124
Réplication de l ’ ADN
Mega: 106 Giga: 109 Tera: 1012 Peta: 1015
Exa: 1018 2 bytes/nt => 1018/gramme 1 000 000 000 Gigabytes
125
ADN ARN
Transcription Réplication
ADN
Protéines
Traduction Les grandes étapes de la biologie moléculaire
124
ADN
Réplication
ADN
Les grandes étapes de la biologie moléculaire
La réplication du génome doit se faire:
Complètement: tout le matériel chromosomique doit être transmis
Fidèlement: aucune erreur ne doit être faite (risque de mutation)
Précisément: lors de chaque division cellulaire
ADN
i+ dNTP ADN
i+1+ PP
ii
127128
Mode de réplication universel de la bactérie aux mammifères
129
Réplication
Les grandes étapes de la biologie moléculaire
130
Les grandes étapes de la biologie moléculaire
Expérience historique de Meselson et Stahl (1958).131
Les grandes étapes de la biologie moléculaire
Expérience historique de Meselson et Stahl (1958).Concentration croissante en chlorure
de césium (CsCl)
1,70<d<1,75 d=1,724
Après centrifugation à l’équilibre
132
Les grandes étapes de la biologie moléculaire
Expérience historique de Meselson et Stahl (1958).3ème réplication
Dans l’azote léger
(14N)
NB: L’épaisseur des bandes d’ADN est proportionnelle à la quantité présente 100%
50%
50%
133
134
La copie d ’ un brin se fait en se servant d’un brin
comme modèle.
L ’ enzyme place sur le nouveau brin une base complémentaire à la base
présente sur le modèle
Le brin néoformé est 100% complémentaire
du brin initial
135
ATGCCTTATAGGC TACGGAATATCCG
TACGGAATATCCG
ATG
136
ATGCCTTATAGGC TACGGAATATCCG
TACGGAATATCCG ATGCCTTATAGGC
Molécules absolument identiques
137
ADN
Le support génétique
138
138
Mécanisme moléculaire de la réplication
5’ 3’5’ 3’ Cellule mère 3’
5’
5’
3’
5’ 3’
5’ 3’
Cellule fille Cellule fille
Cellule mère
Cellule fille Cellule fille
139
140
Mécanisme moléculaire de la réplication Fourche de réplication
Forme theta
141En 1956, Arthur Kornberg purifie l'ADN polymérase I et démontre que celle-ci ne peut polymériser de l
’ADN que dans une seule direction
5’-> 3’
Mécanisme moléculaire de la réplication
3’
5’
3’
5’
ADN 3’
5’
5’
3’
Non
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’ 5’
Non
Oui
Non
que si présence d’une extrémité 3‘ et d’un brin modèle…
Réplication
+dNTPs +ADNpol-I
5’
3’ 5’
3’
142 O
O
OH
O O
O
P O O
O O
O-
O
O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3’
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O O- O
Nucleotide triphosphate
143O O
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3’
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O
O- OH O
:
144 O O
OH
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O
P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3 ’
Radiomarquage d’un ADN
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O O- O
Nucleotide triphosphate
*
α32P-NTP
145
146
O-
3 ’
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O
O- OH O
:
O O
O O
O
P O O
O O
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O
P O
-O
5 ’
5 ’ 3 ’
Radiomarquage d’un ADN
*
α32P-NTP
147 O O
OH
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3 ’
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O O- O
Nucleotide triphosphate
*
Radiomarquage d’un ADN
γ32P-NTP
148
Structure de l’AZT et du 3TC
O
O HN
N
Thymidine
OHO CH3
OH
O
O HN
N
AZT
OHO CH3
N3
NH
O N
N
3TC
OHO
S 2
149 O
O
OH
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3’
O O
N3
P O
O-
P O
O-
P O
O-
O O- O
Nucleotide triphosphate
150 O O
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O
P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3 ’
O P O O
O-
P O
O-
P O
O-
O
O- OH O
:
N3
151
152 O O
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O
