Instruction Fiche d utilisation du microscope Zeiss AxioImager.M1 et du logiciel Axiovision Rel 4.7.1

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Rédacteur Vérificateur Approbateur Nom :

Fonction : Visa :

MAZAUD-GUITTOT Séverine, CR

LIU Yuchen, Doctorante PRIMIG Michaël, DR

JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité 1 - Fonction

Ce microscope est un microscope optique droit permettant la visualisation de tissus en microscopie fond clair et contraste de phase ou en fluorescence. L’illumination repose sur un système de LED (le système colibri = module lampe + unité de contrôle + tableau de commande)

2 – Mise en route

Pour les informations ci-après, se référer aux schémas du microscope joints en annexe.

- Pour travailler en lumière blanche :

 Eclairer la lampe halogène HAL 100 ( 1) power supply). Il n’est pas nécessaire d’allumer le microscope (à gauche du pied du microscope, qui reste toujours sur « ON » ) car le contrôle se fait par le power supply.

- Pour travailler en fluorescence :

 Allumer l’unité de contrôle ( 2) COLIBRI controller) du colibri à l’aide de l’interrupteur power du transformateur « colibri ». Le voyant vert s’allume. Attendre alors une dizaine de minutes que la lampe soit chaude. Vérifier que la lumière passe dans les oculaires : la tirette x doit être poussée (position œil).

- Pour utiliser les cameras et prendre des photos :

 Allumer l’ordinateur et l’écran 3) Ordinateur. Login en tant que « user », sans mot de passe.

3 – Utilisation de l’appareil

- Placer la préparation sur la platine

- Vérifier que les oculaires soient ajustés à la vue

- Pour que la lumière passe dans les oculaires, la tirette x doit être poussée sur



- Sur l’écran tactile, commencer par « Home → Make it visible ». Mettre en place l’objectif à l’aide de l’écran tactile home / x10 … Inutile de toucher les objectifs, le changement des objectifs est motorisé (appuyer sur les touches correspondantes de l’écran tactile).

Objectifs disponibles : x10 ; x20 ; x40 ; x63 (objectif à immersion).

- Positionner le disque-revolver du condenseur (# 10 AxioImager Z1) en fonction de l’objectif : fond clair : H

fond noir : D

contraste de phase : Ph 1, Ph 2, Ph 3.  Le microscope n’est pas équipé du contraste de phase.

contraste interférentiel : DIC I (à utiliser pour l’objectif 10x),

DIC II (à utiliser pour les objectifs 20x et 40x), DIC III (à utiliser pour l’objectif 63x avec huile).

- Régler la mise au point avec les visses à gauche du statif (du pied).

- Déplacer la préparation avec les molettes de mise en mouvement (à droite sous la platine).

Utilisation en lumière blanche

- Sur l’écran tactile (on board touch screen), se placer en lumière blanche ( BF white)

- Régler l’intensité lumineuse de la lampe halogène avec le régulateur de tension sur le statif du microscope. La barrette de diodes affiche la tension de la lampe. La touche impose une température de couleur de 3200K.

- Pour travailler en fond clair, mettre manuellement le condenseur sur H - Pour travailler en contraste de phase, mettre le condenseur sur 2 Utilisation en fluorescence

- Sur l’écran tactile, se placer en fluorescence ( FL white) - Eclairer la préparation avec la lampe HBO

Fluorochromes bleus (DAPI)

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JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité Fluorochromes rouges (PI, Alexa 546)

- Régler l’intensité lumineuse de la lampe halogène avec le tableau de commande du colibri.

3 – Prise de photos . Logiciel AxioVision Rel 4.7.1 3.1. Acquisition simple

Pour la prise de photos en lumière blanche. L’onglet BF de l’écran tactile doit être en surbrillance.

Pour prendre les photos, suivre l’ordre des icônes apparaissant à gauche de l’écran dans la catégorie acquisition simple.

- icône « vers le tube » permet l’observation des préparations par les oculaires.

- icône « camera laterale » permet le passage de la lumière vers la caméra.

- icône « axioCam MRc5 » active la caméra pour la lumière blanche.

- icône « Live » permet de voir en temps réel la préparation via la caméra. Faire la mise au point grâce à la molette 27.

- icône « Exposure » ATTENTION ne pas toucher sauf si la préparation est trop ou pas assez exposée. Veiller à rester entre 10 et 20 ms.

