CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
3- METHODES
3-1- Préparation des milieux de culture
Les milieux de culture ont été préparés selon les indications des fabricants (annexe 2).
3-2- Manipulations au laboratoire 3-2-1- Première journée
La première journée a été consacrée aux prélèvements. Ces prélèvements ont été réalisés au niveau de la bouche et des cheveux.
3-2-1-1- Bouche
- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;
- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;
- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ;
- Souffler 3 fois sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;
- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.
3-2-1-2- Cheveux
- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;
- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;
- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ; - Laver les mains à l’eau et au savon ;
- Sécher les mains à l’aide de papier essuie-mains stériles ; - Secouer les cheveux sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;
- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.
Toutes les géloses ainsi contaminées ont été incubées à 37oC pendant 24 heures.
3-2-2- Deuxième journée
Le lendemain, les milieux de culture ont été sortis de l’étuve puis examinés.
Pour les cultures positives, une description de la taille, de la couleur, de l’aspect et du contour des différents types de colonies observés a été réalisée.
Toutes les cultures positives ont ensuite fait l’objet d’un examen à l’état frais et d’un examen à l’état coloré après confection d’un frottis pour chaque type de colonie.
3-2-2-1- Description des différents types de colonie
Cette description a concerné la taille, la couleur et la forme des colonies.
3-2-2-2- Examen à l’état frais
Il a été réalisé pour chacun des types de colonies observées.
Technique
- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;
- Prélever 2 gouttes d’eau physiologique au centre de la lame ; - Sélectionner un type de colonie ;
- Prélever une partie de cette colonie et l’écraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ;
- Recouvrir la préparation d’une lamelle ;
- Observer au microscope optique à l’objectif X40.
3-2-2-3- Examen à l’état coloré a)- Confection de frottis
Technique
- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;
- Prélever une goutte d’eau physiologique au centre de la lame ; - Prendre une partie de la colonie sélectionnée ;
- Ecraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ; - Laisser sécher ;
- Fixer à la flamme.
Le frottis ainsi confectionné a été coloré au Gram.
b)- Coloration de Gram
Technique
- Recouvrir l’étalement de violet de gentiane pendant 60 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;
- Recouvrir de lugol pendant 60 secondes ; - Rincer à nouveau à l’eau de robinet ;
- Recouvrir l’étalement d’alcool à 95oC pendant 45 secondes ; - Rincer abondamment à l’eau de robinet ;
- Recouvrir de fuschine de Ziehl diluée au 1/10ème pendant 20 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;
- Laisser sécher la lame.
Le frottis ainsi coloré a été observé au microscope optique à l’objectif X100.
3-2-2-4- Analyse des résultats de la coloration de Gram
Après la coloration de Gram, seul ont été pris en compte les bacilles à Gram négatif et des cocci à Gram positif pour l’identification. Les colonies correspondantes ont été réensemencées sur des plaques de gélose Mueller Hinton en vue d’obtenir des cultures pures.
3-2-3- Troisième journée
Cette journée a été consacrée à la lecture des géloses Mueller Hinton ensemencées la veille. Un examen de Gram contrôle a été réalisé sur toutes les cultures.
3-2-3-1- Identification des bacilles à Gram négatif
Les bacilles à Gram négatif ont été identifiés par la recherche de l’oxydase (annexe 1) et par ensemencement de la galerie de Leminor. Cette galerie est constituée de la gélose Kligler-Hajna, la gélose mannitol-mobilité, la gélose au citrate de Simmons et le bouillon urée-indole.
3-2-3-2- Identification des cocci à Gram positif
La catalase, la staphylocoagulase libre et la Dnase ont été recherchées. De même, le camp test a été réalisé (annexe 1).
3-2-3-3- Identification des cocci à Gram négatif
Les cocci à Gram négatif ont été identifiés par ensemencement de la gélose chocolat plus polyvitex suivi du test à l’oxydase. En cas d’oxydase positive le test à l’hydrolyse des sucres notamment le glucose, le maltose, le fructose et le saccharose a été réalisé.
3-2-3- Quatrième journée
La lecture des tests biochimiques et des galeries a été effectuée.
