1.5. Propriétés des CSM
1.5.4. Capacités d’immunomodulation
Le système immunitaire regroupe un ensemble de mécanismes biologiques permettant à
l’organisme de reconnaître et tolérer le soi du non-soi. L’immunité innée (non spécifique) et
l’immunité adaptative (spécifique) sont deux processus interagissant et se complétant mis en
jeu lors des réponses immunes et des rejets d’allogreffes L’utilisation thérapeutique des
CSM nécessite la caractérisation de leurs effets immunomodulateurs sur les différents acteurs
de la réponse immune afin d’en comprendre les mécanismes et surtout d’augmenter leur
efficacité dans un contexte clinique. C’est dans le cadre de ces études sur les transplantations
cellulaires que Liechty et al, suggérèrent que les CSM devaient posséder des effets
immunomodulateurs leur permettant d’échapper à la surveillance immunitaire et ainsi
persister dans un environnement xénogénique Les CSM exercent leurs effets
Tableau 8 : Récepteurs des CSM impliqués dans Timmunorégulation
Activités des CSM Récepteurs des CSM Contre-récepteurs sur les cellules immunes Inhibition prolifération des cellules T HLA-G Jagged-1 PD-1 pathway ILT2 Notch PD-1,PD-L1,PD-L2 Induction de Tregs CD58 CD54 CD2 CDlla Présentation Ag aux CD4 MHC class II
VCAM-1
TCR, CD4 CD49d
Présentation Ag aux CD8 MHC class I TCR, CD8
Stimulation prolifération des cellules T
MHC class II TCR, CD4
Support de la sécrétion d’Ig par les cellules B
ICAM-I CDlla
Adapté de Newman et al. Inflammation & Allergy-Drug Targets 2009
Figure 18 : Effets des CSM sur l’immunité innée
INNATEIMMUNITY -inhAttsNKacfivaticn - inhiltt NK prolifération - inhiCiits neutrapliil apoptoeis -inhiiitspro* inllamralory cytokine secrefion - inhiiit» dReremiatioiv fmm mocjocyte -InMitsexpreswnof a>slniula(oiy tnalecutes 'inMbitspro- inflaneriatorv cytokine sécrétion Osndritic C^l
1.5.4.1. Interactions des CSM avec les cellules immunes
Les CSM peuvent interagir avec l’environnement cellulaire qui les entoure et y exercer
leurs effets Les CSM expriment plusieurs familles de molécules d'adhésion cellulaire
régissant leur interaction et adhésion avec de nombreux autres types cellulaires ’ ’ .
Les molécules d’adhésion ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), VCAM-1 (CD106), LFA-3
(CD58) et Lmtégrine VLA-a5 (CD49e) sont impliquées dans les interactions avec les
lymphocytes T ^*'482 pl^sJeuJ.g familles de récepteurs et leurs ligands semblent impliqués
dans rimmunomodulation (Tableau 8). Suva et al'*^, démontrèrent que les interactions entre
CSM et lymphocytes T sont essentielles pour l’établissement de l’immunomodulation. A la
suite de leur activation, les lymphocytes T se lient et migrent au sein des CSM et deviennent
ainsi sensibles à leurs effets
1.5.4.2. Effets des CSM sur l’immunité innée
L’immunité innée consiste en une série de systèmes de défense non spécifiques et
représente la première ligne de défense vis-à-vis des agents infectieux et pathogènes. Les
CSM peuvent interagir avec les différents éléments de l’immunité innée (Figiare 18) mais
aussi directement moduler les infections nticrobiennes. Récemment, Krasnodembskaya et al.