P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3 ’
O P O
O-
O O
P O
O-
P O
O-
O
O-
O- N3
Nucleotide triphosphate
153ADN pol 3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
déplacement
154
Réplication de l ’ ADN
Expérience d’Okazaki Cellules en cours de division
Marquage radioactif (dNTP-α32P) sur une courte période Analyse de la taille des ADN produits
ADN longs
Mutant ligase sauvage
ADN courts
ADN courts
155 ADN pol
3’
5’
3’
5’
5’
5’ 3’
3’
Réplication de l ’ ADN
déplacement
156 3’
5’
3’
5’
5’
5’ 3’
3’
Réplication de l ’ ADN
ADN pol déplacement
5’
primase
Amorce (primer) ARN (10-12nts) 3’
157
158 3’
5’
3’
5’
5’
5’ 3’
3’
Réplication de l ’ ADN
ADN pol déplacement
5’
primase
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
3’
159 3’
5’
5’
Réplication de l ’ ADN
ADN pol déplacement
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
primase 5’ 3’
3’
5’
160 3’
5’
5’
Réplication de l ’ ADN
ADN pol déplacement
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
ADN pol
déplacement
Fragments d’Okazaki 5’ 3’
3’
5’
3’ 5’
X
161 3’
5’
5’
Réplication de l ’ ADN
ADN pol déplacement
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
Fragments d’Okazaki 5’ 3’
3’
5’
3’ 5’
X
ADN pol ADN pol
162 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
déplacement
primase ADN pol
ADN pol
163
164 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
ADN pol déplacement
primase ADN pol
ADN pol
165 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
ADN pol déplacement
ADN pol ADN pol
3’
166 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
déplacement
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
3’ 5’ déplacement
ADN pol ADN pol
167
Réplication de l ’ ADN
168 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Réplication de l ’ ADN
déplacement
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
Fragments d’Okazaki
déplacement
Avancée de la fourche de réplication
primase 3’ 5’ ADN pol ADN
pol
ADN pol ADN polIII ADN ADN polI pol ADN pol
ligaseligase 3’
5’
3
’ 5
’
5’
ligase
169
170
Réplication de l ’ ADN
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
Amorces (primers) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
Fragments d’Okazaki
déplacement
Avancée de la fourche de réplication
primase ADN pol ADN
pol 3’
ADN pol ADN polIII ADN ADN polI pol ADN pol ligase
ligaseligase 3’
5’
3
’ 5 5’ ’
171
Réplication de l ’ ADN
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Activité exonucléase 5’-> 3’ de l’ADN polI:
élimination des amorces ARN
172
Réplication de l ’ ADN
3’
5’
5’
3’
déplacement
Brin avancé (leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
5’3’
ADN pol
Avancée de la fourche de réplication
ADN pol
ADN pol ADN polIII ADN ADN polI
pol ligaseligase
Duplication parfaite
173 O
O
OH
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3’
O O
OH P O
O-
P O
O-
P O
O-
O O- O
Nucleotide triphosphate
mésappariement
174
Réplication de l ’ ADN
Activité de correction: activité exonucléase : 3’-> 5’Appariement TA
Appariement CG
Mésappariement GA
Mésappariement CA
Mésappariement TG Mésappariement induit une déviation de l’axe de l’ADN
Pur/Pyr Pyr/Pur
>>>
Pur/Pur Pyr/Pyr
175
176
Réplication de l ’ ADN
Activité de correction: activité exonucléase : 3’-> 5’Mésappariement induit une déviation de l’axe de l’ADN
Pur/Pyr Pur/Pur
Pyr/Pur >>> Pyr/Pyr
177
Réplication de l ’ ADN
Activité de correction: activité exonucléase : 3’-> 5’Mésappariement induit une déviation de l’axe de l’ADN
Pur/Pyr Pur/Pur
Pyr/Pur >>> Pyr/Pyr
178
Réplication de l ’ ADN
Activité de correction: activité exonucléase : 3’->5’
Correction:
activité exonucléase 3’-> 5’
Réplication:
activité polymérase 5’-> 3’ 5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
179 O
O
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5’
3 ’
5 ’ 3’
O O
OH P
O-
O O
180
Réplication de l ’ ADN
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
Fragments d’Okazaki
déplacement
Avancée de la fourche de réplication
primase 3’ 5’ ADN pol ADN
pol
ADN pol ADN polIII ADN ADN polI pol ADN pol ligase
ligaseligase 3’
5’
3
’ 5
’ Structuration
hélicoïdale de l’ADN
181
182
Réplication de l ’ ADN
183
184
Réplication de l ’ ADN
Mécanisme d ’ action de la topoisomérase de type I
Clivage d’une liaison phosphodiester (hydrolyse)
185 O
O
O O
O
P O O
O O
O-
O O P O
-O
O O O P O
-O
O O O P O
-O
5 ’
3 ’
5 ’ 3’
O O
OH P
O-
O O
HO H
186 187
188
Réplication de l ’ ADN
Mécanisme d ’ action de la topoisomérase de type I
Topoisomérase de type II coupe les deux brins simultanément
(Formes relaxée/hyperenroulée de l’ADN plasmidique)189
Réplication de l ’ ADN
Mécanisme d ’ action de la topoisomérase de type II
Segment G et T = ADN Double brin
190
Réplication de l ’ ADN
Mécanisme d ’ action de la topoisomérase de type II
Doxorubicine
Cible biologique de la doxorubicine (agent anticancéreux)
(etoposides et mitoxantrone) 191
Réplication de l ’ ADN
202
192
Réplication de l ’ ADN
ATP => ADP + Pi
Hélicase
203 193Réplication de l ’ ADN
ATP => ADP + Pi
Hélicase
Hélicase sur le brin retardé et à « contre-sens » de la primase
From NE. Dixon, 2009
Nature 462, 854-855. 204
5’
3’
194 195
Réplication de l ’ ADN
ADN
Single strand binding
(SSB)
proteins 205
196
Réplication de l ’ ADN
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
Amorce (primer) ARN (10-12nts) Brin avancé
(leader strand)
Brin retardé (lagging strand)
Fragments d’Okazaki
déplacement
Avancée de la fourche de réplication
primase 5’ ADN pol ADN
3’ pol
ADN pol ADN polIII ADN ADN polI pol ADN pol ligase
ligaseligase 3’
5’
3
’ 5
’ Topoisomerase
(DNA gyrase)
hélicase (+ATP) SSB
197
Réplication de l ’ ADN
From Biochemistry by Mathews, van Holde, and Ahern.
*Polymerase type II impliquée dans la réparation
*
(ε subunit)
198
Réplication de l ’ ADN
ADN polymérase III ADN polymérase I
Activité exonucléase 3’ -> 5’
199
200
Réplication de l ’ ADN
Protéines impliquées dans la réplication chez E-coli
Protéines Fonction Taille
(kDa) Nb de molécules
par cellules
Gyrase relaxe l’ADN double hélice 400 250
(topo-isomérase) DnaB (Hélicase) dissocie la double hélice 300 20
SSB proteins stabilise les régions monocaténaires 74 300
Primase synthétise les amorces ARN 60 50
ADN Pol III synthétise l’ADN 800 20
ADN Pol I élimine l’amorce ARN et les remplace 103 300
DNA ligase soude les extrémités ADN 74 300
ADN polIII = complexe multiprotéique
201
Réplication de l ’ ADN
Sous-unité α ADN polymérase 5’->3’ (x2) Sous-unité ε Exonucléase 3’->5’ (x2) Sous-unité θ stimule exonucléase ε (x2) Sous-unité τ dimérisation des unités α
core
Sous-unité γ fixe de l’ATP (pour pince β) Sous-unité δ fixe β
Sous-unité δ' fixe α et δ Sous-unité χ fixe SSB protéines
Sous-unité β pince β Complexeγ
γ
ADN polIII’ ADN polIII* PolIII HOLOENZYME Processivité 10 60 200 10000
202
Réplication de l ’ ADN
primase
γ
3’ 5’
5’
3’ 5’
3’ 5’
5’
Amorce ARN Fragment
d’OKAZAKI 3’
3’
203
Réplication de l ’ ADN
ADN Polymerase III (core enzyme)
Pince Beta
Pince Beta
204
Réplication de l ’ ADN
γ
3’5’
5’
3’ 5’
3’
5’
Amorce ARN Fragment
d’OKAZAKI 3’
3’
205
Réplication de l ’ ADN
γ
3’5’
5’
3’ 5’
3’
3’
3’
206
Réplication de l ’ ADN
Nouveau cycle de réplicationγ
207
Réplication de l ’ ADN
5’ 3’
5’ 3’
Fragment d’Okazaki antérieur
polIII
Pince β
5’ 3’
5’ 3’
polIII
