SUR LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE ?
par Jean-Benoît CORCUFF1, 2, 3 et Julie BROSSAUD1, 2, 3 (Bordeaux)
En routine d’hormonologie, la technique de spectrométrie de masse après chromato
graphie liquide (LCMS) a dorénavant pris ses marques pour le dosage des androgènes, du cortisol urinaire et des métanéphrines. Elle présente l’avantage incontestable d’une grande spécificité analytique avec toutefois une sensibilité qui dépend nettement de l’investissement financier dans un spectromètre très haut de gamme.
Nous décrivons dans ce travail 1/ les principes généraux de la LCMS et 2/ les applications de routine développées à ce jour en hormonologie. L’objet de la présentation est de familiariser les endocrinologues aux techniques en développement avec leurs avantages mais aussi leurs limites.
Mots-clés : spectrométrie de masse, hormones.
I. INTRODUCTION
L’engouement actuel, justifié, pour les techniques de dosage d’hormones par spectromé
trie de masse laisse penser que la technique est récente. En fait, ses prémisses remontent au XIXème siècle et la découverte des isotopes par cette technique en 1919 a valu le prix Nobel à FW Aston. Quarante ans plus tard était développé le premier spectromètre de masse couplé à une chromatographie en phase gazeuse ouvrant la possibilité de l’analyse des hormones stéroïdiennes par spectrométrie de masse (GCMS) (1). La GCMS a régné en maître pendant quelques décennies et ce n’est que dans les années 1980 que la chroma
tographie en phase liquide (LCMS) a pu prendre son essor en routine clinique. L’appa
reillage est en effet plus complexe mais en revanche, la préparation des échantillons est simplifiée car il n’est plus nécessaire de rendre volatiles les molécules d’intérêt pour leur introduction dans la phase gazeuse.
Parallèlement, une autre découverte, récompensée elle aussi par un prix Nobel (2), a cantonné, pendant de nombreuses années, l’utilisation de la spectrométrie de masse à quelques rares laboratoires très spécialisés. Il s’agit bien évidemment, des immunodosages dont la facilité de mise en œuvre, la sensibilité analytique et le coût modéré ont favorisé leur adoption rapide pour les dosages hormonaux. Ces immunodosages utilisaient initiale
ment des traceurs radioactifs. L’industrialisation des techniques a rapidement mené au développement d’une automatisation d’immunodosages chemiluminescents plus faciles à implanter réglementairement.
Depuis une dizaine d’années, les progrès technologiques ont permis un rattrapage des possibilités de mise en œuvre des techniques de LCMS en routine dans les laboratoires de
n n n n n n n n n n n n n n n n
biologie médicale. L’excellente spécificité de la LCMS offre un avantage analytique majeur par rapport aux immunodosages pour lesquels les réactions croisées sont fréquentes.
Néanmoins, contrairement aux immunodosages, la sensibilité de la LCMS n’est pas toujours suffisante pour quantifier correctement certaines hormones. Seuls les spectro
mètres les plus récents, et les plus onéreux, permettent d’atteindre une sensibilité analy
tique identique à celle des immunodosages. De plus, la LCMS est essentiellement adaptée à la quantification de petites molécules (PM < 1 000 Da) et moins à celle des protéines.
L’engouement pour la LCMS s’est introduit un peu brutalement dans un éditorial du JCEM déclarant que seuls les articles comportant des dosages de stéroïdes gonadiques par spectro
métrie de masse seraient acceptés. Cet éditorial prônant de manière prématurée un recours exclusif à cette technique (3) a fait débat et a permis une approche plus systématique des forces et faiblesses des techniques de dosages d’hormones. L’opposition simpliste LCMS versus immunodosages (méthode permettant une quantification exacte des stéroïdes, catécholamines... versus méthode économique, aisée et au large domaine d’utilisation) a été pondérée et les avantages et inconvénients respectifs mieux explicités (4).
Nous nous proposons donc ici de donner quelques pistes aux endocrinologues pour comprendre les principes de la spectrométrie de masse, découvrir ses intérêts en hormono
logie mais aussi en appréhender les limites.
