Les outils de la biologie moléculaire

Mise au point et développement d'outils et de méthodes

ongtemps, l’étude des stations d’épuration s’est limitée au suivi des données physico- chimiques en entrée et en sortie de l’installa- tion, considérant le bassin biologique comme

« une boîte noire » où avaient lieu des réac- tions chimiques mal comprises, réalisées par des micro-organismes non identifiés. La microbiologie des boues activées a permis de lever de nombreuses zones d’ombre sur la nature des réactions existant dans le bassin biologique et le rôle des micro-organismes présents. Avec l’arrivée de la biologie moléculaire, de nouvelles informations capitales ont été apportées, notamment sur la relation identité/fonction des micro- organismes, améliorant encore notre connaissance des mécanismes de dépollution mis en jeu au sein des sta- tions d’épuration.

Pour caractériser l’aptitude des boues activées à traiter un type de polluant, le microbiologiste doit répondre à plu- sieurs questions dont les principales sont : qui, combien, comment � Les méthodes de microbiologie tradition- � Les méthodes de microbiologie tradition-� Les méthodes de microbiologie tradition- nelles, dites pasteuriennes, ne répondent que très impar- faitement à ces questions. L’identification et le dénom- brement des micro-organismes se font par microscopie sur des critères morphologiques ou de coloration, ou encore par tests biochimiques après isolement et culture sur boîtes de Petri ou en milieux liquides. Or, la très grande majorité des micro-organismes est incultivable sur ces milieux car les facteurs nécessaires à leur crois- sance restent inconnus. De plus, ces méthodes requièrent l’isolement du micro-organisme de son milieu naturel et de sa communauté, ce qui biaise forcément l’évaluation de ses activités.

Les méthodes moléculaires, en s’affranchissant de la mise en culture, réduisent énormément les biais des méthodes

Les outils de la biologie moléculaire

pour l’analyse microbiologique des boues activées

La biologie moléculaire est devenue incontournable dans l’étude des processus biologiques impliqués dans le traitement des eaux résiduaires. Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour caractériser les populations microbiennes des boues activées, apportant des informations essentielles à la compréhension et à l’optimisation du fonctionnement des stations d’épuration.

pasteuriennes. Elles permettent de caractériser les micro- organismes d’un échantillon, qu’ils soient cultivables ou non, dans leur environnement naturel (Huybens et al., 2009). Ces techniques utilisent des séquences¹ d’ADN² spécifiques des micro-organismes cibles afin de les identifier et de les dénombrer. Selon que la séquence ciblée est choisie dans une région très conservée³ des

L ^➊

^Lexique

encadré ➋).

2. ADN : acide désoxyribonucléique (voir encadré ➋).

3. Régions conservées : séquences d’ADN identiques retrouvées chez tous les micro-organismes, par oppo- sition aux régions variables.

4. Flocs : agglomérats constitués de bactéries et de particules organiques et inorganiques.

5. Sondes : petits fragments d’ADN de quelques nucléo- tides, marqués à une extrémité par un fluorophore (molécule fluorescente).

6. Ribosomes : organites intracellulaires permettant la synthèse des protéines.

7. ARNr : acide ribonucléique constituant des ribosomes.

8. Phylogénétique : se rapporte à la classification des êtres vivants avec pour objectif de rendre compte des degrés de parenté entre les espèces et donc de leur his- toire évolutive (ou phylogénie).

9. Electrophorèse : méthode d’analyse qui consiste à séparer des molécules chargées (ADN) en présence d’un champ électrique.

10. Amorces : petits fragments d’ADN de quelques nucléotides, utilisés par paire et dont les séquences sont complémentaires de celles encadrant le fragment d’ADN à amplifier par PCR.

11. Agents intercalants : molécules fl uorescentes s’in- : molécules fl uorescentes s’in-: molécules fluorescentes s’in- sérant entre les bases de l’ADN.

