BIOSECURITE AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE :

(1)

VICE-PRIMATURE CHARGEE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

*******

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

*********

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

***********

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

Option : Analyses Biomédicales

Présenté et soutenu par : Abdoul Madjeed Boladé YEKINI Tutrice de stage : M^me Agnès HOUNWANOU

Inspectrice d’Action Sanitaire A1 Laboratoire National de Santé Publique Ministère de la Santé

BIOSECURITE AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE : ROLE DES FLORES DE LA BOUCHE ET DES CHEVEUX

DANS LA CONTAMINATION DES ECHANTILLONS

8^ème promotion de Licence professionnelle

RAPPORT DE STAGE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

Superviseur : Prof. Honoré BANKOLE

Microbiologiste Maître de Conférences des

Universités du CAMES UAC/EPAC JURY

Président :

Prof. Théodora A. AHOYO Enseignante à l’EPAC/UAC

Membres :

Prof. Honoré BANKOLE Enseignant à l’EPAC/UAC

Dr. Victorien DOUGNON Enseignant à l’EPAC/UAC

THEME

(2)

REPUBLIQUE DU BENIN

*****

VICE-PRIMATURE CHARGEE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

*******

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

*********

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

***********

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

Option : Analyses Biomédicales

DIRECTEUR : Professeur Félicien AVLESSI

DIRECTEUR ADJOINT : Professeur Clément BONOU

CHEF DEPARTEMENT : Docteur AKPOVI Casimir

(3)

LISTE DES ENSEIGNANTS

(4)

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

ENSEIGNANTS PERMANENTS

NOM et Prénoms Matières enseignées AHOYO Théodora

Angèle

Microbiologie générale Microbiologie médicale AKPOVI D. Casimir Physiologie humaine

Biochimie ANAGO Eugénie

Biochimie structurale Biochimie métabolique

Biologie moléculaire ATCHADE Pascal Parasitologie générale

Parasitologie médicale BANKOLE Honoré Bactériologie Appliquée DOUGNON Victorien TP de Bactériologie appliquée

Méthodologie de la recherche LOKO S. Frédéric Biochimie clinique

LOZES Evelyne Immunologie générale SEGBO A. G. Julien Biochimie métabolique

Biologie Moléculaire YOVO K. S. Paulin Physiologie Humaine

Pharmacologie Toxicologie LOKOSSOU Adjimon

Gatien

Immunologie

(5)

ENSEIGNANTS VACATAIRES

ABLEY Sylvestre Déontologie Médicale

ADISSODA Cyrille Anglais

AKOWANOU Christian Physique

AGBANGLA Clément Génétique Moléculaire AGOSSOU Gilles Législation et Droit du Travail AKOGBETO Martin Entomologie Médicale

ALITONOU Guy Chimie Organique

ANAGONOU Sylvère Education Physique et Sportive AVLESSI Félicien Chimie Générale

KOFFI Aristide Anglais

BINAZON Claude César Soins Infirmiers et Phlébotomie

DARBOUX Raphaël Histologie

DESSOUASSI Noël Biophysique

DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et

Méthodologie de Communication FOURN Léonard Santé Publique

HOUNNON Hyppolite Mathématiques

HOUNSOSSOU Hubert Biométrie et Anatomie Générale MASLOKONON Vincent Histologie Générale

SENOU Maximin Histologie

SECLONDE Hospice Immunohématologie et Transfusion Sanguine

TOPANOU Adolphe Hématologie Générale YANDJOU Gabriel Techniques d’Expression et

Méthodologie de Communication

(6)

DEDICACE

(7)

A tous les scientifiques qui œuvrent pour le bien-être des populations ! Merci.

(8)

REMERCIEMENTS

(9)

Je dois satisfaire à un agréable devoir, celui de témoigner ma gratitude et ma profonde reconnaissance à tous ceux qui de près ou de loin ont participé à l’élaboration de cette œuvre :

 A Allah le Tout Miséricordieux ! Pour avoir veillé sur moi durant tout mon cursus scolaire et universitaire et sans qui ce travail n’aurait jamais été possible.

 A mon père El-Hadj Abou YEKINI et ma mère El-Hadja Chérifath DOGNON ! Pour qu’ils y voient la consécration de tous les efforts consentis à mon égard depuis 20 ans. Qu’Allah veille sur vous et vous permette de jouir des fruits de vos efforts.

 Au Professeur Frédéric LOKO ! Directeur de la Pharmacie des Médicaments et des Explorations Diagnostiques, qui en sa qualité d'autorité compétente a donné une suite favorable à notre demande de stage.

 Au Professeur Honoré BANKOLE ! Pour avoir accepté de superviser ce travail et pour m’avoir accompagné tout au long de cette expérience professionnelle avec beaucoup de patience et de pédagogie. Malgré vos multiples occupations, vous avez toujours été présent et disponible. Puisse le Tout Puissant vous combler au-delà de vos attentes et vous accorder une longue vie.

