Régulation du facteur de réplication de l'ADN MCM7 par poly-ubiquitinylation : rôles d'Int6 et BRCA1

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Régulation du facteur de réplication de l’ADN MCM7

par poly-ubiquitinylation : rôles d’Int6 et BRCA1

Samuel Buchsbaum

To cite this version:

Samuel Buchsbaum. Régulation du facteur de réplication de l’ADN MCM7 par poly-ubiquitinylation : rôles d’Int6 et BRCA1. Biochimie [q-bio.BM]. Ecole normale supérieure de lyon - ENS LYON, 2006. Français. �tel-00120941�

N° d’ordre :

N° attribué par la bibliothèque :

THESE

En vue d’obtenir le grade de

Docteur de l’Ecole Normale Supérieure de Lyon

Spécialité : Sciences de la vie

Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule

Ecole doctorale de Biologie Moléculaire, Intégrée et Cognitive

Présentée et soutenue publiquement le 18/12/2006 par

Monsieur Samuel BUCHSBAUM

Titre :

Régulation du facteur de réplication de l’ADN MCM7

par poly-ubiquitinylation : rôles d’Int6 et BRCA1

Directeur de Thèse : Monsieur Pierre JALINOT

Après avis de : Monsieur Saadi KHOCHBIN, Membre/Rapporteur Monsieur Alain NICOLAS, Membre/Rapporteur

Devant la commission d’examen formée de :

Monsieur Gilbert BRUN, Membre Monsieur Pierre JALINOT, Membre

Monsieur Saadi KHOCHBIN, Membre/Rapporteur Monsieur Marcel MECHALI, Membre/Examinateur Monsieur Alain NICOLAS, Membre/Rapporteur

R

Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de thèse, Pierre Jalinot. En m’acceptant dans son équipe depuis mon année de DEA, il m’a permis d’effectuer les cinq années de travaux présentés dans cette thèse. J’ai beaucoup apprécié la grande liberté qu’il m’a laissée, tant au niveau de mon emploi du temps qu’au niveau des expériences menées. Toutefois, il a su me faire profiter de sa culture scientifique pour me guider lorsque je faisais fausse route (ce qui n’est pas rare en cinq années d’expérimentations...). Je le remercie aussi d’accepter de me garder encore quelques mois dans son laboratoire et de me financer afin de mener à leur terme (je l’espère en tout cas) différentes expériences. Puisqu’on en est à parler financement, je remercie à ce propos le Ministère de la Recherche et la Ligue Contre le Cancer qui ont financé mes quatre années de thèse.

Ensuite, je remercie les membres de mon jury de thèse : Pierre, dont je viens de parler, mais aussi Gilbert Brun, pour avoir accepté de présider ce jury, ainsi que Saadi Khochbin et Alain Nicolas pour le temps passé à juger avec attention mon travail. Je remercie également Marcel Méchali d’avoir accepté de faire partie du jury en la qualité d’examinateur.

Concernant l’équipe de recherche avec laquelle j’ai évolué depuis cinq ans, je remercie spécialement Christelle Morris et Stéphane Réty : Christelle avec laquelle j’ai beaucoup travaillé, et qui m’a fait profiter de sa « bonne humeur » (...), et, plus sérieusement, de sa rigueur scientifique à la paillasse et de ses nombreux conseils en matière expérimentale, et Stéphane, qui m’a fait découvrir les joies de la biochimie, de la purification des protéines, et qui a su m’y donner goût. Je remercie également Armelle Roisin et Jean-Philippe Robin pour leur aide concernant respectivement la culture cellulaire et les purifications de protéines effectuées en HPLC. Je n’oublie pas les autres membres (anciens ou actuels) de l’équipe : Arnaud Favre-Bonvin, Olivier Lohez, Jérémy Scarato, Jean-Michel Terme et Anne-Laure Vitte, avec lesquels j’ai eu de nombreuses discussions au cours des années passées ici, et notamment Jean-Michel et Jérémy, avec lesquels les discussions sur le thème du football ont été parfois plus que passionnées...

Sur un plan plus personnel, je remercie tout d’abord M. Curtet, mon professeur de Biologie de Terminale (année 1996-1997, Lycée Jean Moulin, Lyon) qui a été le véritable déclencheur de

mon parcours universitaire en me donnant goût aux sciences en général et à la Biologie en particulier. C’est donc en partie grâce à lui que j’en suis là aujourd’hui.

Je remercie également tous les membres de ma famille qui m’ont soutenu tout au long de mes études ; mon frère, Yoni, et plus particulièrement mes parents, Joëlle et Robert, qui m’ont donné les moyens d’effectuer les longues études qui mènent à la thèse de Doctorat, et qui m’ont toujours encouragé dans ce sens.

Enfin, je remercie Emilie, ma compagne, qui a réussi à me « supporter » pendant ces années difficiles que sont les années de thèse : le stress, les baisses de moral, la démotivation, qui sont le lot de tout chercheur ou doctorant, elle a su me les faire oublier (la plupart du temps !) grâce à son optimisme. Je la remercie également de m’avoir offert ce magnifique cadeau qu’est ma fille, Elina, qui par sa joie de vivre et ses sourires quotidiens m’a donné beaucoup de force, notamment pendant la période de rédaction de ma thèse. C’est à elle et à sa maman que je dédie ce manuscrit.

INTRODUCTION : GENOME ET UBIQUITINE 11 I. Maintien de l’intégrité génomique dans les cellules mitotiques 12 II. L’ubiquitinylation : une forme complexe de régulation des protéines qui participe au maintien de l’intégrité

génomique 15

CHAPITRE 1. REPONSES AUX LESIONS DE L’ADN PENDANT LA REPLICATION : ROLES DES FOURCHES DE REPLICATION ET DE L’UBIQUITINYLATION. 18

A - La fourche de réplication 19

I. Formation du complexe de pré-réplication (préRC) 19

1. Origines de réplication 19

2. Chargement des protéines MCM 19 3. Restriction à une seule fois par cycle cellulaire 21 II. Initiation de la réplication 22 1. Formation du complexe d’initiation 22 2. Activation des MCM et recrutement du complexe polymérase α/ primase 24 3. Recrutement des ADN polymérases réplicatives 24 III. Blocages de la fourche de réplication 26 1. Blocage de la fourche de réplication en absence de lésion de l’ADN 26 2. Blocage de la fourche de réplication suite à une lésion de l’ADN 27

B - Blocage de la fourche : point de contrôle de réplication 29

I. Activation du point de contrôle de réplication 29

1. Quand et pourquoi ? 29

2. Notion de seuil 29

3. Mécanismes moléculaires de l’activation 31 4. Activité basale du point de contrôle 33 5. Limitations au modèle d’activation du point de contrôle 33 II. Fonctions du point de contrôle de réplication 34 1. Stabilisation des fourches de réplication 34 a) Activité basale et activation du point de contrôle 34 b) Stabiliser le réplisome 35 c) Conserver la topologie des fourches : empêcher la recombinaison 37 2. Ralentir la progression de la phase S 39 a) Inhiber les origines de réplication tardives 39 b) Rendre réversible le blocage des fourches de réplication 39 3. Fin du point de contrôle de réplication : dégradation de CHK1 41

C - franchissement des lésions par les fourches de replication 44

I. Synthèse de translésion : voie mutagénique 44 1. ADN polymérases de translésion 44 2. Recrutement des polymérases de translésion aux fourches 46 a) Mono-ubiquitinylation de PCNA 46

i. Chez S. cerevisiae 46

ii. Chez les eucaryotes supérieurs 47 b) Régulation de la mono-ubiquitinylation de PCNA 49 c) Régulations du recrutement des polymérases de translésion par PCNA 49 3. Une voie de translésion indépendante de RAD18 ? 50 II. Changement de brin modèle, ou « template switching » : voie non mutagénique 50 1. Intervention de la voie non mutagénique : nature de la lésion 50

2. Bases moléculaires de l’activation 51 a) S. cerevisiae : poly-ubiquitinylation de PCNA 51

b) Eucaryotes supérieurs 52

3. Modèles de franchissement sans erreur d’une lésion 54 a) Chez E. coli : régression de la fourche de réplication 54

b) Chez la levure 55

i. La régression des fourches traduit un état pathologique 55 ii. Modèle de l’hémicaténane 57 c) Chez les eucaryotes supérieurs 59