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présents et visualiser leur morphologie ainsi que leur répartition spatiale au sein des flocs. La puissance de cette technique réside dans sa simplicité et sa rapidité de réalisation (quelques heures). Son prin- cipe repose sur l’utilisation de sondes⁵ fluorescentes gènes marqueurs, ou au contraire dans une région très

variable, il sera mis en évidence des groupes microbiens très divers, ou bien des micro-organismes très ciblés (espèce ou sous-espèce bactérienne). D’un point de vue pratique, seule une centaine de millilitres de boue activée est nécessaire à la réalisation de dizaines, voire de cen- taines d’analyses moléculaires. Ces techniques sont donc particulièrement puissantes dès lors que la représentati- vité de l’échantillonnage est bien assurée.

Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour caractériser les populations micro- biennes des boues activées (identification, biodiversité, quantification) en détaillant leurs principes et en donnant quelques exemples d’application en épuration des eaux résiduaires (tableau ➊).

Détection et identification

des micro-organismes en microscopie

En microscopie classique, il est possible d’étudier la struc- ture des flocs⁴ (taille, morphologie), mais il est très diffi- cile d’identifier les différents micro-organismes présents.

Des colorations (Gram, Neisser) permettent d’identifier quelques grands groupes de bactéries, mais déstructurent complètement l’organisation du floc.

La technique FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), qui combine biologie moléculaire et microscopie, présente l’avantage considérable de pouvoir à la fois identifier de manière fiable les micro-organismes

La couleur jaune est due à la colocalisation des deux marquages.

Technique Principe Objectif Exemple d’application Avantages Inconvénients

FISH Marquage

fluorescent de l'ARNr

Identification moléculaire et répartition spatiale des micro-organismes

Identification des bactéries filamenteuses

Rapide Possibilité de multiplexage

Microscope à épifluorescence

(coût)

PCR

Copie d’un fragment

d’ADN cible in vitro

Amplification de l’ADN

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Rapide Grand nombre d’échantillons

traités

Réaction pouvant être inhibée par des impuretés dans

les extraits d’ADN

DGGE Électrophorèse en gradient de dénaturant

Étude de la biodiversité des micro-organismes

(possibilité d’identification ultérieure des espèces

dominantes)

Comparaison de différents types de stations

d’épuration Impact de conditions particulières sur

les micro- organismes

Grand nombre d’échantillons

traités

Lourdeur des expérimentations

qPCR Amplification quantitative

de l’ADN

Quantification des micro-organismes

Rapide Plusieurs méthodes de détection

disponibles

Seuil de quantification souvent limité aux populations présentes à plus de 10² cellules/mL de boues

Séquençage Lecture de l’information

génétique

Identification moléculaire des micro-

organismes

Inventaire moléculaire de tous les micro-

organismes présents et/ou de leurs fonctions

associées

Approche exhaustive

Lourdeur des expérimentations

et de l’analyse des données

Coût élevé

1 Principes, objectifs et applications de quelques techniques de biologie moléculaire.

Mise au point et développement

d'outils et de méthodes Les outils de la biologie moléculaire

pour l’analyse microbiologique des boues activées

En routine, le FISH se révèle très utile pour identifier rapi- dement et simplement les bactéries filamenteuses, qui peuvent être responsables de dysfonctionnements bio- logiques en stations d’épuration (foisonnement des boues et/ou moussage). En effet, les techniques classiques de coloration ne permettent pas toujours de le faire avec certitude (variabilité des colorations, expérience de l’observateur). Il est alors possible de mettre en place sur site des solutions préventives ou curatives adaptées à la bactérie incriminée.

Étude de la biodiversité microbienne

La technique FISH ne permettant de visualiser simulta- nément qu’un nombre limité d’espèces différentes sur un même échantillon, les études de diversité microbienne font généralement appel à d’autres techniques appe- lées « techniques de typage moléculaire ». Dans cette approche, les cellules sont lysées, leur ADN est purifié et les gènes d’intérêt sont amplifiés par PCR (encadré ➌).

Le plus souvent, les gènes ciblés codent pour des ARNr microbiens et permettent une identification phylogéné- tique⁸ des espèces. Il peut aussi s’agir de gènes dits « de fonction », codant pour des enzymes importantes pour les réactions biochimiques de dépollution comme celles intervenant dans la nitrification ou la dénitrification. Les produits de PCR obtenus sont ensuite séparés par élec- trophorèse⁹ dans une matrice de polymères.