- icône « White Balance ». cliquer sur interactive et piquer une zone de la préparation que l’on considère comme étant le blanc (zone sans coupe ni dépots…).

- icône « Snap » permet la prise de photo. La fenêtre live disparait et la photo s’affiche.

- icône « Save as » Quatre formats sont possibles, dont .zvi ; .tif ; .jpg.

3.2. Fluorescence

Pour la prise de photos en lumière fluorescente. L’onglet FL de l’écran tactile doit être en surbrillance. Pour prendre les photos, suivre l’ordre des icônes apparaissant à gauche de l’écran dans la catégorie Fluorescence.

- icône « vers le tube » permet l’observation des préparations par les oculaires. Cliquer sur les ronds de chaque filtre situés dans la barre d’outils pour mettre les filtres en place. L’intensité lumineuse peut être réglée à l’aide du boitier de commande du colibri. Pour une bonne détection, se placer à 100 %. Pour obturer la lumière sur une préparation, cliquer sur Fluo OFF.

- icône « axiocam MR3 » permet le passage de la lumière vers la caméra. Cliquer sur Live dans la barre d’outils pour voir la préparation en temps réel via la caméra. Faire la mise au point grâce à la molette 27.

- icône « multidimensional aquisition »

pour chaque fluorochrome, mesurer le temps d’exposition (« mesure »), ajuster si nécessaire.

Pour les filtres inutilisés, faire un clic droit sur l’onglet correspondant affichant le numéro coloré (1, 2, 3, 4, 5. Cliquer sur « start » pour prendre les photos (elles sont prises successivement pour chaque filtre selon le temps d’exposition pré-calculé).

- icône « Export » : permet d’enregistrer chaque photo + la superposition dans un dossier à l’endroit choisi …. cliquer UNE fois sur start pour sauvegarder (la fenêtre ne s’efface pas automatiquement). Ne pas enregistrer avec l’onglet « save as » de la barre d’outil qui enregistre l’image lumineuse (c'est-à-dire uniquement en noir et blanc).

3.2. Fluorescence

4 – Extinction du système

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JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité 1) Ordinateur

2) COLIBRI controller 3) power supply

5 – Précautions d’emploi

- Les lampes à décharges de gaz HBO émettent un rayonnement ultraviolet pouvant provoquer des brûlures ophtalmiques et cutanées. Il faut par conséquent éviter tout contact oculaire ou cutané avec ses rayons lumineux.

- Ne pas éclairer la lampe HBO si le boitier est encore chaud : attendre 15 minutes après l’arrêt de la lampe avant de l’éclairer à nouveau.

- Le changement de lampe ne peut être fait que par une personne compétente.

- La poussière et les salissures peuvent perturber le fonctionnement de l’équipement. Il convient donc de protéger celui-ci en le recouvrant d’une housse en cas de non utilisation. Vérifier, avant d’appliquer cette housse, si l’équipement est hors tension et si le boitier contenant la lampe HBO est froid.

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JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité

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JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité Fenêtre de dialogue « Multidimensional aquisition ».

La plupart des aquisitions se font sur le multichannel (sélectionné par défaut). L’appareil peut aussi faier des Z stack (prendre des photos automatiquement sur plusieurs couches).

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Fonction : Visa :

Export des images fluorescentes Préciser le nom du fichier

Préciser la localisation de l’enregistrement en cliquant sur parcourir ….

Chaque enregistrement crée un nouveau dossier (si « create project folder » est activé)

« Generate merged images » permet l’enregistrement de chaque canal + l’image superposée.

« Use color for channel images » : imperative, sinon, les images enregistrées seront en noir et blanc.

Cliquer sur Start, et fermer la fenêtre.

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JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité Onglet Edition des images

Dessin des barres : il suffit de cliquet sur l’icône « scale bar », de cliquer et tirer sur l’image jusqu’à la longueur désirée, la longueur s’affiche automatiquement. En cliquant droit sur la barre, on peut en sélectionnant properties accéder à une fenêtre de dialogue où on peut ajuster l’épaisser et la couleur du trait, la taille, la police, la couleur du texte…. En cliquant à nouveau sur l’image, on perd la main sur la barre.

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Utilisation d'Axiovision avec Apotome

Onglet Microscope :

 Changement des objectifs possible.

 Changement d'intensité de la lampe à Fluorescence : Level 1=100% Level 2=50% Les curseurs permettent de moduler directement le pourcentage (mêmes fonctions que sur le boitier de contrôle du FluoArc).