démontrèrent que les CSM médullaires possèdent une activité anti-bactérienne. La
sécrétion par les CSM de la cathélicidine humaine hCAP-18/LL-37 serait en partie
responsable de l’inhibition de la croissance bactérienne A l’heure actuelle, il y a peu
d’études ayant évalué et caractérisé les effets des CSM isolées à partir du tissu adipeux ou de
1.5.4.2.1. CSM et le système du complément
Le système du complément intervient dans la réponse immunitaire et dans rinflammation
participant aux mécanismes de défense de l’organisme. L’activation du complément aboutit à
la formation de divers composants dont les anaphylatoxines C3a et C5a décrites pour leurs
capacités à recruter les CSM issues de la MO, à les protéger des dommages oxydatifs dans les
tissus endommagés et surtout à prolonger l’activation de certaines voies de signalisation
importantes à leur survie et fonctions Les CSM sont également capables de bloquer
l’activation du complément notamment à travers la sécrétion d’un inhibiteur appelé facteur H
et l’expression de régulateurs négatifs membranaires incluant le CD46 (membrane cofactor
protein, MCP), le CD55 (decay acceleratmg factor, DAF) et le CD59 (protectine) De cette
manière, les CSM sont protégées du complément et peuvent échapper au rejet aigu ou h)q>er-
aigu observé lors des transplantations d’organes
1.5.4.2.2. CSM et les neutrophiles
Les fonctions principales des neutrophiles sont la phagocytose et la destruction des micro
organismes pathogènes, des cellules anormales ou étrangères mais contribuent aussi au
processus inflammatoire. Au coms d'rme transplantation d'organe, les neutrophiles sont attirés
vers les tissus greffés par chimiotactisme et y induisent des dommages et des lésions
tissulaires. Cet influx précoce de neutrophiles va favoriser le processus de rejet en stimulant
les phases d’induction et effectrices des lymphocytes T L’interaction des CSM avec les
neutrophiles n’a pas été largement étudiée mais des observations suggèrent plusieurs effets
des CSM issues de la MO sur les neutrophiles. Raffaghello et al ont rapporté que les CSM
à faible concentration pouvaient inhiber l’apoptose et atténuer le métabolisme oxydatif des
neutrophiles. Cet effet anti-apoptotique est indépendant du contact cellulaire et l’interleukine
(IL)-6 semble en être le principal acteur. Récemment, il a été démontré que des CSM
sensibilisées par du lipopolysaccharide (LPS) induisaient le recrutement des neutrophiles
d'une manière dépendante de l’IL-8 et du facteur d'inhibition de la migration des macrophages
(Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF). Les neutrophiles ainsi recrutés présentent
une augmentation de leur durée de vie (réduction de l’apoptose) ainsi que de l’expression de
chémokines pro-inflammatoires Les CSM semblent donc prolonger la vie des neutrophiles
et préserver leurs fonctions pour faire face aux infections.
1.5.4.2.3- CSM et les macrophages
Les macrophages participent principalement aux défenses non spécifiques (phagocytose),
contribuent à l’immunité adaptative et jouent un rôle dans la résolution de l’inflammation et la
réparation tissulaire Les macrophages peuvent s’adapter à leur environnement par un
changement et une modulation de leurs fonctions Dans im modèle expérimental
d’ischémie cérébrale, l’adininistration de CSM humaines permet de re-programmer les
macrophages conduisant à leur activation et à l’induction d’un phénotype anti-inflammatoire
Dans ce sens, Kim et al. démontrèrent que des macrophages pouvaient devenir anti
inflammatoires après co-culture avec les CSM. Ces macrophages exprimant le CD206
(marqueur des macrophages anti-inflammatoires ^^^) ont une activité de phagocytose élevée et
sécrètent des taux élevés de cytokines de type Th2 (IL-10 et IL-6) Il apparaît que les CSM
modulent les macrophages pour les rendre anti-inflammatoires favorisant ainsi la réparation
tissulaire.