D - Réparation des fourches de réplication par recombinaison 63

I. Effondrement des fourches de réplication : apparition de cassures double brin 63 II. Reconnaissance des cassures double brin au niveau des fourches 63

III. Les foyers nucléaires 67

1. Formation des foyers nucléaires 67 2. Composition moléculaire des foyers nucléaires et fonction 67

IV. BRCA1 et BRCA2 68

1. BRCA1 et 2 assurent la stabilité génomique 68 2. Rôle de BRCA1 et 2 dans la recombinaison homologue 69

a) Après une irradiation 69

b) Pendant la réplication 69

3. Activité biochimique de BRCA1 70 a) Domaine RING finger, association avec BARD1 70 b) Fonction dans la réparation de l’ADN 72 c) Substrats de BRCA1-BARD1 72 d) Inactivation de BRCA1-BARD1 ? 73

E - La voie Fanconi Anemia : réponse aux pontages inter-brins 75

I. Particularités des pontages inter-brins de l’ADN 75 II. Prise en charge des pontages inter-brins 75 III. Présentation de la voie FA 76

1. FANCD2 76

2. Complexe FA E3 ligase 77

3. FANCI, E2 du système ? 79

4. FANCD1 code pour la protéine BRCA2 79

5. FANCJ 80

IV. Activation de la voie FA 80

1. Rôle d’ATR 80

2. Rôle de FANCM 81

V. Fonctions de la voie FA 82

1. Activation des point de contrôles de phase S 82 2. Réparation des fourches de réplication 83 a) Complexité de réparation des pontages inter-brins 83 b) Liens entre voie FA et recombinaison homologue 83 c) Liens entre voie FA et synthèse de translésion 85 VI. Inactivation de la voie FA 87 VII. Principaux points à approfondir 87

CHAPITRE 2. RESULTATS DES TRAVAUX DE THESE : REGULATIONS DE MCM7, FACTEUR DE REPLICATION DE L’ADN 89

A - Thématique de recherche 90

B - La proto-oncoprotéine Int6 régule la stabilité de MCM7 92

I. Présentation de la protéine Int6 92 1. Int6 est une proto-oncoprotéine 92 2. Effets de la déplétion d’Int6 dans une lignée cellulaire humaine 93

II. Caractérisation de l’interaction entre Int6 et MCM7 93 1. Int6 interagit avec les formes poly-ubiquitinylées de MCM7 93 2. Int6 stabilise MCM7 pendant la phase S 94 3. La perte d’Int6 entraîne des défauts de réplication 95

III. Publication n°1 96

IV. Résultats complémentaires sur l’ubiquitinylation de MCM7 147

C - Identification de BRCA1 comme une E3 ligase potentielle de MCM7 150

I. Indices menant à BRCA1 150

II. BRCA1 interagit avec MCM7 151 1. Mise en évidence de l’interaction BRCA1 - MCM7 151 2. BARD1 renforce l’interaction BRCA1 - MCM7 152 3. L’inhibition du protéasome renforce l’interaction BRCA1 - MCM7 153 III. BRCA1 module l’ubiquitinylation de MCM7 154 1. La présence de BRCA1 et BARD1 stimule l’ubiquitinylation de MCM7 154 2. BRCA1 stimule l’ubiquitinylation de MCM7 sur la chromatine, mais ne modifie pas sa localisation

subcellulaire 155

3. BRCA1 semble stabiliser MCM7 157 4. BRCA1 stimule l’ubiquitinylation de MCM7 intervenant après une irradiation 158 IV. Ubiquitinylation in vitro de MCM7 par BRCA1 159 1. Difficultés à surmonter pour mettre en place le test 159 2. Purification des composants du test 159

D - Dérégulation de MCM7 par l’oncoprotéine virale Tax 161

I. Pourquoi s’intéresser à la protéine Tax ? 161 II. Interaction entre Tax et MCM7 162 1. Confirmation des données de double hybride 162 2. Interaction entre Tax et le sous complexe MCM4,6,7 163 3. Tax n’interfère pas avec l’interaction entre Int6 et MCM7 164 III. Tax favorise la réplication de l’ADN 165 1. Construction d’une lignée FLAG-Tax 165 2. Vérification de l’interaction Tax-MCM7 dans la lignée établie 165 3. Tax interagit avec MCM7 sur la chromatine 167 4. Tax stimule l’incorporation de thymidine tritiée dans la lignée établie 167 IV. Mise en place d’un test in vitro de l’activité hélicase du sous complexe MCM4,6,7 168 1. Purification du sous complexe MCM4,6,7 168 2. Purification de la protéine Tax 168 3. Test de l’activité hélicase du sous complexe MCM4,6,7 humain purifié 170

CHAPITRE 3. DISCUSSION 171

A - Régulation de MCM7 lors de la réplication de l’ADN 172

I. MCM7 est soumise à une protéolyse pendant la phase S 172 II. Int6 régule la protéolyse de MCM7 pendant la phase S 176 III. Modèle possible et problèmes à résoudre 179

B - Régulation de MCM7 par BRCA1 181

I. BRCA1 interagit avec MCM7 et stimule son ubiquitinylation 181 II. BRCA1 stimule l’ubiquitinylation de MCM7 intervenant en réponse à des dommages de l’ADN 182 III. Quelle est la fonction de l’ubiquitinylation de MCM7 dépendant de BRCA1 ? 183 1. Localisation de l’ubiquitinylation de MCM7 183 2. Activations des points de contrôle, réparation de l’ADN ? 184 IV. Conclusion et perspectives immédiates 185

C - Tax dérégule-t-elle la réplication ? 187

ANNEXES 192

A - Publication n°2 193

B - Matériels et méthodes supplémentaires 200

I. Protéines recombinantes 200

1. Tampons utilisés et cultures cellulaires 200 2. Production de His-ubcH5c 200 a) Expression en bactéries 200

b) Purifications 201

3. Production de FLAG-MCM7 et FLAG-Tax 201 a) Expression en cellules d’insecte (lignée SF21) 201

b) Purifications 202

i. Lyse des cellules 202

ii. Colonne héparine 202

iii. Colonne anti-FLAG M2 202 4. Production du complexe MCM4,6,7 202 a) Expression en cellules d’insecte (lignée SF21) 202

b) Purifications 203

II. Test d’activité hélicase in vitro 203

1. Préparation du substrat 203

a) Marquage radioactif de l’oligonucléotide 203 b) Hybridation avec l’ADN de phage M13 203

2. Activité hélicase 204

A

ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire ADNr: ADN ribosomique

APC: Anaphase Promoting Complex ARN: acide ribonucléique

ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated ATR: ATM and Rad3 Related

ATRIP: ATR Interacting Protein BER: Base Excision Repair BLM: Bloom syndrome

BRCA: Beast Cancer Associated BRCT: BRCA1 C-Terminal CDC: Cell Division Cycle CDK: Cyclin Dependent Kinase CDT1: Cdc10 Dependent Transcript 1 CHK: Checkpoint Kinase

dNTP: Déoxynucléotide triphosphate

E. coli: Escherichia coli

FRAP: Fluorescnce Recovery After Photobleaching GINS: Go Ichi Ni San

HECT: Homologous to E6-AP C-Terminal MCM: MiniChromosome Maintenance MMR: Mismatch Repair

NER: Nucleotide Excision Repair NHEJ: Non Homologous End Joining ORC: Origin Recoginition Complex PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen PHD: Plant HomeoDomain

préRC: prereplication Complex RAD: radiation

RFC: Replication Factor C

RING: Really Interesting New Gene

S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae S. pombe: Schizosaccharomyces pombe

SCF: Skp-Cullin-FBox

UBD: Ubiquitin Binding Domain WRN: Werner syndrome

Introduction

Génome et ubiquitine

Malgré leur extrême diversité, tous les êtres vivants possèdent une caractéristique en commun : le génome. Celui-ci regroupe l’ensemble des chromosomes qui contiennent les informations permettant le développement de tout organisme, de la cellule bactérienne à l’homme. Les chromosomes sont la forme condensée de la chromatine, un ensemble formé de filaments d’ADN (l’acide désoxyribonucléique) et de protéines. Chaque filament d’ADN est en fait une double hélice constituée de deux brins d’ADN appariés antiparallèlement. Chaque brin est une chaîne, une succession de désoxyribonucléotides (dNTP). Chacun d’entre eux contient un sucre (le désoxyribose) sur lequel est fixée une base.