CHAPITRE III
RESULTATS ET COMMENTAIRE
1- RESULTATS
Tableau II : Répartition de la population en fonction du sexe
Sexe Effectif Pourcentage
Masculin
La répartition de la population selon le sexe montre que la sex-ratio est égale à 1.
Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de leur provenance
La majorité des échantillons analysés provenait des stagiaires (90%).
Tableau IV : Répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture Résultat de la culture
Total
Deux échantillons provenant de la bouche ont montré une culture négative.
Tableau V : Répartition des échantillons en fonction des résultats du Gram
Toutes les catégories de bactérie couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.
Tableau VI : Répartition des groupes de bactéries isolés
Groupe de bactéries Effectif Pourcentage
Bacillus spp 27 48,21
Staphylococcus spp 22 39,29
Enterobacter spp 1 1,79
Citrobacter spp 1 1,79
Bg (-) non entérobactéries 5 8,93
Total 56 100
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%).
Tableau VII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons
Groupe de bactéries
Bouche Cheveux
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 12 44,44 15 55,56 27 (100%)
Staphylococcus spp 6 27,27 16 72,73 22 (100%)
Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 2 40 3 60 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les groupes de bactéries dominants se retrouvent aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.
Tableau VIII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du statut
Groupe de bactéries
Personnel Stagiaire
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 2 7,41 25 92,59 27 (100%)
Staphylococcus spp 2 9,09 20 90,91 22 (100%)
Enterobacter spp - - 1 100 1 (100%)
Citrobacter spp - - 1 100 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 3 60 2 40 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les deux grands groupes de bactéries (Bacillus spp et staphylocoques) obtenus après la culture, se sont retrouvés plus chez les stagiaires (92,59% et 90,91%) que chez le personnel.
Tableau IX : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe
Groupe de bactéries
Masculin Féminin
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 13 48,15 14 51,85 27 (100%)
Staphylococcus spp 11 50 11 50 22 (100%)
Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 2 40 3 60 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les deux grands groupes de bactéries obtenus, se sont répartis presque équitablement entre les hommes (48,15% et 50%) et les femmes (51,85% et 50%) de cette étude.
2- COMMENTAIRE
La présente étude a eu pour objectif général de détecter des sources de contamination en microbiologie. La répartition de la population selon le sexe a donné une sex-ratio égale à 1. La majorité (90%) des échantillons provenait des stagiaires. Ceci s’explique par le fait que les stagiaires étaient les plus nombreux à donner leur consentement pour prendre part à cette étude.
La répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture, a révélé que 10% (2/20) des échantillons provenant de la bouche, ont montré une culture négative. Ceci pourrait être dû au fait que certains participants n’avaient pas bien soufflé sur les boîtes de gélose. En effet, les travaux de Purnima Kumar en 2013 ont révélé 398 différentes espèces de bactéries dans la bouche [3].
Tous les échantillons provenant des cheveux contenaient des bactéries. La culture bactérienne réalisée par un groupe d’élève en 2004 [5] a montré la présence de bactéries mais aussi celle des moisissures. Cette étude confirme la diversité des bactéries portées par les cheveux. Les moisissures n’ont pas été isolées dans la présente étude. Cela pourrait s’expliquer par le fait que des milieux de culture spécifiques des moisissures n’aient pas été utilisés.
Toutes les catégories de bactéries couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%) et des bacilles à Gram négatif non entérobactéries (8,93%). Ces groupes de bactéries sont ubiquitaires. Leur isolement d’échantillons pathologiques pourrait découler d’une contamination exogène. Ces groupes de bactéries peuvent donc se retrouver à tout moment sur les milieux de culture et dans les liquides biologiques lors des manipulations si des précautions ne sont pas prises pour éviter cette contamination.
Enterobacter spp et Citrobacter spp sont des entérobactéries. Leur présence dans la bouche pourrait se justifier par le fait que la bouche fait partie intégrante du tube digestif. Des bacilles à Gram négatif non entérobactéries ont été isolés.
Leur identification n’a pas pu être réalisée par faute de moyens matériels.
La répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons, a montré que les groupes de bactéries dominants se retrouvent aussi bien dans la bouche que dans les cheveux.