L5.4.2.4. CSM et les cellules naturelles tueuses
Les cellules naturelles tueuses (en anglais natural killer, NK) sont des cellules de
l'immunité muée dont la fonction est la lyse non spécifique et sans activation préalable des
micro-organismes. On en distingue deux types : les NK et les NKT (tueurs naturels T). Les
NK se différencient des NKT du fait qu’elles n’expriment pas de TCR (T-cell Receptor) ni de
molécules CD3. Ces cellules rntervieiment dans les mécanismes de rejet et de la maladie du
greffon contre l’hôte (Graft Versus Host Disease, GVHD). Initialement, il a été observé que
les CSM issues de la MO n’étaient pas sensibles à la lyse des cellules NK et n’interféraient pas avec leur fonction cytotoxique Bien que Aggarwal et al rapportent une inhibition
de la sécrétion d’IFN-y, une autre étude observe au contraire l’augmentation de cette
sécrétion et l’activation (expression du CD69) des cellules NK en présence de CSM. Les
CSM altèrent le phénotype, inhibent la prolifération, la sécrétion de cytokines et la
cytotoxicité des cellules NK activées d’une manière dose dépendante. Cette inhibition ne
requiert pas de contact cellulaire et semble liée à la production de facteurs solubles tels que le TGF-P, la prostaglandine E2 (PGE2) et l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) Les
cellules NK peuvent être activées par xme série de cytokines différentes et entraîner la lyse des
CSM autologues ou allogéniques La cytotoxicité induite par les cellules NK activées
est vraisemblablement consécutive à l’activation des récepteurs NKp30, NKG2D et DNAM-1
200,202,204 poiurait impliquer des voies apoptotiques à travers l’expression des protéines TRAIL et FasL (CD95L) La stimulation par l’IFN-y permet de prévenir la lyse induite par
les cellules NK activées probablement à travers une augmentation des molécules HLA de classe 1 ou bien suite à la réduction de l’expression de ULBP3 au niveau des CSM ’ . Cette cytotoxicité des cellules NK peut également être prévenue en présence de monocytes
qui potentialisent la sécrétion d’IFNy ou bien par l’utilisation d’un anticorps monoclonal anti-
CD 16
Une sous population de cellules NKT dites cellules NKT invariantes (iNKT) est
également décrite pour interagir et être modulée par les CSM. Alors que leur activité
cytotoxique n’est pas modulée, l’expansion, la prolifération et la production d’IFN-y par les
iNKT sont inhibées en présence de CSM par l'intermédiaire de la PGE2. Contrairement aux
cellules NK, les cellules iNKT activées n’induisent pas la lyse des CSM
L’interaction entre CSM et cellules NK est complexe et les deux types cellulaires sont
sujets à une modulation réciproque. Cette modulation dépend de plusieurs facteurs parmi
lesquels l’état des cellules (activées ou non) et la présence ou non d’IFN-y dans le milieu.
1.5.4.2.5. CSM et cellules dendritiques
Les cellules dendritiques (dendritic cells, DC) sont présentes dans divers tissus où elles
exercent des fonctions de sentinelles du système immunitaire. Suite à la capture de l'antigène,
les DC vont d’abord induire une réponse innée puis migrer vers les zones lymphoïdes où elles
présenteront l’antigène (cellules présentatrices d’antigène, CPA) aux lymphocytes T induisant
ainsi une réponse immunitaire adaptative. Les DC sont donc à l'interface entre l'immunité
innée et l'immunité adaptative et font le lien entre ces deux types de réponse.