 A madame Agnès HOUNWANOU ! Pour votre disponibilité sans faille et votre suivi rigoureux de ce travail. Puisse l’Eternel vous accorder santé, paix et longévité. Une fois encore merci.

 Au Docteur Victorien T. DOUGNON, Professeur-assistant à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi ! Merci pour votre implication active dans ce travail.

(10)

 Aux doctorants, madame Olivia HOUNGBEGNON et monsieur Jerrold AGBANKPE ! Pour leur soutien et toute l’attention portée à notre égard au cours de ce travail. Puisse le Tout Puissant vous assister dans vos recherches et vous combler de toute sa grâce.

 A messieurs François HOUNSOU et Emmanuel DJOSSOU ! Pour vos sages conseils et votre soutien indéfectible.

 A tout le personnel du Laboratoire National de Santé Publique ! Pour son accueil, ses conseils et son amabilité.

 Aux autorités et enseignants de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calvi ! Recevez ici le témoignage de ma profonde gratitude pour la qualité de formation.

 A tous mes camarades de promotion ! Merci pour les bons moments passés en votre compagnie.

(11)

HOMMAGES

(12)

 A son Excellence, le Président du Jury !

En acceptant de présider notre Jury de soutenance de rapport de stage de fin de formation, vous nous faites un grand honneur. Par vos observations, nous espérons améliorer ce travail. Nous vous prions de croire en l’expression de notre profond respect.

 Aux Honorables Membres du Jury !

Nous sommes très heureux de vous avoir dans notre jury. Vos remarques sont indispensables à l’amélioration de ce travail. Hommages respectueux.

(13)

LISTE DES TABLEAUX

(14)

Tableau I : Distribution des streptocoques dans la cavité orale………...………... 3 Tableau II : Répartition de la population en fonction du sexe………... 18 Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de leur provenance……... 19 Tableau IV : Répartition des échantillonsen fonction du résultat de la culture………… 20 Tableau V : Répartition des échantillons en fonction des résultats du Gram…………... 21 Tableau VI : Répartition des groupes de bactéries isolés………... 22 Tableau VII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons…. 23 Tableau VIII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du statut…………. 24 Tableau IX : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe…... 25

(15)

SOMMAIRE

(16)

Introduction……… 1 CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE…………..……… 3 1- MICROFLORE ORALE

2- MICROFLORE DES CHEVEUX

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES……….………… 8 1- CADRE

2- MATERIEL 3- METHODES

CHAPITRE III : RESULTATS ET COMMENTAIRE……….……... 18 1- RESULTATS

2- COMMENTAIRE

Conclusion et suggestions...………... 29

(17)

Le laboratoire de microbiologie a pour rôle d’isoler et d’identifier l’agent d’infection. Pour la fiabilité des résultats, des mesures doivent être prises pour éviter toute contamination exogène lors des manipulations. La présente étude a eu pour objectif, de montrer l’importance du port d’un masque bucco-nasal et d’un calot lors des manipulations en microbiologie. Pour ce faire, 20 techniciens des laboratoires de microbiologie ont soufflé puis secoué les cheveux, chacun respectivement sur deux différentes plaques de gélose Mueller Hinton. Les géloses ainsi contaminées, ont été incubées à 37^oC pendant 24 heures. Après incubation, une analyse des cultures obtenues a été réalisée et les différentes bactéries isolées ont été identifiées. Au terme de cette étude, les groupes de bactéries couramment isolés des échantillons pathologiques, ont été observés aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre de ces derniers, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%). En cas du non-respect du port d’un masque bucco-nasal et d’un calot, les échantillons et milieux de culture courent le risque d’être souillé. Il est alors nécessaire de couvrir les cheveux et la bouche lors des manipulations en microbiologie.

Mots clés : contamination en microbiologie, cheveux, bouche.

The microbiology laboratory role is to isolate and identify the agent of infection. For the reliability of the results, measures must be taken to avoid exogenous contamination during handling. The present study objective was, to show the importance of wearing an oral nasal mask and a cap during handling in microbiology. To do this, 20 technicians of microbiology laboratories have blown and then rocked the hair, each respectively on two different plates of agar Mueller Hinton. The plates thus contaminated, were incubated at 37^oC for 24 hours.

After incubation, the cultures obtained were analysed and different bacteria have been identified.

At the end of this study, groups of bacteria commonly isolated from the pathological samples, were observed both at the level of mouth and hair.

Among these, Bacillus spp come to mind (48.21%), followed by staphylococci (39.29%). In case of no respect of wearing an oral nasal mask and a cap, samples and culture media run the risk of being contaminated. It is then necessary to cover hair and mouth during handling in microbiology.

Key words : contamination in microbiology, hair, mouth.

RESUME ABSTRACT

(18)

INTRODUCTION

(19)

Dans les centres de santé au Bénin, le port de calot chez les hommes et de charlotte chez les femmes est une habitude au niveau des membres du personnel de la chirurgie dans l’exercice de leur fonction. Il en est de même pour le masque bucco-nasal.