 Halogen Lamp = lumière transmise : Cliquer Manual/PC =>allumage de la lampe ; il est possible d'ajuster le voltage avec les flèches. Pour éteindre recliquer sur Manual/PC.

Focus: permet de vérifier la communication entre le microscope et Axiovision.

Onglet BW-CAM (axiocam MR) nécessaire pour travailler en Champ Large à Epifluorescence (Wide field) ou avec l'Apotome :

Vérifier que la caméra est bien activée en bas de la fenêtre(Set AxiocamMR).

 Frame : Permet de sélectionner une région d'intéret pour limiter le champ à acquérir. Pour cela, ouvrir une image Live avec le réflecteur fluo le plus utile ou la lumière transmise.

Sélectionner un temps d'exposition. Cliquer Refresh Overview => apparition de l'image

"Live" dans le cadre noir. Fermer l'obturateur.

Sélectionner une partie d'écran à numériser avec les poignées dans la fenêtre Frame. Pour revenir à la taille maximale cliquer sur Full ou Last.

 Caméra mode : Sélection de la taille de numérisation maximale (1388*1040 standard mono), sauf cas particulier.

 Exposure : Measure : en cliquant sur ce bouton, la caméra propose un temps d'exposition automatique ou manuel. Le pourcentage sélectionné à situer entre 50% et 70% correspond au pourcentage de saturation du capteur utilisé pour le calcul du temps d'exposition.

Commands : Commande des différents réflecteurs de fluo, de l'obturateur fluo (Fl-Shutter On/Off), et de la lampe halogène (Trans on/off). Live sert à recadrer ou refocaliser, à définir un temps d'exposition. Snap permet de prendre une image fluo ou en lumière transmise en niveau de gris avec le temps d'exposition prédéfini. 6D-Acquisition permet d'avoir accès au menu multidimensionnel acquisition.

Live : Dans le bas de la fenêtre Live, toujours activer les deux icônes Live : entourées de bleu sur l'image :

 L'histogramme barré d'une ligne rouge permet d'afficher linéairement le signal détecté.

 Le drapeau français permet de visualiser en rouge la sursaturation en cas de temps d'exposition trop élevé.

 Laisser la vitesse de la caméra sur Medium.

 La zone en surbrillance permet de calculer le temps d'exposition sur une région d'intéret plutôt que sur l'ensemble du champ, cette zone apparait de la taille de l'image à l'ouverture du logiciel et peut être positionnée sur le sujet à analyser avant de demander au logiciel de calculer un temps d'exposition.

Attention, avant de passer au menu multidimentionnel acquisition, refermez l'image Live pour éviter les conflits entre les deux fonctions.

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Fonction : Visa :

 Onglet Experiment : Permet de charger une configuration déjà sauvegardée pour travailler en multi fluorescence +/- contraste interférentiel en mode Apotome (ou en Wide Field WF).

 Load : Sélectionnez une configuration Apotome dans Workgroup (non modifiable à la fermeture) ou Personal si vous avez sauvegardé vos paramètres personnels.

 ReUse : Permet d'importer une configuration à partir d'un fichier ZVI précédent

Onglet Multi-canaux

 Pour désactiver un canal clic droit de la souris sur le numéro du canal.

 Ne changez pas le Dye qui correspond à une position de réflecteur et au nom qui lui est attribué dans la configuration du système.

 Choisir un temps d'exposition au travers de la fonction

Measure pour chaque canal. =>apparition d'une fenêtre Live spécifique pour calculer le temps d'exposition. Cette fenêtre contient la même icône "drapeau

français" pour visualiser une sursaturation (la sursaturation sur une zone de l'image en mode apotome donne en tranche optique une zone illisible juste à l'endroit de la saturation) et le "spot pour mesurer le temps d'exposition" sur une petite zone de l'image seulement.

La fonction Snap permet, après une acquisition multi canaux, de changer les paramètres de temps d'exposition sur un canal et d'acquérir un nouveau plan ou stack sans refaire toute la série.

Onglet Z stack : utiliser la fonction Start/Stop.

 Choisir une fluo et un temps d'exposition prédéfinis dans l'Onglet C (multi canaux) en cliquant sur la page de la fluo à visualiser pour chercher les limites.

 Dans l'Onglet Z stack, cliquer sur l'icône carrée à droite de Start. =>apparition d'une fenêtre Live spécifique.

