Spectrométrie de masse

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Spectrométrie de masse

De la détection de petites molécules à l’analyse structurale de protéines

Rabah Gahoual

Laboratoire Vecteurs pour l’imagerie et le ciblage thérapeutique Faculté de Pharmacie, Université Paris Descartes

rabah.gahoual@parisdescartes.fr

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2

Sommaire

4. Application à l’étude de molécules d’origine biologique 1. Introduction à la spectrométrie de masse

 Principe

 Paramètres utilisés en spectrométrie de masse

2. Instruments de spectrométrie de masse

 Sources d’ionisation / Analyseurs de masse

 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

3. Couplage chromatographie – spectrométrie de masse

 Couplage GC-MS

 Couplage LC-MS(/MS)

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Introduction

• La spectrométrie de masse (MS en anglais) est une technique d’analyse physico- chimique permettant la détection, l’identification et la quantification des analytes

• La spectrométrie de masse est basée sur la séparation en phase gazeuse de composés chargés afin de déterminer leur rapport masse/charge (m/z)

Les composés doivent être ionisés et transférés en phase gazeuse pour être détectés par l’instrument

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4

Introduction

• Les caractéristiques de la spectrométrie de masse ont favorisé son utilisation pour le développement de méthodes analytiques

 Sensibilité généralement

inférieure à 10^-6 mol/L

 Spécificité Identification composé par mesure de la masse

 Selon la méthodologie, possibilité d’obtenir des informations structurales

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Principe MS

• Un spectromètre de masse peut se décomposer en trois éléments principaux

Source d’ionisation

Ligne transfert des ions

Analyseur de masse

Permet la production des ions en phase gazeuse

Pression atmosphérique Transfert / focalise les ions vers l’analyseur Basse pression (~10^-3 mbar)

Détermine m/z des analytes Ultra basse pression

(~10^-7 mbar) Système

introduction Détecteur

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6

Principe MS

• Exemple de spectre de masse

Substance P

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

m/z

0 100

%

674.3

600.4 462.8

685.7

693.6 1347.7

• L’unité SI en spectrométrie de masse est le Thomson (Th)

1 𝑇ℎ = ^{1 𝑢𝑚𝑎}

𝑒 = ^{1 𝐷𝑎}

𝑒

Substitution simple si z = 1 !

Intensité

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• La spectrométrie de masse permet de determiner le rapport masse / charge (m/z)

MS introduction

𝑚

𝑧 ^𝑒𝑥𝑝 = (𝑀 + 𝑧 × 𝑚 _𝐻 ⁺ ) 𝑧

• La mesure de rapport m/z peut être utilisé pour déduire la masse molaire du composé

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8

• La spectrométrie de masse permet de determiner le rapport masse / charge (m/z)

MS introduction

• La charge de l’ion peut-être déterminée sur le spectre de masse

𝑚

𝑧 ^𝑒𝑥𝑝 = (𝑀 + 𝑧 × 𝑚 _𝐻 ⁺ ) 𝑧

rapport m/z

Masse composé

charge de l’ion

Masse proton

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Principe MS

• Exemple de spectre de masse

Substance P

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

m/z

0 100

%

674.3

600.4 462.8

685.7

693.6 1347.7

[M+2H]^{2 +}

[M+H]⁺ M_th = 1346.7 g/mol

Intensité

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10

Principe MS

• Un certain nombre de paramètres permettent de définir les caractéristiques d’un spectromètre de masse :

 Largement influencés par le type d’analyseur de masse

 Dépendent du type d’instrument de spectrométrie de masse

selon applications, l’instrument à privilégier pourra être différent

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Principe MS

 Gamme de masse

• Définie la gamme de m/z pouvant être détecter par l’instrument

Un ion avec un m/z en dehors de cette gamme ne pourra être détecté

Gamme de masse doit être adaptée aux molécules analysées

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12

Principe MS

 Précision sur la mesure de masse

Définie la différence entre la valeur de m/z mesurée et la valeur théorique, généralement exprimée en partie-par-millions (ppm)

∆𝑚

^′

=

| 𝑚

𝑧

_𝑡ℎ

− 𝑚

𝑧

_𝑒𝑥𝑝

| 𝑚

𝑧

_𝑡ℎ

× 10

⁶

Une précision importante permet d’améliorer le degrés de fiabilité des identifications

(en ppm)

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Principe MS

 Résolution

Pour un m/z, la résolution correspond à la plus faible différence de masse pouvant être détecté par le spectromètre de masse

𝑅𝑒𝑠 = 𝑚/𝑧

∆𝑚

Δm

Agilent Technologies

Résolution importante Obtention des massifs isotopiques

Analyse composés de m/z proches sans interférences

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14

Principe SM

• Notions de distribution isotopique naturelle des atomes

Chaque type d’atomes possède différents isotopes dont la distribution naturelle est connue

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Principe SM

• Notions de distribution isotopique naturelle des atomes

12C₄₀

12C₃₉¹³C₁

12C₃₈¹³C₂

12C₃₇¹³C₃

Massif isotopique

(40 x 12 = 480)

(39 x 12 + 13 = 481)