Cette attitude n’est pas toujours observée chez les biotechnologistes et particulièrement ceux qui manipulent dans les laboratoires de microbiologie. Pour la fiabilité des résultats des différents examens réalisés au laboratoire de microbiologie, il est impératif que les biotechnologistes respectent les règles de bonne conduite. Au nombre de ces règles, figure la couverture des cheveux, de la bouche et du nez.

En effet, des germes exogènes peuvent toujours se retrouver dans les échantillons biologiques ou les milieux de culture au cours des manipulations. Ces germes peuvent provenir de l’environnement de manipulation, ainsi que de la bouche ou des cheveux des manipulateurs. Les cheveux et la bouche contiennent plusieurs espèces de bactéries. La présente étude a eu pour objectif général de détecter des sources de contamination en microbiologie.

Spécifiquement, il s’est agi de :

- Détecter le risque de contamination par la bouche des échantillons biologiques et milieux de culture au cours des manipulations ;

- Déceler le risque de contamination par les cheveux des échantillons biologiques et milieux de culture au cours des manipulations.

Après avoir décrit quelques notions générales sur les microbes de la bouche et des cheveux, seront successivement exposées la méthodologie suivie, les résultats obtenus et le commentaire qui en découle. Enfin une conclusion viendra clore le travail.

(20)

CHAPITRE I

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

(21)

1- MICROFLORE ORALE

La microflore orale est un système écologique complexe où près de 700 espèces de microorganismes ont été identifiées [2]. Il s’agit essentiellement des genres Streptococcus, Actinomyces, Prevotella, Fusobacterium [5]

1-1- Streptococcus

Il y a quatre principales espèces de streptocoques dans la cavité buccale. Il s’agit de Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus et Streptococcus mitis [7].

Tableau I : Distribution des streptocoques dans la cavité orale [4]

Espèces Joue Langue Salive Dents

S. mutans - - +/- ++

S. mitior +++ +++ +++ +++

S. salivarius - ++ ++ -

1-1-1- Streptococcus mutans

Streptococcus mutans est une bactérie à Gram positif qui vit dans la bouche.

Il peut prospérer à une température de 18 à 40°C. La bactérie métabolise différents types d'hydrates de carbone, créant ainsi un environnement acide dans la bouche.

C’est cet environnement qui provoque la carie dentaire. Streptococcus mutans est considéré comme le plus cariogène de l'ensemble des streptocoques oraux [6].

(22)

1-1-2- Streptococcus salivarius

Surtout retrouvées dans la salive, ce sont des bactéries anaérobies facultatives, Gram positif et de forme sphérique ou ovoïde. Streptococcus salivarius est un streptocoque α-hémolytique qui colonise l'être humain quelques heures après la naissance. La bactérie est considérée comme un pathogène opportuniste, trouvant sa place dans la circulation sanguine. Elle est aussi impliquée dans de rares cas de méningite et de bactériémie [1].

1-1-3- Streptococcus anginosus

Ces bactéries sont des cocci immobiles à Gram positif, regroupés en diplocoques et en courtes chaînes. Streptococcus anginosus est une bactérie commensale des muqueuses oropharyngées, intestinales et génitales. Il peut être responsable de suppurations profondes. Il est également impliqué dans des suppurations abdominales et des infections de la peau et des tissus mous. Il peut provoquer des infections osseuses et articulaires ainsi que des septicémies néo- natales [8].

1-1-4- Streptococcus mitis

Ce sont des bactéries commensales de la cavité buccale qui colonisent les surfaces dures telles que les tissus dentaires ainsi que les muqueuses de la flore buccale. Elles sont généralement regroupées en courtes chaînettes [2].

1-2- Actinomyces spp

Le genre Actinomyces appartient à la famille des Actinomycetaceae. Il s’agit de bacilles à Gram positif de 0,4 à 1 µm droits, incurvés ou pléomorphes.

(23)

Ils apparaissent individuellement, en paires, en grappes ou en chaînettes courtes après coloration. Les humains constituent le réservoir biologique des bactéries du genre Actinomyces [4]. Elles font partie de la flore buccale normale et sont un important constituant de la plaque dentaire [3].

1-3- Prevotella spp

Bacille à Gram négatif, il fait partie de la flore buccale et vaginale. Il est retrouvé dans les infections anaérobies des voies respiratoires. Au nombre de ces infections, on peut citer la pneumonie d'aspiration, l’abcès du poumon, l’empyème pulmonaire, l'otite moyenne et la sinusite chronique. Prevotella spp est prédominant dans les maladies et abcès parodontaux [8].

1-4- Fusobacterium spp

Le genre Fusobacterium est composé de bacilles anaérobies, Gram négatif étroits, aux extrémités effilées ou pléomorphiques. Ils ne forment pas de spores.

Ils présentent une coloration irrégulière [4].

2- MICROFLORE DES CHEVEUX

Les cheveux constituent la zone la plus contaminée du corps humain. En effet, ils sont en majorité colonisés par les bactéries de la flore résistante cutanée.