L’ADN contient quatre types de base : deux purines (Adénine (A) et Guanine (G)) et deux pyrimidines (Cytosine (C) et Thymine (T)). Les bases sont orientées vers l’intérieur de la double hélice d’ADN, permettant l’appariement des deux brins grâce à des liaisons de faible énergie. De plus, sur un brin donné, la succession des bases constitue un code déchiffré par la cellule : comme nous lisons un texte, la cellule « lit son ADN » selon un code génétique, dans lequel les phrases sont les gènes et les caractères les bases. Cette lecture lui permettant de synthétiser absolument toutes ses protéines, elle est fondamentale pour l’activité normale de la cellule. Le génome doit donc rester « lisible ». Pour cela, il doit être « entretenu » : la cellule doit maintenir l’intégrité de son génome, ce qui implique de faire face aux nombreuses altérations qu’il subit. Dans les cellules en division (mitotiques), cela implique en plus la duplication complète et fidèle du génome préalablement à la division cellulaire (Figure 1A).

I.Maintien de l’intégrité génomique dans les cellules mitotiques

L’ADN est une molécule chimiquement très réactive qui est constament soumise à des agressions d’origine endogène et exogène. Les lésions causées par ces agressions induisent des mutations qui peuvent toucher des gènes esentiels et s’avérer néfastes pour la cellule. Fort heureusement, il existe toute une batterie de protéines qui organisent la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN, en détectant et signalant leur présence à la cellule. Selon le nombre et la gravité des lésions, la cellule décide ou non de les réparer. Si la décision de réparer les lésions est prise, la cellule mitotique est capable d’arrêter temporairement son cycle jusqu’à leur élimination : ce sont les points de contrôle du cycle, qui interviennent quelle que soit la phase du cycle cellulaire (Figure 1A). Quand la cellule n’est pas capable de réparer les lésions de l’ADN, l’arrêt temporaire devient définitif et aboutit à la mort cellulaire par « suicide », l’apoptose.

Figure 1. La réplication de l’ADN est un préalable nécessaire à la division cellulaire. (A)

A gauche : la réplication de l’ADN en phase S permet la duplication complète du génome avant sa répartition, au cours de la mitose, entre les deux cellules filles. A droite: le cycle de vie d’une cellule en prolifération, ou cycle cellulaire, se décompose en quatre phases: deux phases, G1 et G2 (comme « GAP »), préparent la cellule à la réplication (ou synthèse) de l’ADN et la mitose. L’autorisation de la réplication s’effectue pendant la phase G1. Différents points de contrôle (en rouge) vérifient l’intégrité du génome au cours du cycle, dont deux sont actifs en phase S : les points de contrôle intra-S et de réplication. En mitose, le point de contrôle du fuseau mitotique vérifie l’alignement correct des chromosomes avant la division cellulaire. (B) Progression de la fourche de réplication. La fourche de réplication permet l’ouverture de la double hélice grâce à une activité ADN hélicase. Pour concilier la nature antiparallèle de l’ADN et la progression unidirectionnelle de la fourche ainsi que l’activité 5‘-3’ des ADN polymérases, un brin est synthétisé de manière continue (brin leader), l’autre de manière discontinue (brin retardé) sous forme de fragments d’Okasaki qui seront par la suite reliés entre eux.

Le maintien de l’intégrité du génome est donc en partie assuré par des mécanismes qui coordonnent prolifération cellulaire et réparation des lésions de l’ADN, et qui reposent sur l’activité de nombreuses protéines. Si l’une d’entre elles est inactivée ou altérée, la cellule devient moins sensible aux lésions de l’ADN et acquiert une capacité de prolifération plus importante. Elle va donc accumuler plus de lésions, qui sont susceptibles de toucher d’autres protéines assurant l’intégrité génomique, amplifiant encore les défaillances, etc... Ainsi, la cellule se transforme, petit à petit, pour devenir complètement aberrante et incontrôlée : c’est l’oncogenèse, à la base des cancers. Cette transformation cellulaire est favorisée par des mutations inactivant les protéines dites « suppresseur de tumeur » ou modifiant l’activité des « proto-oncoprotéines », mais aussi par l’introduction d’une oncoprotéine (d’origine virale par exemple).

La duplication du génome est une autre caractéristique importante du maintien de son intégrité. Dans les cellules mitotiques, elle a lieu lors de la phase S du cycle cellulaire et permet à la cellule de se diviser en distribuant à ses deux cellules filles l’équivalent d’un génome entier, ni plus ni moins. La réplication de l’ADN doit donc être complète, mais aussi fidèle. Elle est assurée par le réplisome, un ensemble complexe de protéines contenant les activités nécessaires à la séparation et à la copie des deux brins de la double hélice d’ADN. Le réplisome est actif au niveau des fourches de réplication (Figure 1B). Ces fourches sont multiples et leur progression couvre tout le génome, permettant sa duplication complète. Cependant, cette progression n’est pas si simple, car les fourches subissent des blocages quand elles rencontrent des lésions de l’ADN. Ces blocages des fourches peuvent aboutir à leur effondrement qui, s’il est massif, rend la terminaison de la réplication impossible. La fourche doit donc être capable de franchir toute lésion qu’elle rencontre, ou de se stabiliser le temps de sa réparation. L’ensemble des mécanismes permettant le franchissement de certaines lésions constitue la « tolérance aux dommages de l’ADN », tandis que la stabilisation des fourches nécessite l’activité du point de contrôle de réplication. Ces deux processus dépendent de la capacité des fourches de réplication à signaler au reste de la cellule les lésions qu’elles rencontrent.

Les fourches de réplication sont donc primordiales pour le maintien de l’intégrité du génome pendant la phase S. Tout en assurant sa duplication, elles signalent à la cellule ses altérations et initient des réponses dont elles sont aussi les cibles. Cela implique bien entendu une régulation stricte et complexe des protéines du réplisome, dont une apparaît aujourd’hui comme majeure : l’ubiquitinylation.

II.L’ubiquitinylation : une forme complexe de régulation des protéines qui participe au maintien de l’intégrité génomique

L’ubiquitinylation est une modification post-traductionnelle des protéines au cours de laquelle est conjuguée à une protéine substrat une ou plusieurs molécules d’ubiquitine, une petite protéine de 76 acides aminés conservée chez tous les eucaryotes. Suite à une cascade de réactions enzymatiques, une molécule d’ubiquitine est liée de façon covalente au groupement amine d’une lysine de la protéine substrat : c’est la mono-ubiquitinylation. Si le processus se répète, d’autres molécules d’ubiquitine sont ajoutées, chacune étant liée via sa glycine C-terminale à une des sept lysines de l’ubiquitine précédente : c’est la poly-ubiquitinylation (Figure 2).

La première fonction de la poly-ubiquitinylation des protéines à avoir été mise en évidence est de provoquer leur dégradation par le protéasome. La poly-ubiquitinylation régule

Figure 2. Ubiquitinylation des protéines. L’ubiquitine est activée par l’enzyme activatrice

de l’ubiquitine, E1, puis est transférée sur une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine, E2. L’enzyme E2 transfère l’ubiquitine activée sur une lysine de la protéine substrat (rouge) avec la coopération d’une enzyme ligase de l’ubiquitine, E3. Le transfert est direct (E3 à domaines RING Finger) ou indirect via un lien thiolester supplémentaire entre l’ubiquitine et une cystéine de l’enzyme E3 (E3 à domaines HECT). Le processus peut s’arrêter à ce stade (mono-ubiquitinylation) ou se répéter pour former une chaîne d’ubiquitines sur le substrat (poly-ubiquitinylation), en liant entre elles les molécules d’ubiquitine. Cette liaison s’effectue entre la glycine C-terminale de l’ubiquitine ajoutée et une des sept lysines de l’ubiquitine déjà liée au substrat. Lors de la dégradation ou de la désubiquitinylation du substrat, l’ubiquitine est recyclée car elle est très stable.

donc l’activité des protéines en affectant leur stabilité. Cette découverte, qui a valu a ses auteurs, Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose, le prix Nobel de chimie en 2004, date des années 1980. Depuis, le nombre d’exemples de poly-ubiquitinylation non dégradative a augmenté de façon exponentielle. Il en est de même pour la mono-ubiquitinylation qui, elle, n’est jamais dégradative. Il apparaît donc que l’ubiquitinylation est un acteur important – si ce n’est le plus important – dans la régulation de l’activité des protéines.

