BRCA1 interagit avec MCM7

1. Mise en évidence de l’interaction BRCA1 - MCM7

Dans le cas où BRCA1 serait capable de catalyser la poly-ubiquitinylation de MCM7, une interaction entre les deux protéines devrait être visible. Nous avons donc testé cette interaction dans deux lignées cellulaires différentes. L’immunoprécipitation de MCM7 endogène entraîne la co-immunoprécipitation de BRCA1 dans des cellules 293T (Figure 26A) et HeLa (non représenté). L’obtention du même résultat dans deux lignées différentes milite pour une interaction in vivo entre BRCA1 et MCM7. Il sera cependant important de confirmer cette interaction dans une lignée cellulaire mammaire, constituant un meilleur modèle pour l’étude de BRCA1.

Nous avons ensuite étudié l’interaction entre MCM7 et la moitié N-terminale de BRCA1 (BRCA1-NT), car cette partie de la protéine contient le domaine RING Finger et est nécessaire et suffisante pour assurer l’ubiquitinylation des substrats in vitro (Ruffner et al., 2001). La surexpression dans des cellules 293T de BRCA1-NT et de MCM7 respectivement fusionnées aux étiquettes MYC et FLAG, suivie d’une immunoprécipitation de BRCA1-NT par un anticorps anti-MYC, montre qu’il existe bien une interaction entre MCM7 et la moitié

Figure 26. BRCA1 interagit avec MCM7. (A) Un lysat de cellules 293T a été

immunoprécipité avec du sérum pré-immun (piste 2) ou un anticorps anti-MCM7 (piste 3). Les protéines immunoprécipitées et le lysat (piste 1) ont été analysés par un immunomarquage avec des anticorps anti-BRCA1 (panneau du haut) et anti-MCM7 (panneau du bas). (B) Des lysats de cellules 293T transfectées par 2µg de pSGF-MCM7 en combinaison avec 4 µg de pcDNA3 (pistes 1 et 3) ou 2µg de mycBRCA1-NT et 2µg de pcDNA3-BARD1 (pistes 2 et 4) ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-MYC. Les lysats (pistes 1 et 2) et les protéines immunoprécipitées (pistes 3 et 4) ont été analysées par immunomarquage avec des anticorps anti-FLAG (panneau du haut) et anti-MYC (panneau du bas). (C) Même expérience qu’en (B), à l’exception que pSGF-MCM7 a été remplacé par pSGF-R2.

N-terminale de BRCA1 (Figure 26B). Etant donné le fort niveau de surexpression dans les cellules 293T, nous avons voulu écarter l’éventualité d’une simple agrégation des protéines mimant leur interaction. Nous avons donc répété la même expérience en remplaçant FLAG-MCM7 par FLAG-R2, mais dans ce cas aucune co-immunoprécipitation de FLAG-R2 et MYC-BRCA1-NT n’a été mise en évidence (Figure 26C).

2. BARD1 renforce l’interaction BRCA1 - MCM7

Il est établi que la protéine BARD1 s’associe à BRCA1 via son domaine RING Finger. Cette interaction stabilise BRCA1 et est donc nécessaire à sa pleine activité E3 ligase. (cf. chapitre 1, D). Un changement de structure de BRCA1 associée à BARD1 est envisageable, qui pourrait modifier sa capacité à interagir avec MCM7. Nous avons donc testé l’effet de BARD1 sur cette interaction en surexprimant FLAG-MCM7 et MYC-BRCA1-NT, en présence ou en absence de BARD1 fusionnée à l’étiquette HA. La présence de cette dernière augmente de manière significative la précipitation de FLAG-MCM7 par un anticorps anti-MYC (Figure 27A, comparer les pistes 3 et 4). Cela signifie que BARD1 renforce l’interaction entre MCM7 et BRCA1. Par ailleurs, la co-expression de BARD1 stabilise MYC-BRCA1-NT, comme nous l’attendions (Figure 27B, C, comparer les pistes 2 et 3), mais

