CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
2- MICROFLORE DES CHEVEUX 5
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES……….………… 8 1- CADRE
2- MATERIEL 3- METHODES
CHAPITRE III : RESULTATS ET COMMENTAIRE……….……... 18 1- RESULTATS
2- COMMENTAIRE
Conclusion et suggestions...………... 29
Le laboratoire de microbiologie a pour rôle d’isoler et d’identifier l’agent d’infection. Pour la fiabilité des résultats, des mesures doivent être prises pour éviter toute contamination exogène lors des manipulations. La présente étude a eu pour objectif, de montrer l’importance du port d’un masque bucco-nasal et d’un calot lors des manipulations en microbiologie. Pour ce faire, 20 techniciens des laboratoires de microbiologie ont soufflé puis secoué les cheveux, chacun respectivement sur deux différentes plaques de gélose Mueller Hinton. Les géloses ainsi contaminées, ont été incubées à 37oC pendant 24 heures. Après incubation, une analyse des cultures obtenues a été réalisée et les différentes bactéries isolées ont été identifiées. Au terme de cette étude, les groupes de bactéries couramment isolés des échantillons pathologiques, ont été observés aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre de ces derniers, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%). En cas du non-respect du port d’un masque bucco-nasal et d’un calot, les échantillons et milieux de culture courent le risque d’être souillé. Il est alors nécessaire de couvrir les cheveux et la bouche lors des manipulations en microbiologie.
Mots clés : contamination en microbiologie, cheveux, bouche.
The microbiology laboratory role is to isolate and identify the agent of infection. For the reliability of the results, measures must be taken to avoid exogenous contamination during handling. The present study objective was, to show the importance of wearing an oral nasal mask and a cap during handling in microbiology. To do this, 20 technicians of microbiology laboratories have blown and then rocked the hair, each respectively on two different plates of agar Mueller Hinton. The plates thus contaminated, were incubated at 37oC for 24 hours.
After incubation, the cultures obtained were analysed and different bacteria have been identified.
At the end of this study, groups of bacteria commonly isolated from the pathological samples, were observed both at the level of mouth and hair.
Among these, Bacillus spp come to mind (48.21%), followed by staphylococci (39.29%). In case of no respect of wearing an oral nasal mask and a cap, samples and culture media run the risk of being contaminated. It is then necessary to cover hair and mouth during handling in microbiology.
Key words : contamination in microbiology, hair, mouth.
RESUME ABSTRACT
INTRODUCTION
Dans les centres de santé au Bénin, le port de calot chez les hommes et de charlotte chez les femmes est une habitude au niveau des membres du personnel de la chirurgie dans l’exercice de leur fonction. Il en est de même pour le masque bucco-nasal.
Cette attitude n’est pas toujours observée chez les biotechnologistes et particulièrement ceux qui manipulent dans les laboratoires de microbiologie. Pour la fiabilité des résultats des différents examens réalisés au laboratoire de microbiologie, il est impératif que les biotechnologistes respectent les règles de bonne conduite. Au nombre de ces règles, figure la couverture des cheveux, de la bouche et du nez.
En effet, des germes exogènes peuvent toujours se retrouver dans les échantillons biologiques ou les milieux de culture au cours des manipulations. Ces germes peuvent provenir de l’environnement de manipulation, ainsi que de la bouche ou des cheveux des manipulateurs. Les cheveux et la bouche contiennent plusieurs espèces de bactéries. La présente étude a eu pour objectif général de détecter des sources de contamination en microbiologie.
Spécifiquement, il s’est agi de :
- Détecter le risque de contamination par la bouche des échantillons biologiques et milieux de culture au cours des manipulations ;
- Déceler le risque de contamination par les cheveux des échantillons biologiques et milieux de culture au cours des manipulations.
Après avoir décrit quelques notions générales sur les microbes de la bouche et des cheveux, seront successivement exposées la méthodologie suivie, les résultats obtenus et le commentaire qui en découle. Enfin une conclusion viendra clore le travail.
CHAPITRE I
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1- MICROFLORE ORALE
La microflore orale est un système écologique complexe où près de 700 espèces de microorganismes ont été identifiées [2]. Il s’agit essentiellement des genres Streptococcus, Actinomyces, Prevotella, Fusobacterium [5]
1-1- Streptococcus
Il y a quatre principales espèces de streptocoques dans la cavité buccale. Il s’agit de Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus et Streptococcus mitis [7].