II. QU’EST-CE QUE LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE ?
La spectrométrie de masse est une technique d'analyse permettant de détecter, d'identi
fier et de quantifier des molécules d’intérêt en fonction de leur masse. Son principe réside dans la séparation et la sélection de molécules chargées, des ions, selon leur rapport masse/
charge (m/z). Le terme de spectromètre de masse regroupe un certain nombre d’instru
ments très différents dont les finalités vont de la caractérisation structurale de molécules à la quantification. L’analyse quantitative d’hormones nécessite des spectromètres de masse de technologie triple quadripolaire (dit en tandem fonctionnant en mode Multiple Reaction Monitoring, MRM), alors que l’analyse de nombreuses molécules de type stéroïdomique est classiquement faite avec un simple quadripôle couplé à une chromatographie gazeuse. Le spectromètre comprend plusieurs éléments placés en série : une interface d’introduction et d’évaporation de l’échantillon, une source d’ionisation des molécules, un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur rapport m/z et un détecteur. Les échantillons sont acheminés à l’interface d’introduction après une chromatographie de séparation (en phase gazeuse ou liquide, respectivement GCMS et LCMS). L’association d’une telle méthode séparative couplée à un spectromètre de masse en tandem permet de garantir une spécifi
cité analytique importante.
Le principe de la chromatographie suivie de l’analyse MRM par spectrométrie de masse, est détaillé dans la revue de Wudy et al. (5). Brièvement, la séparation chromatographique des molécules d’intérêt repose sur leurs différences d’affinité pour des groupements molécu
laires greffés sur des microbilles de silice (insérées dans une colonne analytique). Ainsi, ces analytes sortiront de la colonne plus ou moins rapidement, ce qui permettra de les caractériser selon leur temps de rétention. Ils sont alors dirigés vers le spectromètre de masse, où ils subiront une ionisation (classiquement, gain ou perte d’un proton) puis une 1ère sélection selon le rapport m/z suivi d’une fragmentation de l’ion sélectionné et enfin une 2ème sélection selon le rapport m/z d’un des ions fils issu de la fragmentation. Cette double sélection considérée comme une signature moléculaire, est appelée « transition ».
Le passage d’une transition à une autre étant très rapide en comparaison du temps de sortie des analytes de la colonne analytique, il est possible de balayer plusieurs transitions et d’obtenir ainsi le dosage simultané de différents analytes.
Les techniques de GCMS ont été les premières développées en particulier pour le dosage des stéroïdes. Nécessitant une mise en œuvre complexe, elles sont réservées à des labora
toires très spécialisés avec une application en routine très limitée. L’arrivée d’une nouvelle génération de LCMS suffisamment sensible a permis le déploiement de cette dernière pour différentes applications de routine notamment hospitalières (voir paragraphe suivant), cantonnant l’utilisation de la GCMS à l’analyse stéroïdomique d’un large spectre d’ana
lytes (6).
Schéma d’un spectromètre de masse couplé à une chromatographie en phase liquide (LCMS) Les échantillons subissent leur traitement préanalytique (extraction, dérivatisation, etc.) avant d’être
injectés dans la colonne de chromatographie. Le spectromètre positionné en sortie de la colonne de chromatographie comprend plusieurs éléments placés en série : une interface d’introduction et d’évaporation de l’échantillon, une source d’ionisation des molécules, un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur rapport m/z. Les ions sont alors fragmentés puis triés en fonction de leur
rapport m/z et acheminés vers un détecteur. L’ensemble des signaux est alors analysé pour quantifier les analytes d’intérêt.
Pompes de chromatographie
Intégrations & calculs Intégrations & calculs
Colonne de chromatographie
Ionisation 1èreséleciton Fragmentation 2èmesélection Détection
Gaz
Echantillons à analyser
2ème d i l 2èmequadripole = cellule de collision
1erquadripole 3èmequadripole
Chaine de
chromatographie Spectromètre
de masse
Traitement préanalytique des échantillons biologiques préalable au dosage
La LCMS nécessite en amont une préparation de l’échantillon biologique, souvent chronophage et rarement automatisée. Ce traitement préanalytique consiste à extraire l’hormone à doser de sa matrice biologique pour éviter l’injection sur le système LCMS de quantité importante de protéines, de phospholipides, d’ions ou d’urée (en fonction de la nature du prélèvement). Il existe 3 grands types d’extraction : la précipitation protéique par un solvant organique, l’extraction liquide/liquide et l’extraction liquide/solide de type SPE (Solid Phase Extraction). Le choix du type de prétraitement dépendra de la nature physicochimique de l’analyte. Il peut également être nécessaire de réaliser une hydrolyse (libération des hormones conjuguées) et/ou une dérivatisation (silylation, acylation,
alkylation...). Si ces 2 dernières étapes sont indispensables dans le cas de la GCMS, elles peuvent être parfois utilisées également pour la LCMS. L’ensemble de ces traitements tend à améliorer la sensibilité et la spécificité analytique ainsi que la robustesse du dosage.