Une de ces techniques, la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), est un procédé d’électrophorèse sur gradient de dénaturants chimiques qui permet d’observer les différences de mobilité de fragments d’ADN de même taille, mais de séquence différente. Sous l’effet d’un champ électrique, les produits de PCR migrent dans le gel et rencontrent des concentrations en dénaturants de plus en plus importantes, entraînant la dénaturation pro- gressive de leurs brins d’ADN selon leur composition en bases GC et AT (encadré ➋). L’abondance des bandes sur le profil électrophorétique obtenu reflète la biodiversité de la communauté pour les micro-organismes considé- rés, chaque bande correspondant au moins à une espèce cible (figure ➋). En découpant les bandes sur le gel et en réamplifiant par PCR l’ADN qu’elles contiennent, il est également possible de connaître l’identité du micro- organisme correspondant après séquençage.

(cf tableau ➊ et partie « séquençage »). La DGGE reste lourde à mettre en œuvre car elle nécessite au moins deux jours de manipulations, depuis l’extraction d’ADN jusqu’à la révélation des fragments d’ADN du gel sous illumination UV. De plus, l’identification des espèces est longue car elle fait appel aux techniques de séquençage décrites ci-dessous. En revanche, elle présente l’avantage de pouvoir visualiser jusqu’à une trentaine d’espèces en une seule fois et peut être mise en œuvre sur plusieurs dizaines d’échantillons en parallèle.

La biodiversité des bactéries nitrifiantes, qui assurent la transformation de l’ammoniaque en nitrates au sein du bassin biologique, est très étudiée. Cette technique a permis de montrer que des espèces nitrifiantes diffé- rentes se développaient dans les stations d'épuration des complémentaires de séquences spécifiques de l’ARN

des ribosomes⁶ (ARNr⁷) des cellules ciblées. Après traitement chimique de la membrane des cellules, les sondes vont pouvoir y entrer et se fixer sur leurs cibles.

La fluorescence émise est alors observable avec un microscope dit « à épifluorescence » (figure ➊). Il est possible d’utiliser plusieurs sondes simultanément sur un même échantillon, marquées avec des fluorophores différents (multiplexage). Pour identifier un micro- organisme, il est toutefois nécessaire qu’une sonde spé- cifique existe, ce qui n’est pas toujours le cas, même si plus de 2500 sondes ont été développées à ce jour (http://www.microbial-ecology.net/probebase/).

Grâce à cette technique, il a été mis en évidence que les AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria) et les NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria), bactéries réalisant respec- tivement la première et la deuxième étape de la nitrifi- cation, étaient spatialement proches dans le floc, ren- dant les produits de la première réaction rapidement utilisables comme substrats pour la seconde (Mobarry et al., 1996).

➋ Pour en savoir plus sur l’adn

L’ADN, support de l’information génétique, est constitué de deux brins contenant chacun plusieurs milliards de nucléotides. Chaque nucléotide est constitué : d’un acide phosphorique, d’un sucre (le désoxyribose), et d’une base azotée qui peut être l’adénine (A), la guanine (G), la thymine (T) ou la cytosine (C). La molécule d’ADN adopte une structure en double hélice ; les deux brins sont reliés entre eux par des liaisons établies entre bases azotées dites « com- plémentaires » : l’adénine d’un brin est reliée à la thymine de l’autre brin par deux liaisons, la guanine d’un brin est reliée à la cytosine de l’autre brin par trois liaisons.

2

Gel DGGE montrant la stabilité de la biodiversité des bactéries nitrosantes (AOB) d’une station d’épuration sur plusieurs semaines.

Chaque colonne correspond à un profil, soit un prélèvement. Chaque bande d’ADN (en noir) correspond à au moins une espèce de bactérie nitrosante.

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données. Il est utilisé pour réaliser l’inventaire des espèces ou des fonctions potentielles d’un écosystème comme les boues activées par exemple.

Le séquençage selon la méthode originale de Sanger a été mis au point dans les années 1970. Ce fut une révo- lution dans le domaine de l’identification des micro- organismes. Cependant, la limitation de cette technique tenait principalement à sa faible capacité de lecture et à sa lenteur : il aurait fallu en effet plusieurs dizaines d’années à un séquenceur fonctionnant jour et nuit pour décrypter les millions de bases d’un génome bactérien.