Figure 27. BARD1 renforce l’interaction BRCA1 - MCM7. (A) Des lysats de cellules

293T transfectées par 2µg de pSGF-MCM7 et 2µg de pcDNA3-mycBRCA1-NT en combinaison avec 2 µg de pcDNA3 (pistes 1 et 3) ou 2µg de pcDNA3-BARD1 (pistes 2 et 4) ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-MYC. Les lysats (pistes 1 et 2) et les protéines immunoprécipitées (pistes 3 et 4) ont été analysés par immunomarquage avec un anticorps anti-FLAG. (B, C) Des cellules 293T ont été transfectées par 2µ g de pSGHA-MCM4 (B) ou 2µg de pSGHA-MCM6 (C) en combinaison avec 4µg de pCDNA3 (pistes 1 et 4) ou 2µg de pCDNA3 et 2µg de pcDNA3-mycBRCA1-NT (pistes 2 et 4) ou 2µ g de pcDNA3-mycBRCA1-NT et 2µ g de pcDNA3-BARD1 (pistes 3 et 6). Les lysats ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-HA et analysés, comme les protéines immunoprécipitées, par immuno-marquages avec des anticorps anti-HA (pan-neaux du haut) et anti-MYC (pan(pan-neaux du bas).

aussi FLAG-MCM7 (Figure 27A, comparer les pistes 1 et 2). Ceci constitue une première indication de la fonction stabilisatrice de BRCA1-BARD1 sur MCM7.

Nous avons ensuite testé l’effet de la surexpression de BARD1 sur une éventuelle interaction entre BRCA1 et MCM4 et 6. Des cellules 293T ont été transfectées par des combinaisons de vecteurs codant pour différentes protéines: MYC-BRCA1-NT, BARD1 et HA-MCM4 ou HA-MCM6. Bien qu’efficace, l’immunoprécipitation de MCM4 et 6 par un anticorps anti-HA n’a entraîné aucune co-immunoprécipitation de MYC-BRCA1-NT (Figure 27B, C). De plus, la stabilisation de MCM7 observée en présence de BRCA1 n’est pas retrouvée pour MCM4 et 6 (Figure 27B, C, comparer les pistes 2 et 3).

3. L’inhibition du protéasome renforce l’interaction BRCA1 - MCM7

Pour finir, nous avons testé l’effet de l’ubiquitinylation de MCM7 sur son interaction avec BRCA1. Des cellules 293T ont été transfectées par les vecteurs d’expression de FLAG-MCM7, MYC-BRCA1-NT et BARD1 et soumises ou non à un traitement au MG132 pour favoriser l’accumulation des formes poly-ubiquitinylées de MCM7. Cette accumulation est visible suite à l’immunoprécipitation de MCM7 par un anticorps anti-FLAG (Figure 28). Ce qui est surprenant est l’association de MYC-BRCA1-NT avec FLAG-MCM7 en présence de MG132. En effet, cet inhibiteur du protéasome renforce l’interaction entre les deux protéines, et cet effet n’est pas du à une variation de leurs niveaux cellulaires (Figure 28, comparer les pistes 1 et 2). Ainsi, interférer avec la prise en charge des formes poly-ubiquitinylées de MCM7 permettrait de renforcer l’interaction MCM7-BRCA1, ce qui sera discuté plus loin.

Figure 28. L’inhibition du protéasome renforce l’interaction BRCA1 - MCM7. Des cellules 293T

ont été transfectées par 2µg de pSGF-MCM7, 2µg de mycBRCA1-NT et 2µ g de pcDNA3-BARD1, puis traitées (pistes 2 et 4) ou non (pistes 1 et 3) pendant 3 heures par 20µM de MG132. Les lysats ont été immunoprécipités et analysés, comme les protéines immunoprécipitées, par immunomarquages avec des anticorps anti-MYC (panneau du haut) et anti-MCM7 (panneau du bas). Pour l’analyse avec l’anti-MCM7, une exposition longue est montrée (panneau du milieu) et la position des marqueurs de poids moléculaire ayant migré en parallèle est indiquée.