Utilisation d’un étalon interne
L’ensemble de ces étapes d’extraction, d’injection sur la colonne chromatographique, d’ionisation ou de détection, est à l’origine de perte d’une fraction des analytes à quantifier.
Cette perte, différente d’un échantillon à l’autre, est identifiée par la notion de rendement d’extraction des étapes préanalytique et analytique. L’évaluation de ce rendement rend indispensable l’utilisation d’un étalon interne isotopique c’estàdire une molécule de même structure que l’analyte à l’exception du remplacement d’un ou plusieurs atomes d’hydrogène, de carbone ou d’azote par un isotope stable moins répandu (deutérium, carbone 13 ou azote 15). Cet étalon interne, ajouté en quantité strictement identique dans tous les échantillons analysés, permet de s’affranchir des fluctuations de signal inhérentes aux différentes étapes du processus du fait d’un comportement analytique similaire. Il aura le même temps de rétention que l’hormone à doser mais une transition différente en raison de sa masse différente.
Les problématiques analytiques habituelles
Des problématiques communes à tous les dosages (et en particulier aux immunodosages) existent pour les dosages en spectrométrie de masse.
La question des sensibilités : Les concentrations physiologiques des hormones de bas poids moléculaire (stéroïdes, hormones thyroïdiennes, etc.) sont de l’ordre du nmol/L voire du pmol/L. La difficulté technique à quantifier leur concentration a donc constitué un frein important à l’utilisation de la LCMS en endocrinologie puisqu’il a fallu attendre des avancées technologiques récentes pour obtenir une sensibilité analytique suffisante, au moins équivalente à celle des immunodosages. De manière non surprenante, la sensibilité d’un dosage est fonction du coût du spectromètre. Les caractéristiques techniques de l’ioni
sation des analytes, du trajet des ions, du détecteur, etc., peuvent avoir un impact sur la sensibilité visàvis de différentes molécules. Ceci tient en partie aux molécules elles
mêmes. Ainsi, certaines configurations matérielles pourraient accroître la sensibilité pour certains composés et moins pour d’autres. En d’autres termes, une limite de quantification n’est pas identique pour toutes les molécules analysables.
Actuellement par exemple, la sensibilité des spectromètres est clairement suffisante pour doser des concentrations de testostérone chez un adulte mâle sain. Les concentrations les plus basses chez les femmes ne seront accessibles qu’aux meilleurs appareils et les niveaux prépubères en pédiatrie seront souvent indétectables. De la même façon, les concentra
tions d’œstradiol chez les fillettes et les femmes ménopausées ne seront pas encore acces
sibles en routine clinique.
La question des spécificités
La spécificité analytique repose à la fois sur les caractéristiques physicochimiques de l’hormone, conditionnant son temps de rétention sur la colonne analytique, et sur ses caractéristiques structurales, dont sa masse, lui conférant une transition qui lui est propre.
Cette méthodologie offre une garantie de doser uniquement l’analyte ciblé bien meilleure
que celle des immunodosages pouvant être mis en défaut par des réactions croisées. Cette supériorité analytique avait valu la publication de l’éditorial du JCEM encourageant forte
ment les auteurs à utiliser la LCMS pour le dosage des stéroïdes (3).
Il est néanmoins important de souligner qu’il existe, même avec la LCMS, des cas d’interférence analytique liée à la matrice de l’échantillon ou même de réactions croisées.
Ainsi, par exemple la testostérone et la DHEA ou le 11désoxycortisol et la corticostérone, sont des isomères de position présentant des transitions communes obligeant une sépara
tion chromatographique soignée.