Il s’agit notamment de Propionibacterium acnes, Corynebacterium spp, Micrococcus spp, Staphylococcus epidermidis [3].

(24)

2-1- Propionibacterium acnes

Les espèces de Propionibacterium peuvent être retrouvées partout sur le corps. Propionibacterium acnes est en grande partie commensale chez les personnes adultes saines [3].

2-2- Corynebacterium spp

Les bactéries du genre Corynebacterium sont des bacilles immobiles à Gram positif disposés en palissades et en lettres V avec des extrémités souvent renflées [7].

2-3- Micrococcus spp

Une étude a montré que les microcoques constituent 1 à 20 % de la flore aérobie totale isolée de la peau de la tête, des jambes et des bras. Moins de 1 % de ces isolats correspond à des zones de haute densité bactérienne comme les aisselles ou les narines [5]. Les microcoques sont rarement isolés sur la peau d'enfants de moins d'un an[2].

2-4- Staphylococcus epidermidis

C’est une bactérie cocci à Gram positif. Elle fait partie de la flore humaine normale [3]. Bien que S. epidermidis ne soit généralement pas pathogène, les patients dont le système immunitaire est affaibli sont néanmoins à risque de développer des infections. Ces infections sont généralement acquises à l'hôpital [6]. Faisant partie de la flore normale de la peau, S. epidermidis est un contaminant fréquent des échantillons envoyés au laboratoire de diagnostic [4].

(25)

CHAPITRE II

MATERIEL ET METHODES

(26)

1- CADRE

Notre formation théorique et pratique s’est déroulée à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi pendant trois années. Quant à notre stage pratique pour la rédaction du présent rapport, il a eu lieu au Laboratoire National de Santé Publique de Cotonou.

1-1-Cadre institutionnel

L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi est une institution sise à l’Université d’Abomey-Calavi. Elle offre des programmes de formation en licence professionnelle dans les domaines de Génie Biologique et de Génie Civil.

1-2-Cadre technique

Le Laboratoire National de Santé Publique est situé dans l’enceinte du Ministère de la Santé. Il s’occupe, entre autres, de développer « des méthodes d’analyses biologiques, d’organiser toutes les enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en général et des maladies transmissibles en particulier et d’assurer l’organisation des stages pratiques des élèves et étudiants en provenance des structures agrées de formation.

Le Laboratoire National de Santé Publique est pluridisciplinaire et comporte les sections suivantes : la biochimie, l’hématologie, la parasitologie, la sérologie et la bactériologie.

1-2-1- Section de biochimie

Dans cette section les paramètres dosés sont : - la glycémie ;

- l’urée ; - la créatine ;

(27)

- l’acide urique ; - les cholestérols ; - le calcium ; - le magnésium ; - les triglycérides ;

- la glycémie post prandiale ; - les transaminases ;

- les bilirubines ; - le gamma-GT ; - le phosphate alcalin ; - les protides ;

- l’ionogramme sanguin.

1-2-2- Section d’hématologie Les examens réalisés sont :

- la numération formule sanguine ; - la numération des leucocytes ; - le temps de saignement ; - le temps de coagulation ; - le temps de la prothrombine ; - le temps de la céphaline kinase ; - la vitesse de sédimentation ;

- le groupage sanguin et facteur Rhésus ; - l’électrophorèse de l’hémoglobine.

1-2-3- Section de parasitologie

La parasitologie s’occupe des examens suivants : - la goutte épaisse ;

(28)

- le frottis sanguin ;

- la coprologie complète ; - l’acétonurie et l’albuminurie ; - la glucosurie ;

- les protéines de 24 heures.

1-2-4- Section de sérologie

Tous les examens de cette section se réalisent avec le sérum. Ce sont:

- le sérodiagnostic de Widal ; - la sérologie HIV ;

- TPHA et VDRL ; - le TBG sérique ; - le TBG urinaire ;

- la recherche des anticorps antistreptolysine O ; - la recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B ; - la recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C ; - la recherche de la protéine C réactive ;

- la recherche des IgM et IgG anti-toxoplasmiques ; - la recherche des IgG anti-Chlamydia trachomatis ; - la recherche des IgM anti-rougeoleuses ;

- la recherche des IgM anti-rubéoleuses ; - la recherche des IgM anti-amaril.

1-2-5- Section de bactériologie

Les examens effectués au niveau de la paillasse de cette section sont : - examen cytobactériologique des urines avec antibiogramme ; - examen cytobactériologique des sécrétions cervico-vaginales ; - examen cytobactériologique des sécrétions urétrales ;

(29)

- examen cytobactériologique des pus ;

- examen cytobactériologique du liquide céphalo-rachidien ; - coproculture.

2- MATERIEL

2-1- Matériel biologique

Le matériel biologique a été constitué de 40 échantillons provenant de la bouche et des cheveux des stagiaires et du personnel de la section de Bactériologie du Laboratoire National de Santé Publique.