Tableau I : Distribution des streptocoques dans la cavité orale [4]
Espèces Joue Langue Salive Dents
S. mutans - - +/- ++
S. mitior +++ +++ +++ +++
S. salivarius - ++ ++ -
1-1-1- Streptococcus mutans
Streptococcus mutans est une bactérie à Gram positif qui vit dans la bouche.
Il peut prospérer à une température de 18 à 40°C. La bactérie métabolise différents types d'hydrates de carbone, créant ainsi un environnement acide dans la bouche.
C’est cet environnement qui provoque la carie dentaire. Streptococcus mutans est considéré comme le plus cariogène de l'ensemble des streptocoques oraux [6].
1-1-2- Streptococcus salivarius
Surtout retrouvées dans la salive, ce sont des bactéries anaérobies facultatives, Gram positif et de forme sphérique ou ovoïde. Streptococcus salivarius est un streptocoque α-hémolytique qui colonise l'être humain quelques heures après la naissance. La bactérie est considérée comme un pathogène opportuniste, trouvant sa place dans la circulation sanguine. Elle est aussi impliquée dans de rares cas de méningite et de bactériémie [1].
1-1-3- Streptococcus anginosus
Ces bactéries sont des cocci immobiles à Gram positif, regroupés en diplocoques et en courtes chaînes. Streptococcus anginosus est une bactérie commensale des muqueuses oropharyngées, intestinales et génitales. Il peut être responsable de suppurations profondes. Il est également impliqué dans des suppurations abdominales et des infections de la peau et des tissus mous. Il peut provoquer des infections osseuses et articulaires ainsi que des septicémies néo-natales [8].
1-1-4- Streptococcus mitis
Ce sont des bactéries commensales de la cavité buccale qui colonisent les surfaces dures telles que les tissus dentaires ainsi que les muqueuses de la flore buccale. Elles sont généralement regroupées en courtes chaînettes [2].
1-2- Actinomyces spp
Le genre Actinomyces appartient à la famille des Actinomycetaceae. Il s’agit de bacilles à Gram positif de 0,4 à 1 µm droits, incurvés ou pléomorphes.
Ils apparaissent individuellement, en paires, en grappes ou en chaînettes courtes après coloration. Les humains constituent le réservoir biologique des bactéries du genre Actinomyces [4]. Elles font partie de la flore buccale normale et sont un important constituant de la plaque dentaire [3].
1-3- Prevotella spp
Bacille à Gram négatif, il fait partie de la flore buccale et vaginale. Il est retrouvé dans les infections anaérobies des voies respiratoires. Au nombre de ces infections, on peut citer la pneumonie d'aspiration, l’abcès du poumon, l’empyème pulmonaire, l'otite moyenne et la sinusite chronique. Prevotella spp est prédominant dans les maladies et abcès parodontaux [8].
1-4- Fusobacterium spp
Le genre Fusobacterium est composé de bacilles anaérobies, Gram négatif étroits, aux extrémités effilées ou pléomorphiques. Ils ne forment pas de spores.
Ils présentent une coloration irrégulière [4].
2- MICROFLORE DES CHEVEUX
Les cheveux constituent la zone la plus contaminée du corps humain. En effet, ils sont en majorité colonisés par les bactéries de la flore résistante cutanée.
Il s’agit notamment de Propionibacterium acnes, Corynebacterium spp, Micrococcus spp, Staphylococcus epidermidis [3].
2-1- Propionibacterium acnes
Les espèces de Propionibacterium peuvent être retrouvées partout sur le corps. Propionibacterium acnes est en grande partie commensale chez les personnes adultes saines [3].
2-2- Corynebacterium spp
Les bactéries du genre Corynebacterium sont des bacilles immobiles à Gram positif disposés en palissades et en lettres V avec des extrémités souvent renflées [7].
2-3- Micrococcus spp
Une étude a montré que les microcoques constituent 1 à 20 % de la flore aérobie totale isolée de la peau de la tête, des jambes et des bras. Moins de 1 % de ces isolats correspond à des zones de haute densité bactérienne comme les aisselles ou les narines [5]. Les microcoques sont rarement isolés sur la peau d'enfants de moins d'un an[2].
2-4- Staphylococcus epidermidis
C’est une bactérie cocci à Gram positif. Elle fait partie de la flore humaine normale [3]. Bien que S. epidermidis ne soit généralement pas pathogène, les patients dont le système immunitaire est affaibli sont néanmoins à risque de développer des infections. Ces infections sont généralement acquises à l'hôpital [6]. Faisant partie de la flore normale de la peau, S. epidermidis est un contaminant fréquent des échantillons envoyés au laboratoire de diagnostic [4].