La question de la standardisation
Si la supériorité des performances de la LCMS pour le dosage de certaines hormones est largement admise, certains auteurs ont pu récemment souligner quelques limites en termes de variabilité analytique, notamment dans les basses concentrations, et de standardisa
tion (79). Ces comparaisons entre plusieurs méthodes de LCMS ont conduit à mettre en place des programmes de standardisations (10, 11). La revue de la littérature de Tavita et Greaves montrent que ce défaut d’homogénéisation du rendu des résultats en LCMS reste une problématique critique conduisant à des valeurs de référence, notamment pour les stéroïdes en pédiatrie, encore différentes d’un laboratoire à l’autre (12).
Difficultés spécifiques
La principale difficulté des analyses par spectrométrie de masse réside dans l’impérieuse nécessité d’avoir une préparation préanalytique de grande qualité. En effet, il est, comme nous l’avons décrit plus haut, impossible d’analyser directement le sérum ou le plasma comme pour les immunodosages.
D’autre part, il existe des interférences analytiques liées à l’environnement moléculaire dans lequel se trouve l’hormone à doser, communément groupées sous le terme d’effets matrice. Globalement, en spectrométrie de masse, ces interférences sont dues à des molécules qui peuvent amplifier ou diminuer le signal attendu d’une molécule à analyser.
Ce phénomène est principalement en lien avec la favorisation ou la compétition, voire l’inhibition, de l’ionisation de l’analyte d’intérêt par des molécules de la matrice (13). Cet effet matrice peut s’avérer être très problématique notamment lors de l’extinction total du signal. Les mesures préventives à mettre en œuvre pour éviter cet effet sont : 1) une extrac
tion appropriée de la molécule à doser, 2) des conditions chromatographiques permettant de séparer la molécule à doser de celle(s) responsable(s) de l’effet matrice, 3) si l’effet sur le signal est modéré, l’utilisation d’un étalon interne isotopique permet de garantir une quantification correcte en corrigeant ce gain ou perte de signal.
À côté de cette difficulté technique ; il est important de souligner que l’analyse par spectrométrie de masse nécessite une mise en œuvre en série de dosages impliquant un temps d’analyse directement lié au temps de passage à travers la colonne chromatogra
phique. Selon les performances de cette chromatographie et la nécessité de séparer des analytes très proches, les temps d’analyse en LCMS sont classiquement compris entre 2 et 20 minutes par échantillon. Ainsi, contrairement aux immunodosages automatisés capables de travailler en parallèle, les débits analytiques des spectromètres de masse sont nettement réduits.
III. QUE PEUT-ON DOSER AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE EN ENDOCRINOLOGIE ?
En routine
En routine clinique hormonologique, de petites molécules sont dosées par LCMS (stéroïdes, amines, vitamine D). La matrice initiale peut être sérique/plasmatique, urinaire ou salivaire. Il existe à l’heure actuelle une certaine hétérogénéité des ressources analy
tiques dans les différents laboratoires d’hormonologie équipés de spectromètres de masse.
Cette hétérogénéité est la conséquence de situations locales variables (intérêts « scienti
fiques » des services cliniques et des laboratoires, proximité avec un laboratoire utilisant la technique (pharmacologie, biochimie, etc.), fermeture de laboratoires de radioanalyse...).
Par ailleurs, des fournisseurs de réactifs ont développé des trousses « clef en main » pour doser un certain nombre de paramètres souvent associés dans une même trousse (par exemple 10 stéroïdes). Les avantages sont principalement un gain de temps initial sur le développement de la technique de dosage ainsi qu’une simplification des procédures d’accré
ditation COFRAC (Comité Français d'Accréditation). Les inconvénients sont les coûts supérieurs aux techniques « maison » et souvent l’adjonction dans la trousse de com posés qu’il est rarement nécessaire de doser en routine en LCMS (cortisol sérique par exemple).
Nous ne présenterons pas ici un catalogue de ce qui peut être dosé mais illustrerons, pour certaines analyses, les avantages et inconvénients à utiliser une technologie par spectrométrie de masse.