Bacillus spp et les staphylocoques obtenus après la culture, ont été retrouvés beaucoup plus chez les stagiaires (92,59% et 90,91%). Cette répartition s’explique par le fait que les stagiaires représentaient 90% de la population d’étude.
La répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe, a montré que les deux grands groupes de bactéries obtenus, se sont répartis presque équitablement entre les hommes (48,15% et 50%) et les femmes (51,85% et 50%) de cette étude.
CONCLUSION ET SUGGESTIONS
La présente étude a révélé la présence d’un nombre considérable de bactéries dans la bouche et dans les cheveux. Ceci peut être une source potentielle de contamination exogène des échantillons et des milieux de culture au cours des manipulations en microbiologie. Il est donc impératif de porter lors de ces manipulations, un calot pour les hommes ou une charlotte pour les femmes et un masque bucco-nasal.
Pour terminer ce travail, nous suggérons :
- Aux autorités sanitaires à divers niveaux de sensibiliser les techniciens de laboratoire notamment ceux qui interviennent en microbiologie, sur la nécessité de couvrir les cheveux et la bouche lors des manipulations.
- A l’endroit du collectif chargé des travaux pratiques en microbiologie à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi, d’insister sur le port de calot et de masque bucco-nasal par les étudiants.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1) Agence de la santé publique du Canada. 2012. Streptococcus
salivarius, Fiches signalétiques d'agents pathogènes et appréciation du risque, consulté le 15Août 2015, disponible sur http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-salivarius-fra.php 2) Bensing, B.A., Rubens C.E., Sullam P.M. 2001. Genetic loci of
Streptococcus mitis that mediate binding to human platelets. Infect Immun.
Mar., 69(3) :1373–1380.
3) Bruggemann H., Henne A., Hoster F., Liesegang H., Wiezer A., Strittmatter A., Hujer S., Dürre P., Gottschalk G. 2004. The complete genome sequence of Propionibacterium acnes, a commensal of human skin. Science,
305(5684): 671–673.
4) Citron D. M., Poxton I. R., Baron E. J. 2007. Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, and other anaerobic gram-negative rods. In P. R.
Murray, E. J. Baron, M. L. Landry, J. H. Jorgensen & M. A. Pfaller (Eds.), Manual of Clinical Microbiology,. Washington, D.C.ASM Press. 9th ed., pp.
911-932.
5) Fey P. D., Olson M. E. 2010. Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Future Microbiology, 5 (6): 917–933.
6) Heymann D. L. 2008. Control of communicable diseases manual.
Washington, DC: American Public Health Association. 19th Edition, pp 65-85.
7) Kocur M. 2006. The genus Micrococcus. Prokaryotes, 3 : 961-971
8) Tanaka S., Yoshida M., Murakami Y. 2008. The relationship of Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens and Prevotella melaninogenica in the supragingival plaque of children, caries and oral malodor. J Clin Pediatr Dent, 32 (3): 195–200
ANNEXES
ANNEXE 1. MODE OPERATOIRE DE QUELQUES TESTS
Recherche de la catalase
Une goutte d’eau oxygénée a été déposée sur une lame de verre. Une colonie isolée a été prélevée et déposée près de la goutte. Après émulsion, le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de la catalase.
Recherche de la staphylocoagulase libre
0,25 ml de plasma de lapin reconstitué a été ajouté à 0,25ml d’une suspension bactérienne de 24h dans un tube à hémolyse. Le contenu du tube a été incubé à 37°C. La formation du coagulum commence après de 2 heures d’incubation. Lorsqu’une prise en masse du plasma est observée, la recherche de la coagulase libre est positive.
Recherche de l’oxydase
Le disque d’oxydase a été posé sur une lame porte objet. Le disque a été ensuite humidifié avec une goutte d’eau distillée. Une colonie du germe à étudier a été écrasée sur le disque mouillé. L’apparition d’une coloration violacée signe la présence d’une oxydase.
Réalisation du camp-test
- Faire une strie de Staphylococcus aureus productrice de toxine staphylococcique sur une gélose au sang de mouton ;
- Faire une strie de la souche à tester s’arrêtant à 5 mm de la strie précédente;
- Incuber 24h en aérobiose ; - Observer.
Un Camp-test positif se traduit par l'observation d'un croissant d'hémolyse franc à bords nets dans la zone d'intersection des deux stries.