CHAPITRE II
MATERIEL ET METHODES
1- CADRE
Notre formation théorique et pratique s’est déroulée à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi pendant trois années. Quant à notre stage pratique pour la rédaction du présent rapport, il a eu lieu au Laboratoire National de Santé Publique de Cotonou.
1-1-Cadre institutionnel
L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi est une institution sise à l’Université d’Abomey-Calavi. Elle offre des programmes de formation en licence professionnelle dans les domaines de Génie Biologique et de Génie Civil.
1-2-Cadre technique
Le Laboratoire National de Santé Publique est situé dans l’enceinte du Ministère de la Santé. Il s’occupe, entre autres, de développer « des méthodes d’analyses biologiques, d’organiser toutes les enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en général et des maladies transmissibles en particulier et d’assurer l’organisation des stages pratiques des élèves et étudiants en provenance des structures agrées de formation.
Le Laboratoire National de Santé Publique est pluridisciplinaire et comporte les sections suivantes : la biochimie, l’hématologie, la parasitologie, la sérologie et la bactériologie.
1-2-1- Section de biochimie
Dans cette section les paramètres dosés sont : - la glycémie ;
- l’urée ; - la créatine ;
- l’acide urique ;
- l’ionogramme sanguin.
1-2-2- Section d’hématologie Les examens réalisés sont :
- la numération formule sanguine ; - la numération des leucocytes ; - le temps de saignement ; - le temps de coagulation ; - le temps de la prothrombine ; - le temps de la céphaline kinase ; - la vitesse de sédimentation ;
- le groupage sanguin et facteur Rhésus ; - l’électrophorèse de l’hémoglobine.
1-2-3- Section de parasitologie
La parasitologie s’occupe des examens suivants : - la goutte épaisse ;
- le frottis sanguin ;
- la coprologie complète ; - l’acétonurie et l’albuminurie ; - la glucosurie ;
- les protéines de 24 heures.
1-2-4- Section de sérologie
Tous les examens de cette section se réalisent avec le sérum. Ce sont:
- le sérodiagnostic de Widal ; - la sérologie HIV ;
- TPHA et VDRL ; - le TBG sérique ; - le TBG urinaire ;
- la recherche des anticorps antistreptolysine O ; - la recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B ; - la recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C ; - la recherche de la protéine C réactive ;
- la recherche des IgM et IgG anti-toxoplasmiques ; - la recherche des IgG anti-Chlamydia trachomatis ; - la recherche des IgM anti-rougeoleuses ;
- la recherche des IgM anti-rubéoleuses ; - la recherche des IgM anti-amaril.
1-2-5- Section de bactériologie
Les examens effectués au niveau de la paillasse de cette section sont : - examen cytobactériologique des urines avec antibiogramme ; - examen cytobactériologique des sécrétions cervico-vaginales ; - examen cytobactériologique des sécrétions urétrales ;
- examen cytobactériologique des pus ;
- examen cytobactériologique du liquide céphalo-rachidien ; - coproculture.
2- MATERIEL
2-1- Matériel biologique
Le matériel biologique a été constitué de 40 échantillons provenant de la bouche et des cheveux des stagiaires et du personnel de la section de Bactériologie du Laboratoire National de Santé Publique.
2-2- Milieux de culture
- Gélose Mueller Hinton ; - Bouillon cœur cervelle ; - Gélose Kligler Hajna ; - Gélose mannitol-mobilité ; - Gélose au citrate de Simmons ; - Bouillon urée-indole.
2-3- Réactifs et colorants - Violet de gentiane ; - Lugol ;
- Alcool à 95 °C ;
- Fuschine de ziehl diluée au 1/10e ; - Réactif de Kovacs;
- Plasma lyophilisé de lapin.
2-4- Appareils
- Etuve DIN 12880 ;
- Microscope optique Olympus CX 31 ; - Autoclave Thermoscientific Varioklav ; - Centrifugeuse Nüvefuge CN 180 ; - Four poupinel Titanox ;
- Réfrigérateur Kirsch ;
- Balance de précision Kern 440-47N.