Indépendamment de leur source d’isolement, les cellules stromales sont capables de réguler la
différenciation et les fonctions des DC dont l’impact est particulièrement important en cas
d’applications thérapeutiques (transplantations, maladies auto-immunes). La différenciation et
la maturation des DC dérivées de monocytes ou de progéniteurs CD34"^ sont inhibées en
présence de CSM. Après co-culture avec les CSM, les DC présentent un phénotype altéré. Il y
a réduction de l’expression des molécules de co-stimulation ainsi que celle du HLA-DR. Les
CSM modulent également différentes fonctions des DC. Les fonctions d’endocytose, de
présentation d’antigène et de stimulation des lymphocytes T sont atténuées dans les co
cultures de CSM. Les CSM modifient le profil de sécrétion cytokinique des DC puisqu’on
constate une augmentation de la sécrétion d’IL-10 et une diminution de celle de TIL-12, du
TNF (tumor necrosis factor)a, de l’IFNy et du TGpp. Ces effets immunomodulateurs 216
M-Figure 19 : Effets des CSM sur l’immunité adaptive ADAPTIVEIMMUMITY C - înhibfts T-cel ^ prolflwition V - pfomotes anih W inibmmaitory cytoliine
W
taention E»ectorT^«li , mflammaitixy qrtokine sécrétion - inhibitsCTL activateninhibits IFI^ and TNFa secietxMi - supports génération ofTres* Régulâtory T^^êll - nhibits B-oei prolifeQtloft - inhibits Ig praductiort B<«ll
CSF (macrophage colony stimulating factor) et la PGE2. D’autre part, les CSM sont capables
d’entraîner l’arrêt du cycle cellulaire des monocytes en phase GO probablement associé à
l’inhibition de l’expression de la cycline D2 L’induction de l’apoptose constitue un autre
mecamsme par lequel les CSM exercent leurs effets immunomodulateurs sur les DC . Bien
que leur action sur les lymphocytes T soit principalement directe, les CSM peuvent agir
autrement en générant une population de CPA dites « régulatrices » capables d’inhiber les
lymphocytes T L'interaction entre les lymphocytes T et les CPA s'accompagne de la
formation d'une zone de contact cellulaire appelée la synapse immune. Récemment, il a été
rapporté que les CSM entravaient la formation par les DC d’une synapse active avec les
lymphocytes T. Cette incapacité à établir une synapse active et donc d’induire une activation
efficace des lymphocjdes T, est probablement due à im défaut de réorganisation du
cytosquelette d’actine mais aussi de l’expression de Racl
Il existe cependant des divergences entre ces études concernant la dépendance aux
contacts cellulaires et aux concentrations de CSM ainsi qu’à la réversibilité des effets sur les
DC.
1.5.4.3. Effets des CSM sur l’immunité adaptive
L’immunité adaptive désigne la réaction immunitaire dirigée contre des antigènes
aboutissant à l’activation spécifique des lymphocytes. Elle prend le relais de l’immunité innée
et fait intervenir une réponse cellulaire (intervention des lymphocytes T) et une autre humorale
(production d’anticorps après différenciation des lymphocytes B). Les CSM exercent de
1.5.4.3.1. CSM et lymphocytes T
CSM de la moelle osseuse
À la suite des travaux de Liechty et al, plusieurs groupes ont évalué les capacités
immunomodulatrices des CSM. La MO étant la source historique des CSM et les lymphocytes
T les principaux acteurs du rejet d’une allogreffe et de la GVHD, la majorité des études
décrivent les effets des CSM issues de la MO sur les lymphocytes T. Grâce aux techniques de
marquage au BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine), au CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate
succinimidyl ester) et au Ki67 (antigène nucléaire), il a été démontré que la prolifération des
lymphocytes en réponse à différents stimuli est modulée en présence de CSM. Les effets
inhibiteurs s’observent à forte concentration de CSM correspondant à des rapports cellulaires
élevés entre CSM et lymphocytes T. Les CSM médullaires ont le potentiel d'altérer toute
réponse lymphocytaire indépendamment du stimulus utilisé pour activer les lymphocytes T.