2-2- Milieux de culture

- Gélose Mueller Hinton ; - Bouillon cœur cervelle ; - Gélose Kligler Hajna ; - Gélose mannitol-mobilité ; - Gélose au citrate de Simmons ; - Bouillon urée-indole.

2-3- Réactifs et colorants - Violet de gentiane ; - Lugol ;

- Alcool à 95 °C ;

- Fuschine de ziehl diluée au 1/10^e; - Réactif de Kovacs;

- Plasma lyophilisé de lapin.

(30)

2-4- Appareils

- Etuve DIN 12880 ;

- Microscope optique Olympus CX 31 ; - Autoclave Thermoscientific Varioklav ; - Centrifugeuse Nüvefuge CN 180 ; - Four poupinel Titanox ;

- Réfrigérateur Kirsch ;

- Balance de précision Kern 440-47N.

2-5- Autre matériel

- Tubes à hémolyse ;

- Lames de verre porte-objet ; - Lamelles de verre couvre-objet ; - Anse de platine ;

- Pipettes Pasteur stériles ;

- Boîtes de Pétri stériles à usage unique.

3- METHODES

3-1- Préparation des milieux de culture

Les milieux de culture ont été préparés selon les indications des fabricants (annexe 2).

3-2- Manipulations au laboratoire 3-2-1- Première journée

La première journée a été consacrée aux prélèvements. Ces prélèvements ont été réalisés au niveau de la bouche et des cheveux.

(31)

3-2-1-1- Bouche

- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;

- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;

- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ;

- Souffler 3 fois sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;

- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.

3-2-1-2- Cheveux

- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;

- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;

- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ; - Laver les mains à l’eau et au savon ;

- Sécher les mains à l’aide de papier essuie-mains stériles ; - Secouer les cheveux sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;

- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.

Toutes les géloses ainsi contaminées ont été incubées à 37^oC pendant 24 heures.

3-2-2- Deuxième journée

Le lendemain, les milieux de culture ont été sortis de l’étuve puis examinés.

Pour les cultures positives, une description de la taille, de la couleur, de l’aspect et du contour des différents types de colonies observés a été réalisée.

(32)

Toutes les cultures positives ont ensuite fait l’objet d’un examen à l’état frais et d’un examen à l’état coloré après confection d’un frottis pour chaque type de colonie.

3-2-2-1- Description des différents types de colonie

Cette description a concerné la taille, la couleur et la forme des colonies.

3-2-2-2- Examen à l’état frais

Il a été réalisé pour chacun des types de colonies observées.

 Technique

- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;

- Prélever 2 gouttes d’eau physiologique au centre de la lame ; - Sélectionner un type de colonie ;

- Prélever une partie de cette colonie et l’écraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ;

- Recouvrir la préparation d’une lamelle ;

- Observer au microscope optique à l’objectif X40.

3-2-2-3- Examen à l’état coloré a)- Confection de frottis

 Technique

- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;

- Prélever une goutte d’eau physiologique au centre de la lame ; - Prendre une partie de la colonie sélectionnée ;

(33)

- Ecraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ; - Laisser sécher ;

- Fixer à la flamme.

Le frottis ainsi confectionné a été coloré au Gram.

b)- Coloration de Gram

 Technique

- Recouvrir l’étalement de violet de gentiane pendant 60 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;

- Recouvrir de lugol pendant 60 secondes ; - Rincer à nouveau à l’eau de robinet ;

- Recouvrir l’étalement d’alcool à 95^oC pendant 45 secondes ; - Rincer abondamment à l’eau de robinet ;

- Recouvrir de fuschine de Ziehl diluée au 1/10^ème pendant 20 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;

- Laisser sécher la lame.

Le frottis ainsi coloré a été observé au microscope optique à l’objectif X100.

3-2-2-4- Analyse des résultats de la coloration de Gram

Après la coloration de Gram, seul ont été pris en compte les bacilles à Gram négatif et des cocci à Gram positif pour l’identification. Les colonies correspondantes ont été réensemencées sur des plaques de gélose Mueller Hinton en vue d’obtenir des cultures pures.

(34)

3-2-3- Troisième journée

Cette journée a été consacrée à la lecture des géloses Mueller Hinton ensemencées la veille. Un examen de Gram contrôle a été réalisé sur toutes les cultures.

3-2-3-1- Identification des bacilles à Gram négatif

Les bacilles à Gram négatif ont été identifiés par la recherche de l’oxydase (annexe 1) et par ensemencement de la galerie de Leminor. Cette galerie est constituée de la gélose Kligler-Hajna, la gélose mannitol-mobilité, la gélose au citrate de Simmons et le bouillon urée-indole.

3-2-3-2- Identification des cocci à Gram positif

La catalase, la staphylocoagulase libre et la Dnase ont été recherchées. De même, le camp test a été réalisé (annexe 1).