Cortisol urinaire
Doser le cortisol libre urinaire (CLU) fait partie des recommandations pour la recherche d’un hypercorticisme (14). Cependant, le CLU représente une fraction pondérale très faible comparée à l’excrétion de ses métabolites et du cortisol conjugué avec qui il partage des épitopes antigéniques. Il y a donc un risque de réactions croisées surévaluant la concen
tration de CLU par les immunodosages. De manière similaire, les réactions croisées sont majeures avec certains glucocorticoïdes de synthèse tels que prednisone et prednisolone.
L’utilisation de spectrométrie de masse pour le dosage du CLU s’affranchit de ces problèmes.
Le dosage du CLU est rapide et ne nécessite pas de spectromètre de masse très sensible (plus coûteux).
À noter qu’il n’existe pas de trousse de dosage proposée par les industriels et que chaque laboratoire doit mettre au point sa technique. Afin de réduire au maximum les biais inter
laboratoires dus aux différences de techniques d’extraction ou de calibration par exemple, nous avons dû entreprendre des comparaisons analytiques exhaustives (15). Cependant, la technique n’est pas exempte de difficulté comme des effets matrice suppresseurs d’ion (cf.
plus haut). Citons par exemple, un antibiotique, la pipéracilline qui peut diminuer consi
dérablement le signal de certaines transitions du cortisol (16).
Stéroïdes sériques
Le dosage des stéroïdes sériques par LCMS est devenu un élément important dans le diagnostic de certaines pathologies telles que celui des différentes hyperplasies congéni
tales des surrénales. En effet, les immunodosages des stéroïdes recherchés nécessitent le plus souvent une extraction et une chromatographie préalables en raison des réactions croisées entre ces stéroïdes de structures très proches. De plus, les différents dosages demandés ne peuvent souvent pas tous être réalisés en raison de prélèvements sanguins en
quantité insuffisante chez les enfants. La spectrométrie de masse permettant de doser en une analyse de multiples stéroïdes à partir de quelques centaines de microlitres de sérum est particulièrement utile ici. Nous n’avons quasiment plus dans notre laboratoire l’impos
sibilité de rendre des résultats des stéroïdes en pédiatrie au motif de prélèvement en quantité insuffisante. Par ailleurs, il existe un certain nombre de publications, en particu
lier en pédiatrie qui permettent d’éviter à chaque laboratoire d’élaborer ses propres valeurs de référence (sous réserve de vérification locale cependant) (1719).
Métanéphrines
Le dosage des métanéphrines plasmatiques ou urinaires est l’analyse de choix pour la recherche de phéochromocytome et de paragangliome (20). Cette analyse est possible, après HPLC, par électrochimie ou spectrométrie de masse. L’électrochimie est une tech nique très sensible, moins coûteuse mais aussi analytiquement moins spécifique que la spectrométrie de masse (i.e. avec des interférences analytiques plus fréquentes). Les dosages urinaires ne nécessitent pas de spectromètre de masse très sensible et ont été les premiers à être convertis de l’électrochimie à la spectrométrie de masse. En revanche, les dosages plasmatiques poussent les spectromètres de masses utilisables en routine de labora
toire à la limite de leurs possibilités. Rares sont donc les centres qui ont, à ce jour, installé ce dosage en routine et en particulier pour la méthoxytyramine. Avec des machines haut de gamme, les avantages analytiques seraient une sensibilité équivalente à l’électrochimie avec moins d’interférences et un temps d’analyse plus court. En termes cliniques, il n’y a pas de différence de performances entre les dosages par électrochimie ou spectrométrie de masse : la précision clinique dépend de la position au prélèvement et de la prévalence dans la population étudiée (20). A noter que la spectrométrie de masse n’a pas aboli totalement l’existence d’interférences analytiques en particulier lors de la prise de molécules structu
rellement apparentées [prise de MDMA (ecstasy), traitement par LDOPA] (2123).
Vitamine D
Il existe un certain nombre de controverses à propos des concentrations sériques souhai
tables de vitamine D au regard des conséquences sur les niveaux de PTH et des consé
quences sur l’organisme. Or, établir des valeurs de références dépend étroitement de la standardisation des dosages voire de la discrimination entre les différentes formes de vitamine D n’ayant pas forcément les mêmes effets biologiques. Les différents immunodo
sages automatisés de vitamine D ne distinguent pas le cholécalciférol de l’ergocalciférol [pour revue (24)]. Le dosage par LCMS peut donc servir de méthode de référence pour séparer ces 2 molécules mais il reste difficile de séparer leurs épimères (séparation du 3épi25(OH)D3 de la vitamine D en particulier) (25). La plupart des immunodosages montrent des résultats globalement bien corrélés à ceux de la LCMS mais avec souvent des biais justifiant de possibles différences dans les valeurs de références de chaque dosage (26). Comme souvent, ceci peut affaiblir la valeur d’un consensus sur des valeurs cibles.