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16

Principe SM

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Principe SM

A basse résolution (R ≤ 1000) on ne distingue pas le massif isotopique

On mesure la masse moyenne des différents isotopes composant la molécule

Masse moyenne

(18)

18

Principe SM

Une résolution plus élevée permet de résoudre le massif isotopique

Accès au pic monoisotopique Pic monoisotopique

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Principe SM

Une résolution plus élevée permet de résoudre le massif isotopique

Accès au pic monoisotopique Pic monoisotopique

(20)

20

Principe SM

• Une résolution élevée permet également de distinguer des composés de m/z proches

(21)

Sommaire

4. Application à l’étude de molécules d’origine biologique 1. Introduction à la spectrométrie de masse

 Principe

 Paramètres utilisés en spectrométrie de masse

2. Instruments de spectrométrie de masse

 Sources d’ionisation / Analyseurs de masse

 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

3. Couplage chromatographie – spectrométrie de masse

 Couplage GC-MS

 Couplage LC-MS(/MS)

(22)

22

Instrumentation MS

Source d’ionisation

Ligne transfert des ions

Analyseur de masse

Système

(23)

Instrumentation MS

Source d’ionisation

Ligne transfert des ions

Analyseur de masse

Système

• La source d’ionisation a pour rôle, à partir de l’échantillon, de produire des ions et d’assurer leur passage en phase gazeuse

• Nature de source d’ionisation composés ionisables type ions générés

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24

Sources MS

• Les sources d’ionisation peuvent être classées en deux catégories: sources dures, sources douces

Sources ionisation dures Sources ionisation douces

Ionisation par impact électronique (EI) Ionisation chimique (CI)

Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

Ionisation par désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

Ionisation par électro-nébullisation (ESI)

Fragmentation importante ions Pas/peu fragmentation

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Sources MS

 Ionisation par impact électronique (EI)

P~10^-3 bar

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26

Sources MS

 Ionisation par impact électronique (EI)

• Les composés traversent un flux d’électrons émis par un filament

• La collision entre les électrons émis par le filament et un composé entraine l’arrachement d’un électron présent sur sa couche externe de ce composé

M + e

^-

M

^+.

+ 2 e

^-

• L’ionisation par impact électronique est réalisée à basse pression

ion moléculaire

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Sources MS

 Ionisation par impact électronique (EI)

• L’impact électronique génère exclusivement des ions positivement chargés dont z = 1

• Impact électronique est adapté à l’ionisation des composés volatils, relativement stables et peu thermosensibles

molécules organiques volatiles

• En raison de l’importante énergie cinétique des électrons, les collisions avec les composés à ioniser entrainent généralement fragmentation

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28

Fragmentation IE

Fragmentation peut permettre de distinguer 2 composés

C₆H₁₄O C₆H₁₄O

M^+.

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Fragmentation IE

• Application à l’identification de composés

 Base de données permettant identification rapide

 Fragmentation IE s’avère

particulièrement robuste

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30

Sources MS

 Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

Adapted from B. Haique et al, Appareils et méthodes en biochimie et biologie moléculaire

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Sources MS

 Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

• L’échantillon est introduit dans la source en phase liquide

• La différence de potentiel importante appliquée à l’électrode crée des décharges couronnes qui génère un plasma issu des molécules composant l’atmosphère ambiante

• Les ions composant le plasma par collision vont provoqués l’ionisation des analytes solvant échantillon

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32

Sources MS

 Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

• L’ionisation APCI peut-être réalisée en mode positif ou négatif selon le type de composés

• La source APCI permet de générer des ions monochargés, la fragmentation des composés est relativement faible

[M + H]

⁺

[M + NH

₄

]

⁺

[M + H + CH

₃

OH]

⁺

• L’ionisation permet de produire des ions même dans le cas d’analytes de polarité moyenne

(33)

Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

• L’ionisation MALDI a été mis au point par Koichi Tanaka / Michaël Karas en 1985

• L’échantillon est co-cristallisé avec une matrice par dépôt sur une plaque en acier

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34

Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

• L’énergie délivrée par le laser entraine la désorption et l’ionisation des composés

Chris Hendrickson Florida State University

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Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

• L’ionisation MALDI permet de la production d’ions issus de composés de polarité très diverse ( => choix de la matrice)

peptides

protéines entières

carbohydrates (glycans)

adapté

molécules biologiques

• L’ionisation MALDI peut-être utilisée pour générer des cations aussi bien que des anions

• Les ions produits sont dans la grande majorité monochargés ou dichargés (z = 1 ou 2) molécules synthétiques non volatiles

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36

Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

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Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

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38

Sources MS

 Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

Proteomics Clin. Appl. 2016, 10, 701–719

Application récente Imagerie MALDI

(39)

Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

• L’ionisation ESI a été développée en 1988 par John B. Fenn

Prix Nobel de Chimie en 2002 (partagé avec Tanaka pour le MALDI)

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40

Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

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Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

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42

Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

Taylor cone

Droplets emission

Solvent evaporation Rayleigh division

Gas phase

ions

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Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

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44

Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

• L’ionisation par électrospray peut-être réalisée en mode positif ou négatif

[M + H]