ANNEXE 2. PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE
Composition de la galerie de Leminor
La galerie de Leminor ou portoir rapide est composé du milieu Kligler Hajna, du milieu mannitol mobilité, du milieu citrate de Simmons, du milieu urée indole, et de l’eau peptonnée.
Préparation de la galerie de Leminor
Gélose Kligler Hajna
- Verser 55g de poudre dans un litre d’eau distillée ; - Chauffer jusqu’à ébullition pendant 1 minute ;
- Répartir dans des tubes à vis stériles puis stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Le milieu du citrate de Simmons
- Verser 23g de poudre dans un litre d’eau distillée ; - Chauffer jusqu’à ébullition pendant 1 minute ;
- Répartir dans des tubes à vis stériles puis stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Le milieu de mannitol- mobilité
- Verser 28g de poudre dans un litre d’eau distillée ; - Chauffer jusqu’à ébullition pendant 1 minute ;
- Répartir dans des tubes à vis stériles puis stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Préparation du bouillon cœur cervelle
Ajouter 37g de poudre à un litre d’eau distillée. Bien mélanger et répartir dans des tubes à vis stériles. Stériliser pendant 15min à 121°C à l’autoclave.
Composition et préparation du milieu de culture Mueller Hinton
La gélose Mueller Hinton est composée de 2 grammes d’infusion de viande de bœuf, de 17,5 grammes de peptone de caséine, 1,5 gramme d’amidon de maïs et de 17 grammes de gélose. Le pH du milieu est de 7,3. Pour sa préparation : - Ajouter 38 g de poudre à un litre d’eau distillée;
- Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète;
- Répartir dans des flacons puis stériliser à la vapeur pendant 15 minutes
TABLE DES MATIERES
Dédicace……….……… vii
Remerciements……….….. ix
Hommages……….. xii
Liste des tableaux………... xiv
Sommaire………... xvi
Résumé et abstract………. xvii
Introduction……….... 1
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE………. 2
1- MICROFLORE ORALE………. 3
1-1- Streptococcus………. 3
1-1-1- Streptococcus mutans………..………... 3
1-1-2- Streptococcus salivarius………..……….. 4
1-1-3- Streptococcus anginosus…………..……….. 4
1-1-4- Streptococcus mitis……… 4
1-2- Actinomyces spp……… 4
1-3- Prevotella spp……… 5
1-4- Fusobacterium spp………….……… 5
2- MICROFLORE DES CHEVEUX 5 2-1- Propionibacterium acnes………..………. 6
2-2- Corynebacterium spp……….……… 6
2-3- Micrococcus spp……… 6
2-4- Staphylococcus epidermidis………...………… 6
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES……….. 7
1- CADRE………... 8
1-1- Cadre institutionnel………... 8
1-2- Cadre technique………. 8
1-2-1- Section de biochimie………..……… 8
1-2-2- Section d’hématologie………..……….. 9
1-2-3- Section de parasitologie………..………... 9
1-2-4- Section de sérologie………... 10
1-2-5- Section de bactériologie………..…………... 10
2- MATERIEL………. 11
2-1- Matériel biologique………... 11
2-2- Milieux de culture………..………... 11
2-3- Réactifs et colorants………... 11
2-4- Appareils………... 12
2-5- Autre matériel………... 12
3- METHODES………... 12
3-1- Préparation des milieux de culture………. 12
3-2- Manipulations au laboratoire……….. 12
3-2-1- Première journée………... 12
3-2-2-4- Analyse des résultats de la coloration de Gram……... 15
3-2-3- Troisième journée……….…. 16
3-2-3-1- Identification des bacilles à Gram négatif………... 16
3-2-3-1- Identification des cocci à Gram positif…………... 16
3-2-3-1- Identification des cocci à Gram négatif………... 16
3-2-4- Quatrième journée……….……… 16
CHAPITRE III : RESULTATS ET COMMENTAIRE……….…………. 17
1- RESULTATS………... 18
2- COMMENTAIRE……….... 26 Conclusion et suggestions………... 29
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………... 31
ANNEXE 1 : MODE OPERATOIRE DE QUELQUES TESTS………… b ANNEXE 2 : PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE………... d