléées de notre organisme alors que celles de classe II sont présentes à la surface des cellules présentatrices d’antigène (CPA). L’expression des molécules HLA de classe II par les CSM isolées de la MO n’est pas vraiment définie et est sujette à des
divergences. Pour Potian et al, les CSM expriment des moléc\iles HLA de classe II localisées au niveau de la membrane cellulaire Contrairement à cette observation, vme grande majorité d’études présentent les CSM comme étant négatives pour l’expression des molécules HLA de classe IL À l’état constitutif, les CSM expriment faiblement les molécules HLA de classe I. Par contre elles n’expriment pas les antigènes HLA de classe II, ni les molécules de co-stûnulation CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD40 et CD 154 (CD40-L). Après stimulation par l’interféron gamma (IFN-y), les CSM présentent ime augmentation de l’expression des molécules HLA de classe I et deviennent positives pour les molécules de classe II La cinétique par laquelle l’IFN-y module l’expression de ces molécrdes n’est pas la même. Alors que l’effet sur les molécules HLA de classe I est inunédiat, celui concernant les molécules de classe II est tardif C’est au 8®'"® jour d’exposition à l’IFN-y que l’expression des molécules HLA de classe II à la surface des CSM est la plus significative
Il est décrit que les CSM peuvent agir en tant que CPA pour les lymphocytes T CD4‘^ ou CD8"^. En effet, les CSM peuvent, via leurs molécules HLA de classe I, présenter des peptides antigéniques viraux ou tumoraux aux lymphoc>1;es T CD8^. Des défauts d’expression de certains composants de l’« antigen processing machinery » par les CSM pourraient expliquer le faible rendement de ce type de présentation À l’opposé, c’est sous influence de l’IFN-y que les CSM peuvent, via leurs molécules HLA de classe II, se comporter comme une CPA pour les lymphocytes T CD4"^ Selon Chan et al l’expression des molécules de classe II et la fonction CPA des CSM sont dépendantes du taux d’IFN-y. En effet, en présence d’un taux faible d’IFN-y, les CSM peuvent capter rm antigène et le présenter via leurs molécules de classe II induisant l’activation des lymphocytes T CD4"^. Par contre lorsque le taux d’IFN- y est élevé, il y a diminution de l’expression des molécules de classe II et perte de la fonction CPA N’étant pas constitutive, l’expression des molécules de classe II et la fonction CPA induites par l’IFN—y sont modulées par la densité cellulaire des CSM et le Transforming
16
Growth Factor-beta (TGF-P). L’induction de l’expression des molécules de classe II par l’IFN-y est maximale en présence d’un faible nombre de CSM mais abolie en présence de TGF-P L’expression des molécules de classe II est sous le contrôle d’un activateur de transcription appelé transactivateur de la classe II (CIITA, Class II TransActivator) lui-même régulé par plusieurs promoteurs Pour Romieu-Mourez et al c’est l’activation du promoteur IV de CIITA et donc l’expression de ce transactivateur qui est responsable de l’expression des molécules de classe II et de la fonction CPA induites par riFN-y. La diminution de l’expression des molécules de classe II en présence d’un taux élevé d’EFN-y serait en partie liée à un blocage de la protéine CIITA dans le cytoplasme l’empêchant de passer dans le noyau et donc d’activer la transcription des gènes des molécules de classe II Récemment, il a été observé que des facteurs de croissance tels que le Fibroblast Growth Factors (FGF-2) et le Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) pouvaient également induire l’expression de molécules de classe II au niveau des CSM . Les CSM de la MO sont généralement considérées comme des cellules peu immimogènes mais il existe des divergences dans la littérature sur ce statut. L’expression des molécules HLA de classe I et II pouvant être modulée dans un environnement inflammatoire, les CSM peuvent ainsi perdre leur caractère hypo-immunogénique, être reconnues par les lymphocytes T et donc être rejetées Alors qu’aucune alloréactivité n’a été détectée chez l’humain des études in vivo chez la souris, montrent que l’injection de CSM allogéniques engendre une réponse immune et sont rejetées .