Comptetenu du débit analytique possible des automates d’immunoanalyse, ils sont indis
pensables dans les indications de routine même si dans certains pays, le dosage par LCMS est très implanté. Une standardisation via la LCMS comme technique de référence facili
tera l’application de consensus ainsi que des études spécialisées plus poussées.
En fonction du contexte local, certains dosages sont disponibles en LCMS tels que cortisol salivaire (diagnostic de syndrome de Cushing), métabolites du cortisol [diagnostic de blocage de la 11bétaHSD par l’acide glycyrrhizique ou par mutation, diagnostic sécré
toire des incidentalomes (27)].
Hors routine
Un certain nombre de dosages sont possibles par spectrométrie de masse, mais pour lesquels la technique n’est pas nécessaire en routine ou en première intention. Par exemple, dans certains centres, un nombre très important de demandes de cortisolurie causerait un encombrement majeur des spectromètres. La stratégie est alors de réaliser un immunodo
sage en première intention et de confirmer/infirmer une valeur élevée par LCMS. Le principal risque de l’immunodosage est en effet la surévaluation par réaction croisée qui sera éliminée par LCMS. D’autres centres reçoivent une moindre demande d’analyses et disposent de suffisamment de spectromètres anciens mais dotés de performances suffi
santes pour le dosage du cortisol urinaire. Ils trouveront alors plus intéressant de doser le CLU en LCMS en première intention.
Une technique par LCMS permet parfois de résoudre des problèmes d’interférences analytiques mises en évidence avec un immunodosage. Nous avons ainsi rapporté un cas d’hypercalcémie avec des concentrations très élevées de vitamine D (quantifiée avec un immunodosage) (28). Il s’agissait en fait d‘une interférence analytique majeure par une immunoglobuline monoclonale myélomateuse qui interférait avec l’immunodétection. La LCMS a permis de lever l’interférence et de montrer que l’hypercalcémie n’était pas due à une intoxication à la vitamine D.
L’immunodosage de la thyroxine libre est un des dosages hormonaux les plus prescrits.
Cependant, techniquement, ce dosage n’est pas exempt de difficultés en raison de sa dépendance aux variations souvent méconnues quantitatives et qualitatives des protéines porteuses de cette hormone. Ceci est par exemple observable en service de soins intensifs où le dosage de la thyroxine libre après ultrafiltration et LCMS montre des concentrations doubles par rapport à un immunodosage pourtant sans biais pour des sujets hors soins intensifs (29). Par ailleurs, la corrélation entre immunodosages de thyroxine et dosage après ultrafiltration et LCMS est moins bonne pour les concentrations s’éloignant des valeurs de référence, là où pourtant la précision analytique est importante (30). Il n’est bien entendu pas imaginable de proposer en routine ce type de dosage pour la thyroxine mais potentiellement de le réserver par exemple aux études effectuées chez des patients dont les protéines porteuses sont altérées, aux cas complexes où on suspecte des anomalies qualitatives de la thyroxinbinding globulin, etc. (31).
En recherche
L’analyse par LCMS permet également de doser des peptides et des protéines. L’analyse des petits peptides est faisable sans trop de difficultés techniques avec un appareillage dont la sensibilité doit être adaptée aux concentrations attendues. On peut ainsi par exemple étudier différentes formes moléculaires des angiotensines (32), du BNP (33), de la ghréline (34), du PTHrP (35), etc. Parfois, il peut être utile de coupler la LCMS à une étape prépa
ratoire de purification par immunoaffinité (36). L’analyse de hormones protéiques, si elle est possible reste difficile [e.g. hormone de croissance ou IGF1 (37, 38)]. Les protéines doivent être hydrolysées enzymatiquement de manière contrôlée puis un ou plusieurs peptides protéotypiques doivent être identifiés. La quantification se fait par comparaison avec l’hydrolyse d’une quantité connue de la même protéine marquée, si elle est disponible, ou à défaut des peptides prototypiques marqués.
