La Spectrométrie de masse:

Texte intégral

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La Spectrométrie de masse:

Un outil de pointe à la portée de tous

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Histoire

1897 Sir J.J. Thomson (Cavendish Laboratory of Cambridge)

Prix Nobel de Physique 1906

Arrivée dans les laboratoires de diagnostic clinique dans les années 80-90

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Généralités

Technique analytique physique permettant de séparer des molécules sous forme d’ions suivant leur rapport

masse/charge (m/z)

Intérêt :

Détermination de masse moléculaire

Identification structurale

Quantification

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Structure d’un spectromètre de masse (MS)

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Structure d’un spectromètre de masse (MS)

Fonction de la source d’ionisation:

Molécules neutres  Ions

Plusieurs types:

Ionisation douce: ElectroSpray Ionization (ESI), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Chemical Ionization (CI)

Ionisation dure: Electronic Impact (EI)

- +

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Fonction: sélectionner les ions selon leur rapport m/z

Plusieurs types d’analyseurs:

Quadrupôle

Temps de vol (TOF)

Combinable entre eux: Triple quadrupôle, Q-TOF, TOF- TOF…

Structure d’un spectromètre de masse (MS)

+ + +

+

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Fonction: détecter et compter les ions produits par la source et transmis par l’analyseur

Plusieurs types de détecteurs existent +/- sensible et durable

Structure d’un spectromètre de masse (MS)

e-

+ + + + +

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 Fonctions:

Gérer la communication avec les modules de

l’appareil

Traduire les données du détecteur en Spectre de masse

Identifier les molécules (via la banque de données) et/ou les quantifier

Structure d’un spectromètre de masse (MS)

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Couplage à la chromatographie GC/LC

Intérêt : Décomplexifier le mélange

↑ Spécificité (intérêt +++ si matrice = sang / urine)

↓ Interférences

2 types de chromatographies:

Chromatographie Phase Gaz (GC): adaptée aux petites molécules volatiles <600-800 Da (GC-MS)

Chromatographie Phase Liquide (HPLC ou UPLC) adaptée aux molécules de polarités différentes (LC- MS)

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Exemple d’un GC-MSMS en mode MRM

Precursor ion Fragmentation Product ion

Q1 Fixe Q2 Fixe

Cellule de Collision Q2

Exemple: Pour la créatine la transition MRM est 188>90 (Da)

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Au quotidien : Démarrage

Maintenance LC / MS Fréquen

ce Formatio

n

Technici en utilisate ur

Technici en

référent /

Ingénieu r

Changement phase mobile +

Colonne Quotidienne Rapide

Nettoyage entrée source

d’ionisation Quotidienne Rapide Amorçage + Mise en équilibre du

système + rinçage injecteur Quotidienne Rapide Contrôle du fonctionnement du

système / identification de panne Quotidienne Moyenne Intervention pompe LC / injecteur Curative

2/an Moyenne

Calibration Analyseur après PM Curative Moyenne

Les maintenances de l’appareillage:

Plusieurs niveaux de formation = plusieurs niveaux de qualification

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Au quotidien

Screening/identification : Mélange test

Dosages :

Calibration en 3 points minimum

Passage de contrôles encadrant la série de patients

Logiciel de gestion des contrôles

Points importants :

Matrice CAL et CQ en rapport avec l’échantillon

Etalons internes marqués s’ils existent

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Molécule(s) connue(s) ajoutée(s) en concentration connue en début de manipulation.

Sa réponse mesurée permettra de :

Compenser les fluctuations analytiques (préparation, injection, détection)

Témoigner du bon déroulement de l’analyse du début de la manipulation jusqu’à la détection de l’analyseur.

Quantification : Aire

analyte

/Aire

EI

Etalon interne

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Etalon interne

Compatible avec le traitement de l’échantillon (précipitation, extraction liquide, solide,…)

Comportement et propriétés physico-chimiques similaires à la molécule analysée.