3-2-3-3- Identification des cocci à Gram négatif

Les cocci à Gram négatif ont été identifiés par ensemencement de la gélose chocolat plus polyvitex suivi du test à l’oxydase. En cas d’oxydase positive le test à l’hydrolyse des sucres notamment le glucose, le maltose, le fructose et le saccharose a été réalisé.

3-2-3- Quatrième journée

La lecture des tests biochimiques et des galeries a été effectuée.

(35)

CHAPITRE III

RESULTATS ET COMMENTAIRE

(36)

1- RESULTATS

Tableau II : Répartition de la population en fonction du sexe

Sexe Effectif Pourcentage

 Masculin

- Personnel - Stagiaire

10

1 9

50

5 45

 Féminin

10

1 9

50

5 45

Total 20 100

La répartition de la population selon le sexe montre que la sex-ratio est égale à 1.

(37)

Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de leur provenance Echantillons

Total Bouche Cheveux

Personnel

2 (5%)

4 (10%)

Stagiaire

18 (45%)

36 (90%)

Total

20 50%

40 (100%)

La majorité des échantillons analysés provenait des stagiaires (90%).

(38)

Tableau IV : Répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture Résultat de la culture

Total

+ % - %

 Bouche

18

2 16

45

5 40

2

- 2

5

- 5

20

2 18

 Cheveux

20

2 18

50

5 45

-

- -

-

- -

20

2 18

Total 38 95 2 5 40

Deux échantillons provenant de la bouche ont montré une culture négative.

(39)

Tableau V : Répartition des échantillons en fonction des résultats du Gram Echantillons

Total Bouche Cheveux

 Cg (+)

4 (57,14%)

- 4

3 (42,86%)

- 3

7 (100%)

- 7

 Bg (-)

1 (50%)

- 1

1 (50%)

- 1

2 (100%)

- 2

 Bg (+)

9 (81,82%)

1 8

2 (18,18%)

- 2

11 (100%)

1 10

 Cg (+)/Bg (-)

1 (50%)

1 -

1 (50%)

1 -

2 (100%)

2 -

 Cg (+)/Bg (+)

1 (7,70%)

- 1

12 (92,30%)

- 12

13 (100%)

- 13

 Bg (-)/Bg (+)

2 (66,67%)

- 2

1 (33,33%)

1 -

3 (100%)

1 2

Cg (+) : Cocci à Gram positif ; Cg (-) : Cocci à Gram négatif ; Bg (+) = Bacilles à Gram positif ; Bg (-) : Bacilles à Gram négatif.

Toutes les catégories de bactérie couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.

(40)

Tableau VI : Répartition des groupes de bactéries isolés

Groupe de bactéries Effectif Pourcentage

Bacillus spp 27 48,21

Staphylococcus spp 22 39,29

Enterobacter spp 1 1,79

Citrobacter spp 1 1,79

Bg (-) non entérobactéries 5 8,93

Total 56 100

Bg (-) : Bacilles à Gram négatif

Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%).

(41)

Tableau VII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons

Groupe de bactéries

Bouche Cheveux

Total

Nb % Nb %

Bacillus spp 12 44,44 15 55,56 27 (100%)

Staphylococcus spp 6 27,27 16 72,73 22 (100%)

Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)

Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)

Bg (-) non entérobactéries 2 40 3 60 5 (100%)

Les groupes de bactéries dominants se retrouvent aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.

(42)

Tableau VIII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du statut

Personnel Stagiaire

Total

Nb % Nb %

Bacillus spp 2 7,41 25 92,59 27 (100%)

Staphylococcus spp 2 9,09 20 90,91 22 (100%)

Enterobacter spp - - 1 100 1 (100%)

Citrobacter spp - - 1 100 1 (100%)

Les deux grands groupes de bactéries (Bacillus spp et staphylocoques) obtenus après la culture, se sont retrouvés plus chez les stagiaires (92,59% et 90,91%) que chez le personnel.

(43)

Tableau IX : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe

Masculin Féminin

Total

Nb % Nb %

Bacillus spp 13 48,15 14 51,85 27 (100%)

Staphylococcus spp 11 50 11 50 22 (100%)

Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)

Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)

Les deux grands groupes de bactéries obtenus, se sont répartis presque équitablement entre les hommes (48,15% et 50%) et les femmes (51,85% et 50%) de cette étude.

(44)

2- COMMENTAIRE

La présente étude a eu pour objectif général de détecter des sources de contamination en microbiologie. La répartition de la population selon le sexe a donné une sex-ratio égale à 1. La majorité (90%) des échantillons provenait des stagiaires. Ceci s’explique par le fait que les stagiaires étaient les plus nombreux à donner leur consentement pour prendre part à cette étude.

La répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture, a révélé que 10% (2/20) des échantillons provenant de la bouche, ont montré une culture négative. Ceci pourrait être dû au fait que certains participants n’avaient pas bien soufflé sur les boîtes de gélose. En effet, les travaux de Purnima Kumar en 2013 ont révélé 398 différentes espèces de bactéries dans la bouche [3].