L’immunogénicité des CSM issues du tissu adipeux est également un facteur critique pom leur utilisation thérapeutique. Constitutivement, ces CSM expriment faiblement les molécules HLA de classe I mais pas celles de classe II ni les molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86). Après stimulation par l’IFN-y, il y a augmentation de l’expression des molécules de classe I et uniquement l’induction de l’expression des molécules HLA de classe IL Le ligand
du TLR3 (Polyinosinic:polycytidylic acid = poly I :C) provoque également l’augmentation de l’expression des molécules de classe I Ces observations sont en contradiction avec celles de Crop et al démontrant que les CSM du tissu adipeux expriment fortement les molécules de classe 1, très légèrement celles de classe II et sont positives pour le CD80 et le CD86. Au cours d’une réaction lymphocytaire mixte (RLM) ou en présence d’un cocktail de cytokines pro-inflammatoires, les molécules HLA de classe I et II sont augmentées et l’expression du CD40 induite Initialement négative, l’expression des molécules HLA de classe I et II par les CSM devient positive après induction de la différentiation chondrogénique par le TGF-P3 Cette variabilité des résultats est vraisemblablement due aux différences dans les protocoles utilisés. Ainsi, il a été démontré que le profil immunogénique des CSM du tissu adipeux pouvait changer in vitro en fonction des conditions de culture. L’expression des molécules HLA (de classe 1 et II) et des molécules de co-stimulation varient considérablement selon les passages et les cellules sont considérées peu immimogéniques à partir du passage 1
167
Les CSM isolées de la gelée de Wharton doivent également être tolérées lors des transplantations et éviter d’induire une réponse immune chez le receveur. Comme attendu, ces CSM expriment les molécules HLA de classe I mais pas celles de classe II *^*469 L’exposition à l’IFN-y augmente l’expression des molécules HLA de classe I et l’induction de celles de classe II Weiss et al, démontrèrent l’absence d’expression des molécules de co
stimulation (CD80, CD86, CD40) Cependant, certaines divergences apparaissent dans la littérature au sujet de l’expression et de la modulation de ces molécules. Ainsi, il a été observé que les CSM de la gelée de Wharton pouvaient exprimer le CD80 mais n’induisaient pas l’expression des molécules HLA de classe II en réponse à l’IFN-y malgré la présence du CIITA Contrairement à celles de la MO les CSM de la gelée de Wharton cultivées en présence de FGF n’expriment pas les molécules HLA de classe II 175
18
Contrairement à ce qui a été observé pour les CSM médullaires, aucune fonction CPA n’a été jusqu’à présent décrite pour les CSM isolées du tissu adipeux ou de la gelée de Wharton.
Les CSM jouissent d’un statut immunologique privilégié grâce à leur faible immunogénicité.
Cependant, au coms d’une infection ou inflammation durant lesquelles l’IFN-y peut être sécrété, ce statut peut changer et les CSM peuvent devenir immunogéniques suite à la modulation de l’expression des molécules HLA. Il est important de définir les conditions pouvant stimuler le caractère immunogénique des CSM et qui seraient critiques lors des applications cliniques.
1.5.4. Capacités d’immunomodulation
Le système immunitaire regroupe un ensemble de mécanismes biologiques permettant à l’organisme de reconnaître et tolérer le soi du non-soi. L’immunité innée (non spécifique) et l’immunité adaptative (spécifique) sont deux processus interagissant et se complétant mis en jeu lors des réponses immunes et des rejets d’allogreffes L’utilisation thérapeutique des CSM nécessite la caractérisation de leurs effets immunomodulateurs sur les différents acteurs de la réponse immune afin d’en comprendre les mécanismes et surtout d’augmenter leur efficacité dans un contexte clinique. C’est dans le cadre de ces études sur les transplantations cellulaires que Liechty et al, suggérèrent que les CSM devaient posséder des effets immunomodulateurs leur permettant d’échapper à la surveillance immunitaire et ainsi persister dans un environnement xénogénique Les CSM exercent leurs effets immunomodulateurs via différents mécanismes de régulation des cellules immunes.
Tableau 8 : Récepteurs des CSM impliqués dans Timmunorégulation
Activités des CSM Récepteurs des CSM Contre-récepteurs sur les cellules immunes
Inhibition prolifération des cellules T
HLA-G Jagged-1 PD-1 pathway
ILT2 Notch
PD-1,PD-L1,PD-L2
Induction de Tregs CD58
CD54
CD2 CDlla
Présentation Ag aux CD4 MHC class II VCAM-1
TCR, CD4 CD49d
Présentation Ag aux CD8 MHC class I TCR, CD8
Stimulation prolifération des cellules T
MHC class II TCR, CD4
Support de la sécrétion d’Ig par les cellules B
ICAM-I CDlla
Adapté de Newman et al. Inflammation & Allergy-Drug Targets 2009
Figure 18 : Effets des CSM sur l’immunité innée
INNATEIMMUNITY
-inhAttsNKacfivaticn - inhiltt NK prolifération
- inhiCiits neutrapliil apoptoeis
-inhiiitspro*
inllamralory cytokine secrefion
- inhiiit» dReremiatioiv fmm mocjocyte -InMitsexpreswnof a>slniula(oiy tnalecutes 'inMbitspro- inflaneriatorv cytokine
sécrétion Osndritic C^l
Adapté de Newman et al, Tnflamm Allergy Drug Targets. 2009