Le pouvoir de régulation par l’ubiquitinylation repose essentiellement sur la diversité des chaînes d’ubiquitines formées (sept types possibles) et sur l’activité des enzymes E3 ligases qui déterminent le choix du substrat ubiquitinylé. En effet, elles sont très nombreuses (plusieurs centaines identifiées chez l’homme à ce jour) et agissent dans tous les compartiments subcellulaires. Tandis que certaines ont un structure monomérique simple, certaines sont multimériques, assemblées selon une architecture relativement constante au sein de laquelle chaque monomère a une fonction bien précise : assemblage du complexe, activité catalytique, reconnaissance du substrat. C’est le cas des complexes SCFF-Box (Figure 3). Dans ces complexes, la protéine F-Box assure la reconnaissance du substrat, et est interchangeable avec une autre protéine F-Box, selon le contexte. Cette diversité des E3 ligases est encore amplifiée par les possibilités de réguler leur activité (phosphorylation, auto-ubiquitinylation, etc...) et leur affinité pour leur(s) substrat(s).

Figure 3. Enzymes E3 de type RING Finger multimériques : architecture du complexe SCFF-Box. L’assemblage dépend d’une protéine d’assemblage, la culline. On connaît pour

l’instant 6 sortes de culline, définissant chacune un type d’enzyme E3 multimérique. Une septième sorte de complexe est définie par APC dont l’assemblage ne dépend pas d’une culline, bien qu’il soit très proche. Dans le complexe SCFF-Box décrit ici, deux protéines interagissent avec la culline: la protéine à domaine RING Finger qui assure le recrutement de l’enzyme de conjugaison (E2), et la protéine adaptatrice. Cette dernière interagit avec la protéine réceptrice du substrat, via un domaine particulier, nommé F-Box. Il existe chez les mammifères plus de 70 protéines F-Box répertoriées à ce jour, assurant la grande diversité des substrats reconnus par les enzymes E3 multimériques.

De nombreuses données récentes indiquent que l’ubiquitinylation est primordiale pour empêcher la transformation cellulaire. En effet, nombre de cancers sont dus à des défaillances de l’ubiquitinylation des protéines qui interviennent après l’inactivation ne serait-ce que d’une seule E3 ligase (pour revue : (Mani and Gelmann, 2005)). Un exemple frappant est la prédisposition des femmes aux cancers du sein et des ovaires, suite à la simple mutation du gène brca1 qui code pour une E3 ligase active sur la chromatine. Cet exemple illustre bien l’importance de l’ubiquitinylation des protéines chromatiniennes pour maintenir l’intégrité du génome. Or, cette intégrité dépend aussi, comme nous l’avons vu précédemment, de la régulation du réplisome au niveau des fourches de réplication de l’ADN.

Dans le premier chapitre de ce manuscrit, je me suis efforcé de souligner, par des exemples précis, l’importance de l’ubiquitinylation pendant la réplication de l’ADN. Nous verrons en effet que cette modification post-traductionnelle intervient dans le franchissement de certaines lésions de l’ADN par les fourches de réplication, dans l’activation du point de contrôle de réplication suite à un blocage prolongé des fourches, ainsi que dans la réparation des fourches effondrées ou bloquées par des lésions infranchissables. Le deuxième chapitre présente mes travaux de thèse qui concernent une des protéines du réplisome, MCM7. Cette protéine est une sous unité du complexe MCM (« MiniChromosome Maintenance ») qui possède l’activité hélicase catalysant l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau de la fourche de réplication. J’ai montré que MCM7 est régulée par poly-ubiquitinylation pendant la phase S, mais aussi en réponse à des dommages de l’ADN. Nous verrons qu’une proto-oncoprotéine, Int6, ainsi qu’un suppresseur de tumeur, BRCA1, participent à ces régulations, tandis qu’une oncoprotéine virale, Tax, pourrait altérer ces régulations. Enfin, dans un troisième chapitre, j’ai essayé d’évoquer de nouvelles pistes d’étude de l’ubiquitinylation de MCM7 en confrontant les résultats de mes travaux à d’autres données concernant l’ubiquitinylation des protéines impliquées dans la réplication et la réparation de l’ADN.

Chapitre 1

Réponses aux lésions de l’ADN pendant

la réplication :

Rôles des fourches de réplication et de

A -

L

I.Formation du complexe de pré-réplication (préRC)

1. Origines de réplication

Les origines de réplication correspondent aux endroits où la double hélice d’ADN est ouverte en premier. Chez les eucaryotes, le nombre d’origines varie entre 103 et 105, réparties dans tout le génome. Elles sont matérialisées par un complexe hétéro-hexamérique formé des protéines ORC1-6. Chez S. cerevisiae, ces protéines sont présentes sur la chromatine au niveau de séquences spécifiques (Rao and Stillman, 1995), la plupart fonctionnant in vivo comme des origines de réplication (Wyrick et al., 2001). Chez S. pombe, la spécificité des séquences faisant office d’origine de réplication est moins évidente, les protéines ORC se fixant à des régions riches en adénine et thymine, et à plusieurs sites sur chaque origine de réplication (Kong and DePamphilis, 2002; Takahashi et al., 2003). Il semblerait que la spécificité de séquence chez les eucaryotes supérieurs se limite aussi à la composition en nucléotides, étant donnée l’observation que les protéines ORC de S. pombe et de X. laevis peuvent être mise en compétition pour se fixer aux mêmes séquences riches en adénine et thymine (Kong et al., 2003). Cependant, les protéines ORC humaines sont capables, dans certaines cellules somatiques, de se fixer sur l’ADN à des sites distincts qui servent d’origines de réplication (Ladenburger et al., 2002).

2. Chargement des protéines MCM

Le complexe MCM est formé de six sous unités, MCM2-7, et est aussi connu sous le nom de complexe d’autorisation de la réplication RLF-M (Thommes et al., 1997). Le trimère formé des sous unités MCM4,6 et 7 est doté in vitro d’une activité hélicase, mais l’hétéro-hexamère MCM entier est nécessaire chez la levure aussi bien pour l’initiation que pour l’élongation de la réplication (Labib et al., 2000; Prokhorova and Blow, 2000). Le consensus actuel attribue le rôle d’hélicase réplicative au complexe MCM. Son association à la chromatine s’effectue lors de la phase G1 du cycle cellulaire via les protéines ORC, CDC6 et CDT1, qui agissent de concert pour ouvrir l’anneau formé des six protéines MCM et permettre son chargement au niveau des origines de réplication (Figure 4). Ce système a été

reconstitué in vitro, dans des extraits d’œufs de xénope, à partir des protéines ORC, CDC6, CDT1 et MCM2-7 purifiées (Gillespie et al., 2001).

Les protéines ORC et CDC6 sont des ATPases, et pourraient donc fournir, via une hydrolyse d’ATP, l’énergie requise par ce système pour charger les protéines MCM sur l’ADN. Chez l’homme, une protéine récemment identifiée, MCM8, pourrait également participer au recrutement de CDC6 sur les origines de réplication et donc à la formation du préRC (Volkening and Hoffmann, 2005). Nous verrons cependant que cette activité de MCM8 ne semble pas conservée chez tous les eucaryotes supérieurs. Quant à CDT1, elle est capable d’interagir directement avec l’hexamère MCM dans le nucléoplasme (Cook et al., 2004; Tanaka and Diffley, 2002; Yanagi et al., 2002). Elle servirait donc d’intermédiaire, via son

Figure 4. Formation du complexe de pré-réplication (préRC). Au cours de la phase G1, la

géminine est dégradée, libérant ainsi CDT1. CDC6 et CDT1 s’associent alors à la chromatine au niveau des complexes ORC qui marquent les origines de réplication. Le complexe MCM est ensuite recruté à son tour grâce à son interaction avec CDT1.

interaction avec CDC6, pour guider le complexe au niveau des origines de réplication déjà marquées par ORC et CDC6 et former ainsi le préRC (Maiorano et al., 2000; Tsuyama et al., 2005). ORC, CDC6 et CDT1 sont donc requises pour le chargement du complexe MCM sur la chromatine au cours de la phase G1. Cependant elles ne sont pas indispensables pour le maintien sur la chromatine du complexe, une fois celui-ci chargé (Donovan et al., 1997; Hua and Newport, 1998; Maiorano et al., 2000).