Ainsi, l’activation et la prolifération des lymphocytes induites par, des cellules mononucléées
du sang périphérique (CMSP) au cours d’une KLM (réaction leucocytaire mixte) ou par des
DC allogéniques, des lectines mitogènes (phytohémagglutinine, PHA; concanavaline A, ConA;
mitogène Pokeweed, PWM), de l'acétate myristate de phorbol (PMA), des cytokines (IL-2, IL-
7, IL-15), des dérivés protéiques purifiés de tuberculine (Tuberculin Purified Protein
Dérivative ) ou par des anticorps monoclonaux ciblant le complexe TCR (anti-CD3, anti-
CD3/CD28), sont inhibées en présence de CSM Par contre, les CSM n’ont aucun effet
suppresseur sur des lymphocytes T répondant à des stimulations par des antigènes de rappel ou
viraux ^^^447 effets immunorégulateurs des CSM sont également indépendants du système
HLA. En effet, qu’elles soient allogéniques ou autologues, les CSM sont capables d’inhiber les
réponses lymphocytaires démontrant qu’il n’y a pas de restriction immunologique à l’inhibition
exercée par les CSM ‘48;i50;227-229^
Figure 20 : Mécanismes moléculaires d’immimomodulation Vocifération Cytotoaicity Proiife ration Différentiation If Production i Infihratian Graft Graft Indiuced InflaiTunation PGE-2 IFN'V TCF-B Treg TNF-a HLA-G5 IL-IP Notch Sigrtalling PGE-2 ■pSF^ BMSC Activation NO IDO Maturation HLA-OS Proiiferartion Cytotoxicity C025 CCR7 E-cadherin
D’après toutes ces études, il est généralement admis que l’immunomodulation des
lymphocytes T est dépendante de la concentration des CSM, que le contact intercellulaire n’est
pas absolument requis et que ces effets sont réversibles. Par ailleurs, les CSM ciblent toutes les
sous populations de lymphocytes T sans aucime discrimination. L’inhibition porte aussi bien
sur les lymphocytes T CD4, CD8, CD45RA (naïfs) et les CD45RO (mémoires) prouvant que
l’immunomodulation des CSM n’est pas restreinte à une population lymphocytaire spécifique
mais englobe les différents sous types de lymphocytes T 225^30-232
Les CSM médullaires agissent sur les lymphocytes T à différents niveaux. Les effets
immunorégulateurs incluent non seulement l’inhibition de la prolifération mais aussi
l’activation des lymphocytes. En effet, les CSM réduisent l’expression des molécules CD25,
CD38 et CD69 connues pour être des marqueurs d’activation lymphocytaire ’ . Néanmoins,
pour certains groupes, l’effet immunosuppresseur des CSM n’est pas dû à ime inhibition de
l’activation des lymphocytes puisque l’expression de ces marqueurs n’est pas altérée par la
présence des CSM La molécule CD152 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4)
est un important régulateur négatif interne du processus d'activation lymphocytaire.
L’expression de CTLA-4 est différemment modulée selon la source des CSM. Contrairement à
la MO ou au tissu adipeux, seules les CSM de la gelée de Wharton sont capables d’augmenter
significativement l’expression du CD 152 à la surface des lymphocytes ^23,233 en
modulant l’activation des lymphocytes, les CSM peuvent atténuer la réponse immune.
Bien que les propriétés immunomodulatrices des CSM de la MO soient admises et
confirmées par la majorité des études, les mécanismes impliqués dans ces effets in vitro ne
sont pas encore complètement élucidés et les résultats rapportés dans la littérature sont
divergents (Figure 20). L’inhibition des lymphocytes T semble majoritairement liée à la
production par les CSM de facteurs solubles immunorégulateurs.
Figure 21 : Rôle immunomodulateur des galectiaes
Mesenchymal stromal cells
IL-10?
Parmi ces facteurs, le TGF-P, le HGF (hépatocyte growth factor), FIL-10, la PGE2, FIDO
et riGFBP (insulin-like growth factor binding protein) sont certes proposés comme des
candidats potentiels i99;2i8a22^30;234-237 contesté par d’autres études
I50;2i9a2ia37 Initialement impliquée dans la tolérance foeto-matemelle du fait de ses propriétés
immunorégulatrices, la molécule HLA-G est également décrite pour son rôle dans
Fimmunomodulation exercée par les CSM D’autres molécules telles que l’hème
oxygénase (HO)-l, le leukemia inhibitory factor (LIF), les galectines (Figure 21) et la
semaphorine-3A participent aux effets immunosuppresseurs des CSM sur les lymphocytes T
242-247 j^gg lytnpiiocytes T peuvent aussi être inhibés par l’expression de molécules
inhibitrices comme le B7-H1 (PD-Ll) dont le récepteur est le PD (programmed death)-l.