L’analyse par LCMS permet de doser des stéroïdes dans les tissus pour appréhender les concentrations tissulaires, différentes des concentrations circulantes. Chez l’homme, on a
pu ainsi mettre en évidence des concentrations différentes de testostérone et d’œstradiol entre les tumeurs malignes ou bénignes de la prostate (39). Chez l’animal, on peut par exemple étudier le métabolisme cérébral des neurostéroïdes (40) ou, comme dans notre laboratoire, le métabolisme inactivateur réversible des glucocorticoïdes dans des modèles de diabète (41).
IV. LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE NON QUANTITATIVE
La technologie sur laquelle repose la spectrométrie de masse peut être utilisée à d’autres fins que des dosages. La technique MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) peut ioniser des molécules sur une surface. Ces dernières se décrochent de la surface et peuvent être recueillies et analysées dans un spectromètre de masse. C’est une technologie utilisée en bactériologie pour établir des profils moléculaires spécifiques permettant l’iden
tification rapide des bactéries.
La technique peut être appliquée à des coupes tissulaires permettant ainsi d’identifier les molécules présentes dans une zone ciblée par le laser. Les images obtenues se rappro chent de celles obtenues en histologie avec d’un immunomarquage mais avec la possibilité de réaliser l’identification, sur la même coupe, d’un très grand nombre de molécules de petite taille (amines biogènes, stéroïdes mais aussi métabolites tels que ATP, créatine, acide arachidonique etc.) (42). Appliquée à l’endocrinologie, cette technique de recherche se prête particulièrement à l’étude de tissus avec des métabolismes différents qui expriment des hormones accessibles à cette méthode tels que les surrénales (43) ou en neuroendocri
nologie (42, 44).
V. CONCLUSION
La LCMS permet en routine un dosage de stéroïdes sériques, du cortisol urinaire ou des métanéphrines avec un avantage incontestable d’une grande spécificité analytique en comparaison des immunodosages. Beaucoup de laboratoires ont développé des techniques maison par choix ou par nécessité. Ceci rend indispensable la mise en place de compa
raisons interlaboratoires des valeurs obtenues avec des techniques différentes tout autant qu’avec les immunodosages. Par ailleurs, l’investissement financier nécessaire à l’obtention d’un spectromètre très haut de gamme ainsi que la grande spécialisation des personnels impliqués va probablement limiter la diffusion de certaines techniques à des laboratoires spécialisés. Les dosages de routine mais rares en LCMS (métabolites du cortisol, vitamine D...) resteront probablement limités à des laboratoires experts.
1 Laboratoire d’Hormonologie, Hôpital Haut-Lévêque, CHU de Bordeaux, 33604 Pessac, France.
2 Nutrition et Neurobiologie Intégrée, UMR 1286, Université de Bordeaux, 33076 Bordeaux, France.
3 Groupe de Biologie Spécialisée, Société́ Française de Médecine Nucléaire, 5 rue Ponscarme 75013 Paris, France.
Adresse pour la correspondance : Docteurs Jean-Benoît Corcuff et Julie Brossaud, Laboratoire d’Hormonologie, Hôpital Haut-Lévêque, CHU de Bordeaux, avenue de Magellan 33604 Pessac cedex, France.
E-mail : jean-benoit.corcuff@chu-bordeaux.fr - julie-brossaud@chu-bordeaux.fr
WHAT TO KNOW ABOUT MASS SPECTROMETRY ? A GUIDE FOR ENDOCRINOLOGISTS
by Jean-Benoît CORCUFF and Julie BROSSAUD (Bordeaux - France)
ABSTRACT
In routine hormonology, the liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) technique is now established for the determination of androgens, urinary cortisol and metanephrines. It has the undeniable advantage of a great analytical specificity, but with a sensitivity that clearly depends on the financial investment in a very highend spectrometer.
We describe in this work 1/ the general principles of the LCMS and 2/ routine applications developed to date in hormonology. The purpose of the presentation is to familiarize endocri
nologists with the techniques in development with their advantages but also their limits.
Key-words : mass spectrometry, hormones.
B I B L I O G R A P H I E
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NOTES
