Résultats des travaux de thèse : Régulations de MCM7, facteur de
IV. Mise en place d’un test in vitro de l’activité hélicase du sous complexe MCM4,6,7
1. Purification du sous complexe MCM4,6,7
L’activité hélicase du complexe MCM a déjà été reproduite in vitro grâce à la production du sous complexe MCM4,6,7 recombinant à partir de cellules d’insectes co-infectées par des baculovirus contenant l’ADNc de chacune des trois sous unités. Ceci a été réalisé pour les sous complexes de levure (Lee and Hurwitz, 2001) et de souris (Ishimi, 1997), mais jamais pour le complexe humain.
En plus du baculovirus contenant l’ADNc codant pour FLAG-MCM7 que nous avons utilisé pour les tests d’ubiquitinylation de MCM7 (cf. partie B), nous avons produit des baculovirus contenant les séquences codantes de HA-MCM4 et His-MCM6. Ainsi, la présence des trois étiquettes, FLAG, HA et His, devait permettre une purification en trois étapes du sous complexe via des colonnes de résine Ni-NTA, puis de billes d’agarose couplées à un anticorps HA et enfin FLAG. Cependant, les résines Ni-NTA et anti-HA n’ont pas donné de résultats intéressants : la première ne permettant pas de bien séparer le complexe des contaminants du lysat cellulaire, et la deuxième n’offrant pas des rendements importants par rapport à son coût de mise en œuvre (au niveau de la résine en elle-même comme au niveau du peptide HA permettant l’élution des protéines). Nous avons donc opté pour une autre stratégie de purification (Figure 38A).
Les protéines contenues dans le lysat de cellules d’insecte SF21 co-infectées par les baculovirus permettant l’expression des trois MCM d’intérêt ont été purifiées sur résine anti-FLAG-M2 (Figure 38B), puis concentrées par une précipitation au sulfate d’ammonium pour être soumises à une séparation par gel filtration. Cette dernière étape s’est notamment avérée nécessaire pour éliminer un dernier contaminant doté d’une activité nucléase responsable de la dégradation du substrat utilisé pour le test hélicase. L’analyse du complexe purifié après gel filtration permet de bien distinguer, sur gel d’acrylamide, les quatre bandes correspondant à MCM4, MCM6 et au doublet caractéristique de MCM7 (Figure 38C). Ceci illustre encore l’intérêt d’utiliser les cellules d’insecte pour produire des protéines recombinantes comportant les différentes modifications post-traductionnelles retrouvées in vivo.
2. Purification de la protéine Tax
Au sein du laboratoire, la purification de la protéine Tax avait déjà été tentée à partir d’une production en bactéries, mais sans succès. En effet cette protéine est très insoluble et
Figure 38. Purification des protéines nécessaires au test de l’effet de Tax sur l’activité hélicase du complexe MCM4,6,7. (A) Résumé des purifications. (B,C) Purification du sous
complexe MCM4,6,7. Coloration à l’argent des gels et position des marqueurs de poids moléculaire ayant migré en parallèle indiquée sur la gauche. (B) Les protéines précipitées du lysat (Ly) ont été déposées sur une colonne de résine anti-FLAG-M2. La résine a été lavée trois fois et les protéines ont été éluées par une solution contenant du peptide FLAG. Des fractions équivalentes des protéines non accrochées (FT, “Flow Through”, piste 2), des lavages (pistes 3 à 5) et des élutions (pistes 6 à 11) ont été séparées sur gel d’acrylamide 8%.
(C) Analyse du sous complexe MCM4,6,7 purifié après résine anti-FLAG-M2 et gel
filtration. (D,E) Purification de FLAG-Tax. (D) Les protéines du lysat cellulaire (Ly, piste 1) ont été déposées sur une colonne de résine d’héparine puis éluées par des concentrations croissantes de NaCl. Des fractions équivalentes des protéines non accrochées (FT, piste 2) et des élutions (pistes 3 à 8) ont été séparées sur gel d’acrylamide 8% et analysées par immunomarquage avec un anticorps anti-FLAG. (E) Les protéines éluées de la résine d’héparine entre 150 et 450 mM de NaCl (Ly, piste 1) ont été déposées sur une colonne de résine anti-FLAG-M2. La résine a été lavée trois fois et les protéines ont été éluées en une seule fois par une solution contenant du peptide FLAG. Des fractions équivalentes des protéines non accrochées (FT, piste 2), des lavages (pistes 3 à 5) et de l’élution (piste 6) ont été analysées par immunomarquage avec un anticorps anti-FLAG. L’élution a aussi été analysée par coloration du gel au bleu de Coomassie (panneau de droite).
même les techniques permettant de la purifier à partir des corps d’inclusion bactériens n’ont pas donné de résultats satisfaisants. Nous avons donc pensé que la production de Tax dans des cellules d’insecte permettrait de régler ce problème. Un baculovirus permettant l’expression de FLAG-Tax a donc été produit. L’expression de la protéine dans les cellules SF21 s’est avérée correcte, et elle a été purifiée de la même manière que FLAG-MCM7 seule (Figure 33), c'est-à-dire sur résines d’héparine et anti-FLAG-M2 (Figure 38A, D et E).
3. Test de l’activité hélicase du sous complexe MCM4,6,7 humain purifié
Le substrat utilisé pour le test d’activité hélicase est semblable à ceux utilisés par les différents groupes ayant effectué ce type de test. Il s’agit de l’ADN circulaire simple brin du phage M13 hybridé à un oligonucléotide marqué radioactivement à son extrémité 5’. L’hybridation n’est que partielle et laisse libre l’extrémité 3’ de l’oligonucléotide (Figure 39). La séparation de cet oligonucléotide de l’ADN circulaire par une activité ADN hélicase est visible après migration sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel. L’avantage de ce test est de pouvoir tester l’effet de variations de température, de concentrations en sels, et bien entendu – c’est ce qui nous intéresse ici – de protéines supplémentaires. Malheureusement, après avoir testé de nombreuses conditions expérimentales, nous n’avons pu obtenir d’activité hélicase significative pour le complexe purifié. Cette activité est certes visible (Figure 39), mais trop faible pour qu’un quelconque effet de Tax puisse être détecté (non représenté).
Figure 39. Test de l’activité ADN hélicase du complexe MCM4,6,7 purifié. Le substrat
utilisé pour le test est composé de l’ADN circulaire du phage M13 hybridé sur une longueur de 37 nucléotides à un oligonucléotide radioactif. 5 fmol de substrat ont été dénaturées par chauffage à 95°C (Sd, piste 1) ou incubées 1 heure à 37°C avec 0, 50, 100 ou 200 ng de complexe MCM4,6,7 purifié (pistes 2 à 5). Un contrôle a été effectué en incubant 5 fmol de substrat avec 200 ng de complexe MCM4,6,7 préalablement dénaturé par chauffage pendant 10 minutes à 95°C (piste 6). Après la fin de la réaction, les mélanges ont été déposés sur un gel d’acrylamide à 12%, et la radioactivité a été révélée avec un Phosphorimager.