Cependant, malgré l’expression par les CSM médullaires du B7-H1, ce dernier ne semble pas
intervenir dans le processus d’inhibition des lymphocytes T Une autre hypothèse
avancée pour expliquer le mécanisme de suppression de la réponse lymphocytaire serait
l’induction par les CSM de l’apoptose des cellules T Néanmoins, cette observation est
unique puisque la majorité des études n’observent pas de phénomène de mort cellulaire. Les
lymphocytes T peuvent se retrouver dans un état de non réponse consécutif à ime inactivation
fonctionnelle par anergie. Selon Batten et al. l’anergie induite par les CSM serait à l’origine
de l’inhibition des lymphocytes T
Les CSM peuvent également moduler la réponse immime en agissant sur la balance
Thl/Th2. Selon l’environnement, la réponse immune peut être orientée vers une voie de type
Thl ou Th2, chacime caractérisée par un profil cytokinique particulier. Il apparaît ainsi, que
les CSM perturbent la balance Thl/Th2, altèrent le profil cytokinique et favorisent
l’émergence d’ime réponse de type Th2 '^^'248^49 effet, les CSM inhibent la différenciation
des lymphocytes Thl et réduisent la sécrétion des cytokmes pro-inflammatoires (IL-1, IL-2,
IL-17, IFNy, TNFa). Parallèlement à cet effet, elles polarisent la réponse immtme vers la voie
Th2 en induisant des lymphocytes Th2 et en augmentant la production de cytokines anti-
inflammatoires (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) et de la chémokine CCLl. Le shift vers
une voie de type Th2 pourrait ainsi contribuer à l’effet immunosuppresseur des CSM au coms
d’vme réponse immxme.
L’activité immunomodulatrice des CSM est dose dépendante puisque l’effet inhibiteur ne
s’observe qu’à forte concentration. Aux faibles concentrations de CSM, il n’y a pas d’effet
suppresseur mais au contraire on remarque une stimulation de la réponse lymphocytaire. Les
CSM présentent donc une activité bimodale (stimulation vs inhibition) dont l’orientation est
déterminée par la concentration de CSM en culture avec les lymphocytes. Il a été observé que
les CSM ou leurs milieux conditionnés (MC) pouvaient stimuler la réponse
lymphocytaire T. Par la suite, c’est Fang et al. qui introduirent pour la première fois l’idée de
l’existence d’ime balance entre les effets suppresseurs et stimulateurs des CSM Selon
cette étude, à faible concentration de CSM, il y a expansion des lymphocytes T et
augmentation de la sécrétion d’IL-2 démontrant les capacités allo-stimulantes des CSM.
Contrairement à cette observation c’est d’ime manière indépendante du HLA, que les
CSM à faible dose stimulent la réponse lymphocytaire allogénique ou mitogénique . Outre
leur capacité à doper la prolifération des lymphocytes T, les CSM promeuvent la survie de ces
cellules en interférant avec l’apoptose Plusieurs hypothèses sont avancées pour expliquer
la dualité entre les effets stimulateurs et inhibiteurs des CSM. La balance entre ces deux effets
serait dictée par le rapport cellulaire entre CSM et lymphocytes mais probablement aussi par
l’intensité de la réponse immune. En présence d’ime faible activation lymphocytaire, les CSM
à faible concentration vont supporter et même accroître la prolifération des lymphocytes T.
Par opposition, la suppression n’a lieu qu’en présence de CSM à forte concentration lorsque
des CSM implique également la sécrétion de facteurs solubles Le profil d’expression
du CD90 (Thy-1) pourrait intervenir dans la balance entre les effets stimulateurs et inhibiteurs