3. Restriction à une seule fois par cycle cellulaire

L’avantage fourni par la présence de deux intermédiaires entre les protéines ORC et MCM, à savoir CDC6 et CDT1, est la possibilité de régulation du système. Il est nécessaire pour la cellule d’éviter une ré-initiation des origines de réplication, ce qui revient à permettre le chargement des MCM une seule fois par cycle cellulaire. Cette régulation intervient au niveau des protéines ORC1, CDC6 et CDT1.

Chez la levure, le complexe ORC entier est associé à l’ADN tout au long du cycle cellulaire, tandis que chez l’homme, ORC1 est ubiquitinylée sur la chromatine et dégradée par le protéasome après l’initiation de la réplication (Kreitz et al., 2001; Mendez et al., 2002). Cette régulation protéolytique de ORC1 empêche une origine déjà activée de ré-initier la réplication, car la présence de toutes les protéines ORC (hormis ORC6, (Gillespie et al., 2001)) est indispensable pour recruter le complexe MCM afin d’initier la réplication.

Concernant Cdc6 et Cdt1, l’importance de leur régulation est illustrée par l’observation que la surexpression de Cdc6 chez la levure entraîne une re-réplication, et que le phénomène est amplifié par la surexpression conjointe de Cdt1 (Nishitani et al., 2000). La levure contrôle l’abondance de Cdc6 et Cdt1 dans le nucléoplasme de trois façons : variation de la transcription et de la protéolyse, et export nucléaire. Ces régulations (détail dans (Blow and Dutta, 2005)) ont pour conséquence de faire varier le niveau nucléoplasmique de Cdc6 et Cdt1 au cours du cycle cellulaire pour le rendre maximal en G1 et permettre à ce moment le chargement du complexe MCM. Chez les eucaryotes supérieurs, l’essentiel de la régulation concerne CDT1 ; en effet, le niveau de CDC6 ne varie pas au cours du cycle cellulaire car elle possède d’autres fonctions indépendantes du chargement des MCM (Clay-Farrace et al., 2003). CDT1 est dégradée par le protéasome à partir de la fin de la phase G1 et en phase S (Li et al., 2003; Nishitani et al., 2001; Quinn et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000; Zhong et al., 2003). Nous reviendrons sur cette dégradation au cours du chapitre 3 de ce manuscrit. CDT1 est par contre stabilisée en G2 et M par une protéine absente chez la levure, la géminine. Celle-ci interagit avec CDT1 pour la protéger de l’ubiquitinylation (Ballabeni et al., 2004) et

permettre son accumulation en G2 et M, mais sous une forme inactive (Hodgson et al., 2002; McGarry and Kirschner, 1998; Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). La géminine est à son tour dégradée, en fin de mitose, libérant ainsi l’activité de CDT1 et permettant le chargement des MCM sur les origines de réplication (Figure 4). La géminine a donc un rôle fondamental pour empêcher la re-réplication, et c’est pourquoi sa déplétion chez la drosophile ou dans des cellules humaines entraîne une re-réplication massive de l’ADN (Melixetian et al., 2004; Mihaylov et al., 2002; Quinn et al., 2001; Zhu et al., 2004).

II.Initiation de la réplication

1. Formation du complexe d’initiation

Après la formation du préRC, l’initiation de la réplication implique l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau des origines de réplication autorisées et le recrutement des ADN polymérases requises pour synthétiser les nouveaux brins d’ADN. Ces processus sont assurés par l’association au niveau des origines de réplication d’un certain nombre de protéines, dont certaines n’ont été identifiées que récemment chez la levure ou le xénope. La mieux caractérisée est sans doute cdc45, conservée chez tous les eucaryotes, qui se fixe aux origines de réplication après la formation du préRC (Zou and Stillman, 1998; Zou and Stillman, 2000). La présence des MCM est nécessaire pour le recrutement de cdc45 (Mimura et al., 2000) qui s’effectue via une interaction entre cdc45 et le complexe MCM au niveau de l’origine de réplication (Aparicio et al., 1997). Cette interaction dépend de la phosphorylation de MCM2 par les kinases CDK (Zou and Stillman, 2000). Parallèlement à cdc45, d’autres protéines se fixent au niveau des origines, comme Sld3, Dpb11 ou le complexe GINS (Figure 5). Le complexe GINS (Go Ichi Ni San) maintient l’interaction entre cdc45 et le complexe MCM (Gambus et al., 2006). Touts ces protéines ne se chargent pas successivement ; au contraire, leur recrutement aux origines est inter-dépendant. Par la suite, le chargement de la polymérase α dépend de cdc45 (Zou and Stillman, 2000) tandis que Dpb11 est requise pour le chargement des polymérases α et ε (Masumoto et al., 2000). Cdc45 et le complexe GINS participent aussi à l’élongation de la réplication et se déplacent avec la fourche de réplication, comme le complexe MCM et les ADN polymérases, pour s’éloigner progressivement de l’origine de réplication (Kanemaki et al., 2003; Takayama et al., 2003; Tercero et al., 2000). Cependant, leur fonction biochimique exacte n’est pas encore bien connue, et on pense qu’elles pourraient servir d’auxiliaires au complexe MCM.

Figure 5. Initiation de la réplication chez les eucaryotes supérieurs. Après la formation du

complexe de pré-réplication (voir figure 4), MCM10 est recrutée et MCM2 est phosphorylée par les kinases CDK. Cela permet le recrutement de CDC45, des quatre protéines GINS et de Sld3, pour former le complexe d’initiation de la réplication. Pendant ce temps, CDT1 est soumise à une protéolyse active, empêchant la reformation d’un complexe de pré-réplication au niveau de l’origine après l’initiation. L’ensemble MCM-CDC45-GINS est ensuite activé via une phoshorylation de MCM2 par CDC7-DBF4 (DDK) et commence à séparer la double hélice d’ADN, dont les brins sont immédiatement recouverts par RPA.

Cet enchaînement de chargements de protéines est plus ou moins similaire chez le xénope (Kubota et al., 2003), bien que tous les facteurs ne soient pas conservés, comme Dpb11. De plus, une autre protéine est requise pour le chargement de CDC45 : il s’agit de MCM10, dont la séquence est différente des six MCM formant l’hélicase réplicative. Chez le xénope, MCM10 se fixe à la chromatine après la formation du préRC et recrute cdc45 (Wohlschlegel et al., 2002), tandis que chez S. cerevisiae, elle participe à la formation du préRC en stabilisant les autres MCM sur l’origine de réplication, notamment via une interaction avec MCM7 (Homesley et al., 2000). De plus, MCM10 semble participer à la réplication chez S.

cerevisiae (Das-Bradoo et al., 2006), ce qui n’est pas le cas chez l’homme (Izumi et al.,

2004).

2. Activation des MCM et recrutement du complexe polymérase α/ primase

Le démarrage de la réplication dépend de l’activation du complexe MCM, qui a lieu après la phosphorylation de MCM2 par la kinase DDK (Dbf4 Dependent Kinase) (Jiang et al., 1999), formée de CDC7 et de sa sous unité régulatrice DBF4, toutes deux conservées chez les eucaryotes. L’ADN simple brin qui apparaît suite à l’ouverture de la double hélice permet le recrutement de RPA et du complexe polymérase α / primase, via une interaction de celui-ci avec CDC45 et RPA (Mimura and Takisawa, 1998; Pollok et al., 2003; Uchiyama et al., 2001). Chez le xénope, le recrutement de RPA puis de la polymérase α nécessite la présence de MCM8 qui est chargée sur la chromatine au moment de l’initiation de la réplication (Maiorano et al., 2005). MCM8 intervient ainsi après l’initiation de la réplication, tandis que chez l’homme, elle interviendrait plutôt avant l’initiation. Une fois recrutée, la primase synthétise un fragment d’ARN d’environ 10 nucléotides de long puis la polymérase α un fragment d’ADN d’environ 30 nucléotides (Mizuno et al., 1999). La faible processivité de la polymérase α implique qu’elle soit ensuite remplacée par les polymérases δ et ε.