 Avec les boutons de focus du microscope sélectionner le premier plan cliquer sur OK dans la fenêtre Live spécifique.

 Dans l'Onglet Z stack cliquer sur la deuxième icône en face de Stop et sélectionner de même le dernier plan. Ajuster le nombre de plans à acquérir en cliquant Optimal-Distance puis réajuster le nombre de plans en fonction de votre expérience. Pour une acquisition plus rapide n'utiliser

pas la fonction All channel per Slice sauf si les échantillons risquent de bouger légérement entre deux plans.

Acquisition : Quand tous les paramètres sont sélectionnés cliquer Start en bas de la fenêtre pour lancer l'acquisition.

En mode Apotome pendant la mesure du temps d'exposition, vérifiez dans l'onglet Apotome les différents paramètres spécifiques à l'acquisition.

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Fonction : Visa :

JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité Onglet Apotome(dans le menu PasteurCID).

Apotome Live Mode :la grille doit être visible pour éviter un rafraîchissement trop lent de l'image.

Apotome Acquisition Mode : Optical Sectioning : actif.

Apotome : Auto Shutter : actif.

Apotome : Image Normalization : actif.

Apotome Filter : selon les échantillons, des petites lignes résiduelles peuvent apparaître en mode apotome ; Off ou Weak donnent de bons résultats

Apotome Averaging (Noise Reduction) : multiplie le temps d'acquisition d'une tranche optique par le facteur sélectionné ; cette fonction améliore les images des préparations très fluorescentes mais le temps d'exposition est multiplié par le facteur sélectionné.

Apotome Status : en cas de non calibration de grille rectangle rouge et nécessité de recalibrer la grille (contacter l'équipe du PFID).

Apotome Depth Info : en fonction de l'objectif et de la grille valeur donnée pour une tranche optique, cette valeur n'est pas modifiable et est donnée à titre indicatif.

Apotome Grid : mettre impérativement la grande grille Axioplan High (PH) quelque soit l'objectif et même si le logiciel recommande de la changer pour une petite (PL ou Low).

Dans les Commands : toujours vérifier que l'Apotome Mode est actif.

Les images acquises en niveau de gris apparaissent, dans un premier temps, superposées en couleur en reprenant le code des différents canaux activés dans la fenêtre ci-dessus, mais elles doivent être améliorées à l'affichage avant l'exportation.

Améliorer les images après acquisition en sélectionnant le plan le plus lumineux ou le plus significatif pour un affichage plus approprié pour l'exportation.

Sauvegarde d'abord en format ZVI soit dans le disque dur D : userpfid dans le répertoire de votre Département puis de votre Unité.

Ne laissez pas vos fichiers dans le disque D : après la séance, transférez les sur R : Rosebud dans votre répertoire d'unité. Sauvegarde d'abord en format ZVI soit dans le disque dur D : userpfid dans le répertoire de votre Département puis de votre Unité

Attention: Le réglage d'affichage des images acquises doit être beaucoup plus minutieux qu'en Wide Field pour éviter de voir des résidus de grille

Dans l'image acquise, avec le clic droit de la souris apparition d'un menu contextuel donnant la possibilité d'accéder aux propriétés d'affichage (Properties).

 Se mettre en niveau de gris en mettant l'onglet couleur de l'image sur OFF.

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Fonction : Visa :

JEGOU Bernard, DR, Directeur d’unité L'affichage en mode Log donne une courbe plus lisible. Quand le

diagramme est trop resserré sur le côté gauche vers 0 il est possible de restreindre l'affichage à 0_1023 ou même à 0_255 (clic dans la boîte à droite de 4095 pour accéder aux autres possibilités). Min/Max affiche les pixels depuis le plus faible du diagramme jusqu'au plus fort en intensité.

Le curseur 1 agit sur la zone la plus noire de l'image, il se positionne sur le Minimum. Le 5 se positionne sur le Maximum, il agit sur les pixels les plus lumineux, activé vers la gauche =>pixels plus lumineux accentués, vers la droite, action inverse. Le 2 et le 4 jouent sur la courbe Gamma, pour les images d'apotome, en tirant légérement ce curseur vers le bas on peut enlever les résidus de grille résiduels.

Save permet d'enregistrer des valeurs de luminosité, brillance et gamma pour une fluorescence donnée sur une image et d'appliquer ensuite les mêmes valeurs au moyen de Restore dans une autre image prise avec le même temps d'exposition.