Tous les échantillons provenant des cheveux contenaient des bactéries. La culture bactérienne réalisée par un groupe d’élève en 2004 [5] a montré la présence de bactéries mais aussi celle des moisissures. Cette étude confirme la diversité des bactéries portées par les cheveux. Les moisissures n’ont pas été isolées dans la présente étude. Cela pourrait s’expliquer par le fait que des milieux de culture spécifiques des moisissures n’aient pas été utilisés.

Toutes les catégories de bactéries couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%) et des bacilles à Gram négatif non entérobactéries (8,93%). Ces groupes de bactéries sont ubiquitaires. Leur isolement d’échantillons pathologiques pourrait découler d’une contamination exogène. Ces groupes de bactéries peuvent donc se retrouver à tout moment sur les milieux de culture et dans les liquides biologiques lors des manipulations si des précautions ne sont pas prises pour éviter cette contamination.

(45)

Enterobacter spp et Citrobacter spp sont des entérobactéries. Leur présence dans la bouche pourrait se justifier par le fait que la bouche fait partie intégrante du tube digestif. Des bacilles à Gram négatif non entérobactéries ont été isolés.

Leur identification n’a pas pu être réalisée par faute de moyens matériels.

La répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons, a montré que les groupes de bactéries dominants se retrouvent aussi bien dans la bouche que dans les cheveux.

Bacillus spp et les staphylocoques obtenus après la culture, ont été retrouvés beaucoup plus chez les stagiaires (92,59% et 90,91%). Cette répartition s’explique par le fait que les stagiaires représentaient 90% de la population d’étude.

La répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe, a montré que les deux grands groupes de bactéries obtenus, se sont répartis presque équitablement entre les hommes (48,15% et 50%) et les femmes (51,85% et 50%) de cette étude.

(46)

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

(47)

La présente étude a révélé la présence d’un nombre considérable de bactéries dans la bouche et dans les cheveux. Ceci peut être une source potentielle de contamination exogène des échantillons et des milieux de culture au cours des manipulations en microbiologie. Il est donc impératif de porter lors de ces manipulations, un calot pour les hommes ou une charlotte pour les femmes et un masque bucco-nasal.

Pour terminer ce travail, nous suggérons :

- Aux autorités sanitaires à divers niveaux de sensibiliser les techniciens de laboratoire notamment ceux qui interviennent en microbiologie, sur la nécessité de couvrir les cheveux et la bouche lors des manipulations.

- A l’endroit du collectif chargé des travaux pratiques en microbiologie à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi, d’insister sur le port de calot et de masque bucco-nasal par les étudiants.

(48)

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

(49)

1) Agence de la santé publique du Canada. 2012. Streptococcus

salivarius, Fiches signalétiques d'agents pathogènes et appréciation du risque, consulté le 15Août 2015, disponible sur http://www.phac- aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-salivarius-fra.php 2) Bensing, B.A., Rubens C.E., Sullam P.M. 2001. Genetic loci of

Streptococcus mitis that mediate binding to human platelets. Infect Immun.

Mar., 69(3) :1373–1380.

3) Bruggemann H., Henne A., Hoster F., Liesegang H., Wiezer A., Strittmatter A., Hujer S., Dürre P., Gottschalk G. 2004. The complete genome sequence of Propionibacterium acnes, a commensal of human skin. Science,

305(5684): 671–673.

4) Citron D. M., Poxton I. R., Baron E. J. 2007. Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, and other anaerobic gram-negative rods. In P. R.

Murray, E. J. Baron, M. L. Landry, J. H. Jorgensen & M. A. Pfaller (Eds.), Manual of Clinical Microbiology,. Washington, D.C.ASM Press. 9th ed., pp.

911-932.

5) Fey P. D., Olson M. E. 2010. Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Future Microbiology, 5 (6): 917–933.

6) Heymann D. L. 2008. Control of communicable diseases manual.

Washington, DC: American Public Health Association. 19th Edition, pp 65- 85.

7) Kocur M. 2006. The genus Micrococcus. Prokaryotes, 3 : 961-971

8) Tanaka S., Yoshida M., Murakami Y. 2008. The relationship of Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens and Prevotella melaninogenica in the supragingival plaque of children, caries and oral malodor. J Clin Pediatr Dent, 32 (3): 195–200

(50)

ANNEXES

(51)

ANNEXE 1. MODE OPERATOIRE DE QUELQUES TESTS

 Recherche de la catalase

Une goutte d’eau oxygénée a été déposée sur une lame de verre. Une colonie isolée a été prélevée et déposée près de la goutte. Après émulsion, le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de la catalase.

 Recherche de la staphylocoagulase libre

0,25 ml de plasma de lapin reconstitué a été ajouté à 0,25ml d’une suspension bactérienne de 24h dans un tube à hémolyse. Le contenu du tube a été incubé à 37°C. La formation du coagulum commence après de 2 heures d’incubation. Lorsqu’une prise en masse du plasma est observée, la recherche de la coagulase libre est positive.