3. Recrutement des ADN polymérases réplicatives

Le remplacement de la polymérase α est assuré par PCNA, une protéine homotrimérique qui est chargée au niveau de la jonction entre l’oligonucléotide synthétisé par la polymérase α et le brin parental (Figure 6). PCNA formant un anneau, son ouverture est requise pour son chargement. Cette ouverture est assurée par le complexe RFC, formé de cinq sous unités et doté de l’activité ATPase nécessaire au changement de conformation de PCNA. RFC et PCNA assurent donc conjointement le remplacement de la polymérase α par les

Figure 6. Modèle de progression de la fourche de réplication. Le recouvrement par RPA

de l’ADN simple brin résultant de l’ouverture de la double hélice permet le recrutement du complexe polymérase α / primase. La primase synthétise une amorce d’ARN, puis la polymérase α une amorce d’ADN. PCNA est ensuite recrutée au niveau de la jonction entre ADN double brin et ADN simple brin grâce à l’hydrolyse d’ATP par RFC. Celle-ci produit l’énergie nécessaire à l’ouverture de l’anneau formé par les trois monomères de PCNA. PCNA permet ensuite le recrutement de la polymérase réplicative et assure sa processivité lors de la réplication du brin parental. La poursuite de la synthèse du brin retardé nécessite une répétition de ces mécanismes, les polymérases n’étant capables de synthétiser l’ADN que dans la direction 5‘-3’.

polymérases réplicatives à proprement parler (Maga et al., 2000; Mossi et al., 2000). Les deux brins de l’ADN étant antiparallèles, et les polymérases n’étant capables de synthétiser l’ADN que dans la direction 5’-3’, ce processus de remplacement se répète sur le brin retardé, dont la synthèse est discontinue, sous forme de fragments successifs (dits « d’Okasaki ») qui sont ensuite reliés pour former le brin néo-synthétisé continu (Figures 1B et 8). PCNA, outre son rôle dans le chargement des polymérases réplicatives, assure aussi leur processivité. De plus, elle possède de nombreux interacteurs (pour revue : (Maga and Hubscher, 2003)) et coordonne d’autres processus relatifs à la maintenance de l’ADN, dont sa réparation ou sa réplication en présence de lésions (cf. partie C).

III.Blocages de la fourche de réplication

Après sa mise en place et son démarrage, la fourche de réplication peut répliquer plusieurs milliers de bases avant de rencontrer une fourche convergente, provenant du « réplicon » adjacent (le réplicon correspond à la région d’ADN en cours de synthèse délimitée par deux fourches de réplication divergentes). Cependant, son parcours est « semé d’embûches » car des obstacles peuvent interférer avec sa progression et la ralentir, voire la bloquer (Tableau 1). Un ralentissement de la fourche peut intervenir lorsqu’elle traverse un site dit « fragile » du génome, sans qu’aucune lésion de l’ADN ne soit présente. Par ailleurs, des lésions entraînent un blocage de la fourche plus ou moins long, avec soit un franchissement rapide (cf. partie C) soit une activation du point de contrôle de réplication qui maintiendra l’intégrité de la fourche en attendant la réparation de l’ADN (cf. partie B).

1. Blocage de la fourche de réplication en absence de lésion de l’ADN

Les sites « fragiles » du génome correspondent à des zones où la réplication est ralentie, voire stoppée. Ce ralentissement peut être dû à la nature même du segment d’ADN répliqué : on parle alors de zone de réplication lente (Cha and Kleckner, 2002). Il existe aussi des barrières à la réplication formées par des protéines fortement associées à l’ADN. L’exemple le plus classique est celui de la protéine Fob1 qui, chez S. cerevisiae, a pour fonction programmée de bloquer les fourches de réplication au niveau des répétitions d’ADNr (Kobayashi and Horiuchi, 1996; Takeuchi et al., 2003). Ce blocage est destiné à éviter les collisions entre les fourches de réplication et la machinerie de transcription ; ces collisions doivent être évitées pour empêcher des blocages encore plus longs des fourches de

réplication, qu’on observe par exemple au niveau des gènes codant les ARNt (Deshpande and Newlon, 1996). Par ailleurs, certaines structures secondaires de l’ADN sont aussi une cause de ralentissement des fourches de réplication. C’est notamment le cas des structures en épingle formées par l’ADN dans les régions contenant des séquences répétées (Lemoine et al., 2005).

Le point commun entre ces obstacles à la réplication, outre leur origine endogène, est leur capacité à bloquer à la fois l’hélicase réplicative (MCM) et les ADN polymérases. Ils n’entraînent donc pas l’activation à proprement parler du point de contrôle de réplication, qui nécessite un découplage entre ces enzymes afin d’exposer de l’ADN sous forme simple brin (cf. partie B). Cependant, l’activité basale des composants du point de contrôle de réplication est nécessaire pour le maintien de l’intégrité des fourches de réplication confrontées à ces ralentissements.

2. Blocage de la fourche de réplication suite à une lésion de l’ADN

De par sa structure et sa composition chimique, l’ADN est une molécule chimiquement réactive, cible d’agents génotoxiques d’origine endogène ou exogène.

Les agents génotoxiques endogènes sont principalement les radicaux libres produits par le métabolisme mitochondrial. Ils peuvent modifier les bases par des réactions d’oxydation ou par l’ajout de groupements méthyles par exemple. De telles modifications des bases

Obstacle rencontré Blocage en absence de lésion Point de contrôle Site fragile : - complexe ADN-protéines - zone lente Base altérée : - modification - ablation Blocage en présence de lésions Origine Structure secondaire Pontage intrabrin Effondrement Clivage

Cassure simple ou double brin Pontage interbrins Endogène Endogène / exogène Exogène Endogène Endogène / exogène Exogène Activité basale du PCR Activation du PCR Activation du PCR Activation du PCR, mais faible Activation du PCIS

PCR : point de contrôle de réplication ; PCIS : point de contrôle intra-S.

provoquent un blocage des ADN polymérases qui sont incapables de les prendre en charge. De la même manière, les polymérases sont bloquées lorsqu’elles atteignent un site abasique de l’ADN, apparu spontanément ou après l’action de la voie de réparation par excision de base (BER).

Par ailleurs, nombre d’agents environnementaux sont capables d’endommager l’ADN. C’est le cas des radiations ionisantes ou ultra-violet (UV). Les premières induisent des cassures double brin de l’ADN qui causent l’effondrement des fourches de réplication lorsqu’elles les rencontrent. De tels effondrements interviennent aussi après le passage de la fourche de réplication à travers une cassure simple brin de l’ADN (Figure 17). Les radiations UV peuvent, quant à elles, générer des radicaux libres dans la cellule, qui auront les mêmes conséquences que les radicaux libres d’origine endogène. De plus, elles forment dans l’ADN des structures particulières pontant deux thymines voisines du même brin. Ces pontages intra-brin bloquent les ADN polymérases, dont le site actif est trop étroit pour accommoder deux bases en même temps. Par contre ils n’ont aucun effet sur la progression de l’hélicase réplicative. Ainsi, s’ils ne sont pas franchis rapidement grâce à des polymérases spécialisées (cf. partie C), les pontages intra-brin induits par les UV entraînent l’activation du point de contrôle de réplication (Neecke et al., 1999), car ils provoquent une accumulation d’ADN simple brin au niveau de la fourche de réplication. Le cas des pontages inter-brins produits par des agents comme la cisplatine ou la mitomycine D est moins évident. Ces lésions bloquent non seulement les polymérases mais aussi l’hélicase et nécessitent une voie de réparation particulière qui dépend entièrement de leur rencontre par une fourche de réplication (cf. partie E). Ils sont cependant capables d’entraîner une certaine activation du point de contrôle de réplication (Pichierri and Rosselli, 2004).