2-5- Autre matériel
- Tubes à hémolyse ;
- Lames de verre porte-objet ; - Lamelles de verre couvre-objet ; - Anse de platine ;
- Pipettes Pasteur stériles ;
- Boîtes de Pétri stériles à usage unique.
3- METHODES
3-1- Préparation des milieux de culture
Les milieux de culture ont été préparés selon les indications des fabricants (annexe 2).
3-2- Manipulations au laboratoire 3-2-1- Première journée
La première journée a été consacrée aux prélèvements. Ces prélèvements ont été réalisés au niveau de la bouche et des cheveux.
3-2-1-1- Bouche
- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;
- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;
- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ;
- Souffler 3 fois sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;
- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.
3-2-1-2- Cheveux
- Allumer le bec bunsen environ 10 minutes avant ;
- Déposer la boîte de Pétri contenant la plaque de gélose Mueller Hinton à proximité de la flamme du bec bunsen ;
- Retirer le couvercle de la boîte de Pétri ; - Laver les mains à l’eau et au savon ;
- Sécher les mains à l’aide de papier essuie-mains stériles ; - Secouer les cheveux sur la plaque de gélose Mueller Hinton ;
- Remettre aussitôt le couvercle de la boîte de gélose Mueller Hinton ; - Laisser la gélose pendant 15 minutes sur la paillasse.
Toutes les géloses ainsi contaminées ont été incubées à 37oC pendant 24 heures.
3-2-2- Deuxième journée
Le lendemain, les milieux de culture ont été sortis de l’étuve puis examinés.
Pour les cultures positives, une description de la taille, de la couleur, de l’aspect et du contour des différents types de colonies observés a été réalisée.
Toutes les cultures positives ont ensuite fait l’objet d’un examen à l’état frais et d’un examen à l’état coloré après confection d’un frottis pour chaque type de colonie.
3-2-2-1- Description des différents types de colonie
Cette description a concerné la taille, la couleur et la forme des colonies.
3-2-2-2- Examen à l’état frais
Il a été réalisé pour chacun des types de colonies observées.
Technique
- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;
- Prélever 2 gouttes d’eau physiologique au centre de la lame ; - Sélectionner un type de colonie ;
- Prélever une partie de cette colonie et l’écraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ;
- Recouvrir la préparation d’une lamelle ;
- Observer au microscope optique à l’objectif X40.
3-2-2-3- Examen à l’état coloré a)- Confection de frottis
Technique
- Prendre une lame propre et identifier ; - Flamber la lame ;
- Prélever une goutte d’eau physiologique au centre de la lame ; - Prendre une partie de la colonie sélectionnée ;
- Ecraser près de l’eau physiologique ; - Réaliser un mélange homogène ; - Laisser sécher ;
- Fixer à la flamme.
Le frottis ainsi confectionné a été coloré au Gram.
b)- Coloration de Gram
Technique
- Recouvrir l’étalement de violet de gentiane pendant 60 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;
- Recouvrir de lugol pendant 60 secondes ; - Rincer à nouveau à l’eau de robinet ;
- Recouvrir l’étalement d’alcool à 95oC pendant 45 secondes ; - Rincer abondamment à l’eau de robinet ;
- Recouvrir de fuschine de Ziehl diluée au 1/10ème pendant 20 secondes ; - Rincer à l’eau de robinet ;
- Laisser sécher la lame.
Le frottis ainsi coloré a été observé au microscope optique à l’objectif X100.
3-2-2-4- Analyse des résultats de la coloration de Gram
Après la coloration de Gram, seul ont été pris en compte les bacilles à Gram négatif et des cocci à Gram positif pour l’identification. Les colonies correspondantes ont été réensemencées sur des plaques de gélose Mueller Hinton en vue d’obtenir des cultures pures.
3-2-3- Troisième journée
Cette journée a été consacrée à la lecture des géloses Mueller Hinton ensemencées la veille. Un examen de Gram contrôle a été réalisé sur toutes les cultures.
3-2-3-1- Identification des bacilles à Gram négatif
Les bacilles à Gram négatif ont été identifiés par la recherche de l’oxydase (annexe 1) et par ensemencement de la galerie de Leminor. Cette galerie est constituée de la gélose Kligler-Hajna, la gélose mannitol-mobilité, la gélose au citrate de Simmons et le bouillon urée-indole.
3-2-3-2- Identification des cocci à Gram positif
La catalase, la staphylocoagulase libre et la Dnase ont été recherchées. De même, le camp test a été réalisé (annexe 1).