 Recherche de l’oxydase

Le disque d’oxydase a été posé sur une lame porte objet. Le disque a été ensuite humidifié avec une goutte d’eau distillée. Une colonie du germe à étudier a été écrasée sur le disque mouillé. L’apparition d’une coloration violacée signe la présence d’une oxydase.

 Réalisation du camp-test

- Faire une strie de Staphylococcus aureus productrice de toxine staphylococcique sur une gélose au sang de mouton ;

- Faire une strie de la souche à tester s’arrêtant à 5 mm de la strie précédente;

(52)

- Incuber 24h en aérobiose ; - Observer.

Un Camp-test positif se traduit par l'observation d'un croissant d'hémolyse franc à bords nets dans la zone d'intersection des deux stries.

(53)

ANNEXE 2. PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE

 Composition de la galerie de Leminor

La galerie de Leminor ou portoir rapide est composé du milieu Kligler Hajna, du milieu mannitol mobilité, du milieu citrate de Simmons, du milieu urée indole, et de l’eau peptonnée.

Préparation de la galerie de Leminor

 Gélose Kligler Hajna

- Verser 55g de poudre dans un litre d’eau distillée ; - Chauffer jusqu’à ébullition pendant 1 minute ;

- Répartir dans des tubes à vis stériles puis stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

 Le milieu du citrate de Simmons

 Le milieu de mannitol- mobilité

(54)

 Préparation du bouillon cœur cervelle

Ajouter 37g de poudre à un litre d’eau distillée. Bien mélanger et répartir dans des tubes à vis stériles. Stériliser pendant 15min à 121°C à l’autoclave.

 Composition et préparation du milieu de culture Mueller Hinton

La gélose Mueller Hinton est composée de 2 grammes d’infusion de viande de bœuf, de 17,5 grammes de peptone de caséine, 1,5 gramme d’amidon de maïs et de 17 grammes de gélose. Le pH du milieu est de 7,3. Pour sa préparation : - Ajouter 38 g de poudre à un litre d’eau distillée;

- Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète;

- Répartir dans des flacons puis stériliser à la vapeur pendant 15 minutes

(55)

TABLE DES MATIERES

(56)

Dédicace……….……… vii

Remerciements……….….. ix

Hommages……….. xii

Liste des tableaux………... xiv

Sommaire………... xvi

Résumé et abstract………. xvii

Introduction……….... 1

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE………. 2

1- MICROFLORE ORALE………. 3

1-1- Streptococcus………. 3

1-1-1- Streptococcus mutans………..………... 3

1-1-2- Streptococcus salivarius………..……….. 4

1-1-3- Streptococcus anginosus…………..……….. 4

1-1-4- Streptococcus mitis……… 4

1-2- Actinomyces spp……… 4

1-3- Prevotella spp……… 5

1-4- Fusobacterium spp………….……… 5

2- MICROFLORE DES CHEVEUX 5 2-1- Propionibacterium acnes………..………. 6

2-2- Corynebacterium spp……….……… 6

2-3- Micrococcus spp……… 6

2-4- Staphylococcus epidermidis………...………… 6

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES……….. 7

1- CADRE………... 8

1-1- Cadre institutionnel………... 8

1-2- Cadre technique………. 8

1-2-1- Section de biochimie………..……… 8

1-2-2- Section d’hématologie………..……….. 9

1-2-3- Section de parasitologie………..………... 9

(57)

1-2-4- Section de sérologie………... 10

1-2-5- Section de bactériologie………..…………... 10

2- MATERIEL………. 11

2-1- Matériel biologique………... 11

2-2- Milieux de culture………..………... 11

2-3- Réactifs et colorants………... 11

2-4- Appareils………... 12

2-5- Autre matériel………... 12

3- METHODES………... 12

3-1- Préparation des milieux de culture………. 12

3-2- Manipulations au laboratoire……….. 12

3-2-1- Première journée………... 12

3-2-1-1- Bouche………... 13

3-2-1-2- Cheveux………... 13

3-2-2- Deuxième journée……….. 13

3-2-2-1- Description des différents types de colonie…………. 14

3-2-2-2- Examen à l’état frais ………... 14

3-2-2-3- Examen à l’état coloré……….... 14

a)- Confection de frottis………. 14

b)- Coloration de Gram……….. 15

3-2-2-4- Analyse des résultats de la coloration de Gram……... 15

3-2-3- Troisième journée……….…. 16

3-2-3-1- Identification des bacilles à Gram négatif………... 16

3-2-3-1- Identification des cocci à Gram positif…………... 16

3-2-3-1- Identification des cocci à Gram négatif………... 16

3-2-4- Quatrième journée……….……… 16

CHAPITRE III : RESULTATS ET COMMENTAIRE……….…………. 17

1- RESULTATS………... 18

(58)

2- COMMENTAIRE……….... 26 Conclusion et suggestions………... 29

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………... 31

ANNEXE 1 : MODE OPERATOIRE DE QUELQUES TESTS………… b ANNEXE 2 : PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE………... d