Molécule Native: Isotope marqué :

O-toluidine O-toluidine D9

MM = 107 g/mol MM = 116 g/mol ΔM= 9 Da

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Ex : Lacosamide

Temps de Rétention similaires :

Repère

Ionisation identique

Lacosamide quantification

Lacosamide qualification

Lacosamide d3

Etalon interne

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Applications:

Toxicologie: Screening large et/ou dosage de différents

xénobiotiques (médicaments, stupéfiants, marqueurs d’exposition professionnels, métaux…) Intérêt +++ en médecine légale

Métabolisme: Etablissement de profils métaboliques / dosage des métabolites endogènes (Acides aminés, Acides organiques,

Acylcarnitines, Acides gras, Acides biliaires, Créatine et Guanidinoacétate)

Microbiologie: Identification des souches bactériennes

Immunologie: Dosage des immunosuppresseurs (anti-rejet tel que Everolimus)

Endocrinologie: Dosage des stéroïdes sanguins et urinaires, dosage de la Vitamines 1,25 OH D2 ou D3

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Métabolisme

Exemple de la chromatographie des acides organiques

urinaires en GC-MS/Détecteur à ionisation de Flamme (FID):

Traitement de l’échantillon

Injection de l’extrait sur le GC

 Chromatogramme + Spectres de masses

Etablissement du profil qualitatif en MS

 Diagnostic clinique

Quantification des métabolites d’intérêt en FID

 Diagnostic + Suivi

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Métabolisme

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Métabolisme basal

Métabolisme

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Marqueurs spécifiques de la pathologie

Activation de voies

métaboliques secondaires

Métabolisme

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Métabolisme

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Endocrinologie:

Evolution des méthodes immunologiques / Radio- immunologiques vers la LC-MSMS:

↑ spécificité +++ car éviction des réactions croisées Ag/Ac

↑ sensibilité +++ (résultat au ng/ml)

↓ coûts : kits ELISA, RIA €€, élimination des déchets

radioactifs €€€ , possibilité de regroupement des analyses en profil

↓ volume de sérum nécessaire chez les nouveaux nés car profil établi en 1 seule prise d’essai (300 µL)

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Endocrinologie:

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Microbiologie

Utilisation d’un MALDI-TOF en routine pour l’identification des souches bactériennes

Co-cristallisation de la matrice avec une colonie bactérienne isolée

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Microbiologie

Etablissement d’un spectre des protéines de la souche bactérienne

Comparaison avec les spectres de la banque de données (fournie par le fabricant)

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Validation de méthode de dosage

Linéarité : Modèle linéaire, quadratique, …

Limites méthode : LOD/LOQ et limite de linéarité haute

Répétabilité : même série, même opérateur

Fidélité intermédiaire : Reproductibilité inter-série…

Contamination inter-échantillons

Sélectivité / interférences

Justesse

Incertitudes (CV)

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Préparation d’échantillon

Intérêt: dépend de la molécule et de son environnement

Elimination de substances:

- Augmentant le bruit de fond (interférents) - Modifiant la réponse (effet matrice)

- Encrassant l’analyseur (Polluants)

Concentration (si recherche de sensibilité)

Mise en condition de l’analyte pour le rendre analysable (dérivation, transfert dans un solvant compatible avec analyseur, co-cristallisation pour MALDI…)

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Préparation d’échantillon

Dosage de CAO en GC/MS-FID:

1 mL d’urine (ou dilution si Créatinine >1 mM)

30 µL de solution d’étalons internes (2-Phenylbutyrate+

C17:0)

200 µL HCL 2,4N

NaCl jusqu’à saturation

Triple extraction Liquide / Liquide à l’Acétate d’éthyle (Agitation 1 min, Centrifugation, décantation)

Evaporation de la phase organique

Dérivation 45 minutes à 80°C

Run = 45 min

Temps de traitement des données: 20-30 minutes

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Préparation d’échantillon

Dosage de metformine

:

50 µL de sérum

300 µL de précipitant + étalon interne

Centrifugation 10 min à 20 000 g

Reprise de 20 µL de surnageant + 180 µL de PM

Run = 3 min

- Tps 1 échantillon < 15 min - Tps 10 échantillons < 25 min

Intérêt fonctionnement en série

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Dosage

Calibration

Transition de quantification Transition de qualification

Transition de quantification EI Transition de qualification EI Tableau de résultats

Possibilité transfert 

SIL

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Conclusion

Technique de référence pour de nombreux dosages

Outil indispensable en laboratoire d’analyses médicale

gain de spécificité et sensibilité

Maintenance de base et utilisation accessible

Avenir : métabolomique, protéomique…

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Merci de votre attention!

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