B -

B

:

I.Activation du point de contrôle de réplication

1. Quand et pourquoi ?

Le point de contrôle de réplication est activé en réponse à un blocage prolongé des fourches de réplication (Paulovich and Hartwell, 1995), la plupart du temps suite à une rencontre avec des lésions de l’ADN. Ces lésions peuvent avoir été introduites directement en phase S, ou plus tôt dans le cycle. Dans ce dernier cas, elles auraient échappé au point de contrôle G1/S, comme c’est par exemple le cas pour les pontages inter-brins difficilement reconnaissables par la cellule en dehors de la réplication. Quelle qu’en soit l’origine, l’activation du point de contrôle de réplication va donner du temps à la cellule pour réparer les lésions de l’ADN avant de relancer les fourches de réplication (Figure 7). De plus, la réplication consommant beaucoup d’énergie, le point de contrôle veille aussi à l’état de l’environnement extérieur. Par exemple, il est activé quand les cellules sont en situation d’hypoxie, même en absence de dommages de l’ADN (Hammond et al., 2002; Hammond et al., 2003). Un autre point de contrôle est activé en phase S en réponse à des cassures double brin hors des fourches : c’est le point de contrôle intra-S, que nous ne détaillerons pas dans cette étude. L’activation du point de contrôle de réplication dépendant essentiellement d’un blocage des fourches, il est possible de la provoquer par une inhibition des composants du réplisome. Deux drogues sont fréquemment utilisées pour ce faire : l’hydroxyurée, qui provoque une déplétion des dNTP en inhibant la ribonucléotide réductase, et l’aphidicoline, qui inhibe les ADN polymérases.

2. Notion de seuil

Le paramètre important à considérer lors de l’activation du point de contrôle de réplication est la durée du blocage subi par les fourches de réplication, pour deux raisons. Certaines lésions peuvent être franchies par les fourches de réplication sans nécessiter de réparation particulière (cf. partie C) ; l’activation du point de contrôle est donc inutile dans ce cas. Par contre, certaines lésions ne peuvent pas être franchies facilement par les fourches de réplication, ce qui implique une réparation afin de relancer ces dernières.

Figure 7. Traitement par la cellule d’une lésion ou d’une région de l’ADN interférant avec la réplication.

En phase S normale, les fourches de réplication peuvent être amenées à ralentir leur progression à certains sites du génomes, dits « sites fragiles » (Deshpande and Newlon, 1996; Takeuchi et al., 2003), que nous avons décrit précédemment. Là encore, l’activation intempestive du point de contrôle entraînerait un ralentissement considérable du cycle cellulaire. Ceci implique qu’un seuil d’activation existe. Ce seuil est mis en évidence par un traitement à l’hydroxyurée : il y a en effet une corrélation entre le nombre de fourches actives au moment du traitement et l’intensité du point de contrôle (Shimada et al., 2002). Cela signifie que suite à un blocage des fourches de réplication, le signal mais aussi le seuil d’activation du point de contrôle partent des fourches bloquées elles-mêmes.

3. Mécanismes moléculaires de l’activation

Il a été montré que l’ADN simple brin, quand il s’accumule aux fourches de réplication, constitue un signal d’activation du point de contrôle de réplication (Costanzo et al., 2003; Garvik et al., 1995). Chez S. cerevisiae, une cellule en réplication normale peut accumuler une longueur de 300 nucléotides d’ADN simple brin ; un traitement des cellules à l’hydroxyurée provoque une augmentation de cette longueur à environ 500 nucléotides pour activer le point de contrôle. Cette longueur serait atteinte à partir d’environ 50 fourches de réplication bloquées (Sogo et al., 2002).

L’ADN simple brin généré au niveau des fourches de réplication est recouvert par RPA (cf. partie A). Logiquement, l’accumulation entraîne une accumulation corrélée de RPA au niveau des fourches (Byun et al., 2005; Tercero et al., 2003; Zou and Elledge, 2003). En utilisant un système « cell free » dérivé d’œufs de Xénope, Byun et al. ont montré que cette accumulation d’ADN simple brin et de RPA au niveau de la fourche nécessite un découplage entre l’hélicase réplicative MCM et les ADN polymérases.

L’ADN simple brin recouvert par RPA permet de recruter non seulement la kinase ATR via sa sous unité régulatrice ATRIP (Zou and Elledge, 2003), mais aussi le complexe RAD17-RFC(2-5) qui à son tour recrute le complexe RAD9-RAD1-HUS1 (complexe 911) (Zou et al., 2002) (Figure 8). Ce type de recrutement est analogue à celui de PCNA par RFC (cf. partie A). Les fixations sur la chromatine du complexe 911 et d’ATR sont indépendantes, mais toutes deux nécessaires pour une pleine activation du point de contrôle (Zou et al., 2002). Ces

Figure 8. Activation du point de contrôle de réplication par la voie ATR-CHK1. La

synthèse du brin retardé se fait de manière discontinue, sous la forme de fragments d’Okasaki. La polymérase réplicative déplace, lorsqu’elle la rencontre, l’amorce d’ARN synthétisée par la primase. Cette amorce est ensuite clivée par l’endonucléase FEN1, puis les fragments d’Okasaki sont ligués par une ADN ligase. Si une lésion est présente en face du brin retardé, elle n’entraînera donc pas de blocage de la fourche. Par contre, la rencontre d’une lésion par le brin leader provoque le blocage de la polymérase et son découplage de l’hélicase. Ce découplage entraîne une accumulation au niveau de la fourche d’ADN simple brin et de RPA, augmentant le recrutement des complexes ATR-ATRIP, RAD17-RFC(2-5) et RAD9-RAD1-HUS1 (911), qui s’associent constitutivement à la fourche de réplication via RPA. Leur accumulation permet la phosphorylation de CHK1 par ATR et l’activation du point de contrôle de réplication.

protéines font partie de la catégorie des détecteurs parmi les nombreuses protéines impliquées dans l’activation du point de contrôle de réplication (Tableau 2), qui se traduit par la phosphorylation de la kinase CHK1 par ATR, sur deux sérines situées dans la partie C-terminale de CHK1 (Bao et al., 2004). La phosphorylation par ATR et l’activation de CHK1 après un stress réplicatif requièrent aussi la présence d’une protéine médiatrice, la claspine (Guo et al., 2000; Lin et al., 2004). Enfin, chez l’homme, MCM7 participerait aussi à l’activation du point de contrôle de réplication, grâce à des interactions avec RAD17 d’une part (Tsao et al., 2004), et ATRIP d’autre part (Cortez et al., 2004).

4. Activité basale du point de contrôle

La claspine est chargée sur la chromatine indépendamment de RPA (Lee et al., 2003) et participe aussi à la réplication normale en absence de stress, car sa suppression cause une baisse de la prolifération cellulaire (Lin et al., 2004). Comme la claspine, les protéines du point de contrôle de réplication (comme ATR ou les complexes RAD17-RFC(2-5) et 911) sont associées aux fourches en progression en absence de stress réplicatif ; ceci caractérise l’activité basale du point de contrôle de réplication, qui intervient lors des ralentissements ou des blocages transitoires des fourches de réplication. Lorsqu’un blocage prolongé survient, c’est leur accumulation qui permet l’activation du point de contrôle de réplication, expliquant ainsi la notion de seuil évoquée plus haut.

5. Limitations au modèle d’activation du point de contrôle

Le modèle d’activation du point de contrôle de réplication que nous venons de décrire repose sur l’accumulation de RPA au niveau des fourches bloquées, suite à un découplage entre le complexe MCM et les ADN polymérases. Dans ce cas, comment expliquer la légère activation du point de contrôle suite à un traitement des cellules par des agents pontant de l’ADN (Pichierri and Rosselli, 2004)? En effet un pontage inter-brins est supposé bloquer aussi l’hexamère MCM, et en théorie ne pas provoquer l’accumulation d’ADN simple brin. On peut penser que c’est la prise en charge des fourches bloquées par des pontages inter-brins qui entraîne cette accumulation d’ADN simple brin, déclenchant ainsi le point de contrôle. C’est par exemple le cas pour certaines lésions induites par les UV, dont les intermédiaires de réparation génèrent de l’ADN simple brin reconnu par RPA et ATR (Zou and Elledge, 2003). Cependant, il existe pour les pontages inter-brins une voie spécifique que nous détaillerons plus loin, la voie Fanconi Anemia, qui semble être responsable de

l’activation du point de contrôle de réplication lorsque les fourches de réplication rencontrent de tels pontages.

