La Spectrométrie de masse:
Un outil de pointe à la portée de tous
Histoire
1897 Sir J.J. Thomson (Cavendish Laboratory of Cambridge)
Prix Nobel de Physique 1906
Arrivée dans les laboratoires de diagnostic clinique dans les années 80-90
Généralités
Technique analytique physique permettant de séparer des molécules sous forme d’ions suivant leur rapport
masse/charge (m/z)
Intérêt :
Détermination de masse moléculaire
Identification structurale
Quantification
Structure d’un spectromètre de masse (MS)
Structure d’un spectromètre de masse (MS)
Fonction de la source d’ionisation:
Molécules neutres Ions
Plusieurs types:
Ionisation douce: ElectroSpray Ionization (ESI), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Chemical Ionization (CI)
Ionisation dure: Electronic Impact (EI)
- +
Fonction: sélectionner les ions selon leur rapport m/z
Plusieurs types d’analyseurs:
Quadrupôle
Temps de vol (TOF)
Combinable entre eux: Triple quadrupôle, Q-TOF, TOF- TOF…
Structure d’un spectromètre de masse (MS)
+ + +
+
Fonction: détecter et compter les ions produits par la source et transmis par l’analyseur
Plusieurs types de détecteurs existent +/- sensible et durable
Structure d’un spectromètre de masse (MS)
e-
+ + + + +
Fonctions:
Gérer la communication avec les modules de
l’appareil
Traduire les données du détecteur en Spectre de masse
Identifier les molécules (via la banque de données) et/ou les quantifier
Structure d’un spectromètre de masse (MS)
Couplage à la chromatographie GC/LC
Intérêt : Décomplexifier le mélange
↑ Spécificité (intérêt +++ si matrice = sang / urine)
↓ Interférences
2 types de chromatographies:
Chromatographie Phase Gaz (GC): adaptée aux petites molécules volatiles <600-800 Da (GC-MS)
Chromatographie Phase Liquide (HPLC ou UPLC) adaptée aux molécules de polarités différentes (LC- MS)
Exemple d’un GC-MSMS en mode MRM
Precursor ion Fragmentation Product ion
Q1 Fixe Q2 Fixe
Cellule de Collision Q2
Exemple: Pour la créatine la transition MRM est 188>90 (Da)
Au quotidien : Démarrage
Maintenance LC / MS Fréquen
ce Formatio
n
Technici en utilisate ur
Technici en
référent /
Ingénieu r
Changement phase mobile +
Colonne Quotidienne Rapide
Nettoyage entrée source
d’ionisation Quotidienne Rapide Amorçage + Mise en équilibre du
système + rinçage injecteur Quotidienne Rapide Contrôle du fonctionnement du
système / identification de panne Quotidienne Moyenne Intervention pompe LC / injecteur Curative
2/an Moyenne
Calibration Analyseur après PM Curative Moyenne
Les maintenances de l’appareillage:
Plusieurs niveaux de formation = plusieurs niveaux de qualification
Au quotidien
Screening/identification : Mélange test
Dosages :
Calibration en 3 points minimum
Passage de contrôles encadrant la série de patients
Logiciel de gestion des contrôles
Points importants :
Matrice CAL et CQ en rapport avec l’échantillon
Etalons internes marqués s’ils existent
Molécule(s) connue(s) ajoutée(s) en concentration connue en début de manipulation.
Sa réponse mesurée permettra de :
Compenser les fluctuations analytiques (préparation, injection, détection)
Témoigner du bon déroulement de l’analyse du début de la manipulation jusqu’à la détection de l’analyseur.
Quantification : Aire
analyte/Aire
EIEtalon interne
Etalon interne
Compatible avec le traitement de l’échantillon (précipitation, extraction liquide, solide,…)
Comportement et propriétés physico-chimiques similaires à la molécule analysée.