3-2-3-3- Identification des cocci à Gram négatif
Les cocci à Gram négatif ont été identifiés par ensemencement de la gélose chocolat plus polyvitex suivi du test à l’oxydase. En cas d’oxydase positive le test à l’hydrolyse des sucres notamment le glucose, le maltose, le fructose et le saccharose a été réalisé.
3-2-3- Quatrième journée
La lecture des tests biochimiques et des galeries a été effectuée.
CHAPITRE III
RESULTATS ET COMMENTAIRE
1- RESULTATS
Tableau II : Répartition de la population en fonction du sexe
Sexe Effectif Pourcentage
Masculin
La répartition de la population selon le sexe montre que la sex-ratio est égale à 1.
Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de leur provenance
La majorité des échantillons analysés provenait des stagiaires (90%).
Tableau IV : Répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture Résultat de la culture
Total
Deux échantillons provenant de la bouche ont montré une culture négative.
Tableau V : Répartition des échantillons en fonction des résultats du Gram
Toutes les catégories de bactérie couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.
Tableau VI : Répartition des groupes de bactéries isolés
Groupe de bactéries Effectif Pourcentage
Bacillus spp 27 48,21
Staphylococcus spp 22 39,29
Enterobacter spp 1 1,79
Citrobacter spp 1 1,79
Bg (-) non entérobactéries 5 8,93
Total 56 100
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%).
Tableau VII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction des échantillons
Groupe de bactéries
Bouche Cheveux
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 12 44,44 15 55,56 27 (100%)
Staphylococcus spp 6 27,27 16 72,73 22 (100%)
Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 2 40 3 60 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les groupes de bactéries dominants se retrouvent aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux.
Tableau VIII : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du statut
Groupe de bactéries
Personnel Stagiaire
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 2 7,41 25 92,59 27 (100%)
Staphylococcus spp 2 9,09 20 90,91 22 (100%)
Enterobacter spp - - 1 100 1 (100%)
Citrobacter spp - - 1 100 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 3 60 2 40 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les deux grands groupes de bactéries (Bacillus spp et staphylocoques) obtenus après la culture, se sont retrouvés plus chez les stagiaires (92,59% et 90,91%) que chez le personnel.
Tableau IX : Répartition des groupes de bactéries isolés en fonction du sexe
Groupe de bactéries
Masculin Féminin
Total
Nb % Nb %
Bacillus spp 13 48,15 14 51,85 27 (100%)
Staphylococcus spp 11 50 11 50 22 (100%)
Enterobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Citrobacter spp 1 100 - - 1 (100%)
Bg (-) non entérobactéries 2 40 3 60 5 (100%)
Bg (-) : Bacilles à Gram négatif
Les deux grands groupes de bactéries obtenus, se sont répartis presque équitablement entre les hommes (48,15% et 50%) et les femmes (51,85% et 50%) de cette étude.
2- COMMENTAIRE
La présente étude a eu pour objectif général de détecter des sources de contamination en microbiologie. La répartition de la population selon le sexe a donné une sex-ratio égale à 1. La majorité (90%) des échantillons provenait des stagiaires. Ceci s’explique par le fait que les stagiaires étaient les plus nombreux à donner leur consentement pour prendre part à cette étude.
La répartition des échantillons en fonction du résultat de la culture, a révélé que 10% (2/20) des échantillons provenant de la bouche, ont montré une culture négative. Ceci pourrait être dû au fait que certains participants n’avaient pas bien soufflé sur les boîtes de gélose. En effet, les travaux de Purnima Kumar en 2013 ont révélé 398 différentes espèces de bactéries dans la bouche [3].
Tous les échantillons provenant des cheveux contenaient des bactéries. La culture bactérienne réalisée par un groupe d’élève en 2004 [5] a montré la présence de bactéries mais aussi celle des moisissures. Cette étude confirme la diversité des bactéries portées par les cheveux. Les moisissures n’ont pas été isolées dans la présente étude. Cela pourrait s’expliquer par le fait que des milieux de culture spécifiques des moisissures n’aient pas été utilisés.
Toutes les catégories de bactéries couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%) et des bacilles à Gram négatif non
Toutes les catégories de bactéries couramment isolées des échantillons pathologiques ont été observées aussi bien au niveau de la bouche que des cheveux. Au nombre des groupes de bactéries isolés, Bacillus spp vient en tête (48,21%), suivis des staphylocoques (39,29%) et des bacilles à Gram négatif non