⁺

[M + Na]

⁺

Mode positif Molécule protonée

(cond° acide)

Adduits avec cation

[M + K]

⁺

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Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

• L’ionisation par électrospray peut-être réalisée en mode positif ou négatif

[M + CH

₃

COO]

^-

Mode négatif conditions basique

adduits avec anion

[ M-H ]

^-

+ H

⁺

Molécule déprotonée

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46

Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

• L’électrospray permet notamment la production d’ions issus de composés polaires sur une large gamme

procédé d’ionisation de choix pour

les peptides, les protéines et les acides nucléiques

• L’électrospray a la particularité de produire des ions potentiellement multi-chargés (z ≥ 1)

[M + zH]

^z+

ions formés

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Sources ionisation

 Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

Myoglobine

M = 16995 Da

[M + 21 H

⁺

]

(48)

48

Sources MS

EI / CI

Adapted from Gross et al, Mass spectrometry : a handbook 2^nd edition (2004)

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Instrumentation MS

Source d’ionisation

Ligne transfert des ions

Analyseur de masse

Système

• L’analyseur de masse permet la séparation des ions de m/z différent en phase gazeuse

• Le type d’analyseur de masse conditionne une partie des paramètres de l’instrument:

gamme de masse, résolution, gamme dynamique

(50)

50

Analyseurs de masse

 Quadripole

(51)

Analyseurs de masse

 Quadripole

Equations de Mathieu

(52)

52

Analyseurs de masse

 Quadripole

• Un quadripole est un filtre de masse (≠ analyseur de masse)

chaque spectre est obtenu par le balayage de la gamme de masse analysée

(53)

Analyseurs de masse

• Un quadripole est un filtre de masse (≠ analyseur de masse)

chaque spectre est obtenu par le balayage de la gamme de masse analysée

 Quadripole

(54)

54

Analyseurs de masse

 Quadripole

 Instrument triple quadripôle (QqQ)

6400 triple quad (Agilent) source

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Analyseurs de masse

 Quadripole

source

1. Scan MS : synchronisation quadripôles pour transférer les ions au détecteur

(56)

56

Analyseurs de masse

 Quadripole – caractéristiques (à titre indicatif)

• Gamme masse réduite (0 – 2000)

• Résolution moyenne, précision environ 100 ppm, grande vitesse balayage

• Relativement peu chère

• Excellente sensibilité et gamme dynamique quantification

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Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (time-of-flight / TOF)

• Les ions traversent un tube de vol placé sous un vide poussé (P ~10^-7 bar)

• Le temps nécessaire à un ion pour parcourir le tube permet de déduire son rapport m/z

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58

Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (time-of-flight / TOF)

• L’utilisation d’un réflectron améliore la précision de la mesure et la résolution

(59)

Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (time-of-flight / TOF)

• Différentes longueurs de tube sont disponibles

• Les spectromètres à source MALDI utilise dans un grand nombre de cas un analyseur à temps de vol

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60

Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (time-of-flight / TOF)

 Instrument type Q-TOF

microTOF-Q II (Bruker)

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Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (time-of-flight / TOF)

1. Scan MS : quadripôle n’opère aucune sélection puis les m/z sont

déterminés par l’analyseur à temps de vol

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62

Analyseurs de masse

 Analyseur à temps de vol (caractéristiques)

• Gamme masse large (jusqu’à plusieurs 100 000 Th)

• Ultra-haute résolution (20000 – 75000), précision élevée (< 5 ppm)

• Coût élevé

• Instrument flexible, sensibilité inférieure (notamment par rapport aux IT)

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Analyseurs de masse

 Piège orbitalaire (orbitrap)

• L’analyseur orbitrap est un piège à ion dans lequel est appliqué un champ électrique

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64

Analyseurs de masse

 Piège orbitalaire (orbitrap)

• Les ions adopte une trajectoire oscillatoire par rapport à l’axe z de l’analyseur qui peut-être utilisée pour déduire m/z par application d’une transformée de Fourrier

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Analyseurs de masse

 Piège orbitalaire (orbitrap)

 Q Exactive plus (Thermo Fischer)

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66

Analyseurs de masse

 Piège orbitalaire (orbitrap)

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Analyseurs de masse

 Piège orbitalaire (orbitrap)

• Gamme masse relativement réduite (0 – 6500)

• Ultra-haute résolution (30000 – 250000), précision élevée (< 1-2 ppm)

• Coût (très) élevé

• Très grande sensibilité

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Analyseurs de masse

• Analyseurs de masse

ionisation transfert Analyseur masse

!!! nb: performances en évolution régulière Analyseur de masse Gamme m/z Résolution Précision

Quadripôle (Q) 15 – 2000 1000 - 6000 100 ppm

Piège à ions (IT) 0 - 4000 5000 - 30000 < 100 ppm

Temps de vol (TOF) 0 – 25000 5000 – 75000 < 2 ppm Secteur électrostatiques (Orbitrap) 15 - 4000 15000 - 150000 < 1 ppm Résonance cyclotronique (FT-ICR) 100 - 10000 20000 - 10⁶ < 1 ppm

Spectrométrie de masse