Molécule Native: Isotope marqué :
O-toluidine O-toluidine D9
MM = 107 g/mol MM = 116 g/mol ΔM= 9 Da
Ex : Lacosamide
Temps de Rétention similaires :
Repère
Ionisation identique
Lacosamide quantification
Lacosamide qualification
Lacosamide d3
Etalon interne
Applications:
Toxicologie: Screening large et/ou dosage de différents
xénobiotiques (médicaments, stupéfiants, marqueurs d’exposition professionnels, métaux…) Intérêt +++ en médecine légale
Métabolisme: Etablissement de profils métaboliques / dosage des métabolites endogènes (Acides aminés, Acides organiques,
Acylcarnitines, Acides gras, Acides biliaires, Créatine et Guanidinoacétate)
Microbiologie: Identification des souches bactériennes
Immunologie: Dosage des immunosuppresseurs (anti-rejet tel que Everolimus)
Endocrinologie: Dosage des stéroïdes sanguins et urinaires, dosage de la Vitamines 1,25 OH D2 ou D3
Métabolisme
Exemple de la chromatographie des acides organiques
urinaires en GC-MS/Détecteur à ionisation de Flamme (FID):
Traitement de l’échantillon
Injection de l’extrait sur le GC
Chromatogramme + Spectres de masses
Etablissement du profil qualitatif en MS
Diagnostic clinique
Quantification des métabolites d’intérêt en FID
Diagnostic + Suivi
Métabolisme
Métabolisme basal
Métabolisme
Marqueurs spécifiques de la pathologie
Activation de voies
métaboliques secondaires
Métabolisme
Métabolisme
Endocrinologie:
Evolution des méthodes immunologiques / Radio- immunologiques vers la LC-MSMS:
↑ spécificité +++ car éviction des réactions croisées Ag/Ac
↑ sensibilité +++ (résultat au ng/ml)
↓ coûts : kits ELISA, RIA €€, élimination des déchets
radioactifs €€€ , possibilité de regroupement des analyses en profil
↓ volume de sérum nécessaire chez les nouveaux nés car profil établi en 1 seule prise d’essai (300 µL)
Endocrinologie:
Microbiologie
Utilisation d’un MALDI-TOF en routine pour l’identification des souches bactériennes
Co-cristallisation de la matrice avec une colonie bactérienne isolée
Microbiologie
Etablissement d’un spectre des protéines de la souche bactérienne
Comparaison avec les spectres de la banque de données (fournie par le fabricant)
Validation de méthode de dosage
Linéarité : Modèle linéaire, quadratique, …
Limites méthode : LOD/LOQ et limite de linéarité haute
Répétabilité : même série, même opérateur
Fidélité intermédiaire : Reproductibilité inter-série…
Contamination inter-échantillons
Sélectivité / interférences
Justesse
Incertitudes (CV)
Préparation d’échantillon
• Intérêt: dépend de la molécule et de son environnement
• Elimination de substances:
- Augmentant le bruit de fond (interférents) - Modifiant la réponse (effet matrice)
- Encrassant l’analyseur (Polluants)
• Concentration (si recherche de sensibilité)
• Mise en condition de l’analyte pour le rendre analysable (dérivation, transfert dans un solvant compatible avec analyseur, co-cristallisation pour MALDI…)
Préparation d’échantillon
Dosage de CAO en GC/MS-FID:
1 mL d’urine (ou dilution si Créatinine >1 mM)
30 µL de solution d’étalons internes (2-Phenylbutyrate+
C17:0)
200 µL HCL 2,4N
NaCl jusqu’à saturation
Triple extraction Liquide / Liquide à l’Acétate d’éthyle (Agitation 1 min, Centrifugation, décantation)
Evaporation de la phase organique
Dérivation 45 minutes à 80°C
Run = 45 min
Temps de traitement des données: 20-30 minutes
Préparation d’échantillon
Dosage de metformine
: 50 µL de sérum
300 µL de précipitant + étalon interne
Centrifugation 10 min à 20 000 g
Reprise de 20 µL de surnageant + 180 µL de PM
Run = 3 min
- Tps 1 échantillon < 15 min - Tps 10 échantillons < 25 min
Intérêt fonctionnement en série
Dosage
Calibration
Transition de quantification Transition de qualification
Transition de quantification EI Transition de qualification EI Tableau de résultats
Possibilité transfert
SIL
Conclusion
Technique de référence pour de nombreux dosages
Outil indispensable en laboratoire d’analyses médicale
gain de spécificité et sensibilité
Maintenance de base et utilisation accessible
Avenir : métabolomique, protéomique…