D’autres données chez S. cerevisiae sont aussi en contradiction avec le modèle énoncé précédemment. En effet, des mutants pour la grande sous unité de RPA, Rpa1, ne sont que partiellement déficients pour l’activation du point de contrôle de réplication (Lucca et al., 2004). Cette observation est à relier avec celle montrant que les ADN polymérases α et ε sont toutes les deux requises pour activer ce point de contrôle (Bhaumik and Wang, 1998; Navas et al., 1995; Tan and Wang, 2000). Leur fonction, tout du moins pour la polymérase ε, pourrait reposer sur la partie C-terminale de la sous unité catalytique de l’holoenzyme. En effet, ce domaine est dépourvu d’activité catalytique, mais est nécessaire pour la viabilité des levures (Feng and D'Urso, 2001). On peut ainsi imaginer une deuxième voie d’activation du point de contrôle via une détection directe du blocage des fourches par les polymérases. Cette voie pourrait coopérer avec la voie ATR-CHK1 pour une réponse complète à un stress réplicatif.

II.Fonctions du point de contrôle de réplication

1. Stabilisation des fourches de réplication

a) Activité basale et activation du point de contrôle

Le point de contrôle de réplication doit permettre la réparation des lésions de l’ADN ayant provoqué le blocage des fourches de réplication. Pendant cette réparation, les fourches doivent rester intègres avant d’être relancées. En effet, une perte massive des fourches de réplication serait désastreuse pour la cellule, ne permettant pas la fin de la phase S. Des travaux récents conduits chez S. cerevisiae laissent penser que la stabilisation des fourches de réplication bloquées est le moyen principal utilisé par le point de contrôle de réplication pour maintenir la viabilité cellulaire, en comparaison de ses autres fonctions (Lopes et al., 2001; Tercero and Diffley, 2001; Tercero et al., 2003).

Il faut garder à l’esprit l’activité basale du point de contrôle, car elle joue un rôle primordial. En effet, lorsque les fourches arrivent à des sites fragiles du génome, elles ralentissent et doivent être stabilisées. Cette stabilisation est assurée chez la levure par l’activité basale du point de contrôle de réplication, via les homologues fonctionnels d’ATR et CHK1, Mec1 et Rad53 (Cha and Kleckner, 2002). Lorsque les fourches subissent un blocage massif, c’est la même activité, au niveau moléculaire, qui intervient. On passe alors d’une activité basale à une pleine activité, mais les mécanismes moléculaires sont sensiblement les mêmes.

Chez les levures mutées pour Rad53, le point de contrôle de réplication n’est pas fonctionnel, même si l’on considère son activité basale. On constate chez ces mutants une accumulation de structures aberrantes, dites en « chicken foot », dues à la régression des fourches de réplication ralenties ou bloquées (Sogo et al., 2002). L’apparition de ces structures ressemblant à des jonctions de Holliday dépend de deux événements : la fuite du réplisome, puis le changement de conformation de la fourche, via l’activité recombinase de Rad51 (Figure 9). L’activité du point de contrôle de réplication s’exerce donc à ces deux niveaux.

b) Stabiliser le réplisome

Des levures traitées à l’hydroxyurée, donc subissant un blocage de la réplication, ont toujours la capacité de redémarrer la réplication une fois le bloc levé. Pendant un blocage de la réplication, PCNA peut quitter la chromatine, mais est capable de s’y recharger avant le redémarrage de la réplication (Dimitrova and Gilbert, 2000). Une étude a montré que les polymérases α et ε sont stabilisées aux fourches bloquées, non pas grâce à l’activation de Rad53, mais grâce à l’activité de Mec1, l’homologue fonctionnel d’ATR (Cobb et al., 2003). Les auteurs n’ont pas étudié le cas des MCM, mais il est clair que celles-ci doivent aussi être stabilisées aux fourches car elles ne peuvent pas être rechargées sur la chromatine durant la phase S (cf. partie A). Si la perte des MCM intervient à quelques fourches, on peut penser que les réplicons adjacents se chargeront de terminer la réplication. Cependant, en cas de blocage

Tableau 2. Facteurs impliqués dans les points de contrôle chez les eucaryotes.

S. cerevisiae

Détecteurs

Mammifères

Médiateurs

S. pombe

Rad24-(Rfc2-5) Rad17-(Rfc2-5) RAD17-(RFC2-5)

Effecteurs Classe

Ddc1 Rad9 RAD9

Mec3 Hus1 HUS1

Rad17 Rad1 RAD1

Mec1 Rad3 ATR

Ddc2/Pie1/Lcd1 Rad26 ATRIP

Tel1 Tel1 ATM

Rad9 Crb2 BRCA1 Mrc1 Mrc1 Claspine Rad53 Cds1 CHK2 Chk1 Chk1 CHK1 Dpb11 Cut5 TopBP1 MDC1 53BP1

Figure 9. Conséquences du blocage des fourches de réplication. En présence d’un point de

contrôle actif, les fourches de réplication sont stabilisées, prévenant ainsi toute fuite du réplisome. De plus, l’activité de la kinase DDK et de la phosphatase CDC25A, qui active les kinases CDK, est réprimée. Cela entraîne une inhibition des origines de réplication encore non activées. En absence de point de contrôle actif, le réplisome quitte les fourches qui ont tendance, avec l’activité de Rad51, à régresser pour former des structures aberrantes.

massif des fourches lors d’un traitement des cellules à l’hydroxyurée, le point de contrôle de réplication doit stabiliser, en plus des polymérases, les MCM. En effet, une perte des MCM à toutes les fourches impliquerait une incapacité des cellules à relancer la réplication après la levée du blocage et la fin du point de contrôle de réplication. Il a été montré par exemple que chez la souris, MCM4 est phosphorylée par des composants du point de contrôle de réplication sur des résidus importants pour l’activité hélicase du complexe MCM (Ishimi et al., 2003). Ceci peut expliquer l’inhibition des MCM aux fourches actives et inactives, mais ne met pas en lumière le mécanisme de stabilisation exact des MCM par le point de contrôle de réplication. Une étude chez S. cerevisiae a montré que Mrc1, l’homologue fonctionnel de la claspine, pourrait via sa phosphorylation par Mec1 et son interaction avec les MCM, stabiliser le complexe MCM jusqu’à la fin du blocage de la réplication (Nedelcheva et al., 2005). C’est peut-être un début d’explication ; cependant, aucune fonction de la claspine en rapport avec les MCM n’a pour l’instant été montrée chez les vertébrés.

c) Conserver la topologie des fourches : empêcher la recombinaison

Le blocage des fourches de réplication engendre une accumulation d’ADN simple brin qui constitue un site de recrutement pour RPA pour activer le point de contrôle de réplication. Cependant, la recombinase Rad51, qui permet l’invasion de brin lors de la réaction de recombinaison homologue (Sung, 1994), a aussi de l’affinité pour l’ADN simple brin. On imagine aisément que des événements de recombinaison aux fourches de réplication sont susceptibles de créer des structures aberrantes n’ayant plus rien à voir avec des fourches. Il est donc nécessaire pour la cellule d’empêcher la recombinaison quand les fourches bloquées ne sont pas endommagées. Ainsi, pour assurer leur topologie, un point de contrôle de réplication fonctionnel ne permet pas aux fourches de réplication bloquées d’accumuler des intermédiaires de recombinaison (Sogo et al., 2002). Ceci s’observe suite à un traitement à l’hydroxyurée chez S. cerevisiae, où les protéines de recombinaison comme Rad51 ne sont pas recrutées aux fourches bloquées à moins qu’elles ne se soient effondrées (Lisby et al., 2004). Cela montre que le point de contrôle de réplication veille à maintenir la stabilité de la fourche lorsqu’elle est bloquée ou ralentie, mais que par la suite, la recombinaison peut être nécessaire pour réparer la fourche ayant été endommagée (cf. partie D).

La cellule dispose de plusieurs moyens pour limiter les réactions de recombinaison inutiles au niveau des fourches de réplication. Chez S. cerevisiae, PCNA est sumoylée lors de la phase S (Hoege et al., 2002), ce qui lui permet de recruter une hélicase particulière, Srs2.