Aussi, le nombre de séquences analysables n’était que de quelques centaines et les inventaires réalisés sur des boues activées ne permettaient d’observer que les espèces présentes à plus de 10⁸ cellules par millilitre, c’est-à-dire représentant quantitativement moins de 1 % de la communauté. Avec cette approche, les bactéries nitrifiantes, présentes souvent à des concentrations eaux usées urbaines et industrielles, en fonction princi-

palement de la concentration en ammonium de l’influent (Kreuzinger et al., 2003).

En routine, la DGGE peut être utilisée, par exemple, pour évaluer l’impact de conditions de fonctionnement particulières d’une station d’épuration sur une communauté microbienne donnée. Les bactéries nitro-. Les bactéries nitro- santes (AOB) étant très sensibles aux conditions environ- nementales (température, variation de charge, toxique), la nitrification peut être facilement impactée et les niveaux de rejet en sortie de station non respectés.

Inventaire des micro-organismes présents dans les boues

Le séquençage permet, à partir d’une séquence cible d’ADN, de retrouver l’identité du micro-organisme correspondant après comparaison avec une base de

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Principe de la PCR. Un seul brin d’ADN est représenté pour l’étape d’élongation.

La réaction PCR consiste en une succession de réactions chimiques appelées « cycles », chacun contenant trois étapes (figure ➌) : la dissociation des brins d’ADN (à 95 °C) ; l’hybridation spécifique des amorces¹⁰ aux deux extrémités de la séquence à amplifier (entre 50 et 60 °C) ; l’élongation des brins d’ADN à partir de chaque amorce grâce à l’action de l’ADN polymérase (à 72 °C). Cet enzyme va synthétiser de nouveaux brins d’ADN en assemblant les nucléotides par complémentarité avec les brins d’ADN matrice.

Le nombre de copies de l’ADN cible est doublé à chaque cycle. Au bout de trente cycles, on obtient donc théoriquement 2³⁰ copies du fragment d’intérêt, soit plusieurs milliards.

Mise au point et développement d'outils et de méthodes

seule plaque de séquençage (de moins d’1 cm²), ou d’avoir accès à leur activité métabolique à un instant donné.

Quantification des micro-organismes

Pour améliorer la compréhension des procédés, les don- nées obtenues à l’aide des outils moléculaires doivent être quantitatives. L’outil le plus utilisé aujourd’hui est la PCR en temps réel (qPCR), technique précise, rapide, et facilement automatisable. Le principe est le même que celui d’une PCR classique (encadré ➌), à la différence que l’amplification du fragment d’ADN est mesurée en continu à l’aide d’agents intercalants¹¹ de l’ADN double brin ou de sondes fluorescentes. Cette méthode nécessite la réalisation d’une gamme étalon à l’aide de solutions d’ADN cible de concentrations connues. Le nombre de copies d’ADN cible étant doublé à chaque cycle, la fluorescence augmente de la même façon. Le logi- ciel détermine alors pour chaque échantillon un « seuil de 10⁶ à 10⁸ cellules par millilitre de boues activées,

n’étaient pas détectées.

Depuis 2005, avec le séquençage haut-débit dit « de nouvelle génération », la même opération est doré- », la même opération est doré-, la même opération est doré- navant réalisée en quelques heures seulement et le nombre de séquences obtenues s’élève à plusieurs mil- lions. Toutefois, le traitement du grand nombre de don- nées générées est lourd, il nécessite des connaissances approfondies en bioinformatique et plusieurs jours d’analyse.

Cette technique a permis de grandes avancées dans la connaissance phylogénétique des bactéries filamen- teuses. On s’est en effet rendu compte que des bacté- ries très proches morphologiquement étaient en fait très éloignées phylogénétiquement et avaient des fonctions et activités différentes (Wagner et Cloete, 2002).

L’apport de cette technique est capital : il est désormais possible d’inventorier les différents micro-organismes présents dans un échantillon de boues activées sur une

Les outils de la biologie moléculaire

pour l’analyse microbiologique des boues activées

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Quantification des bactéries filamenteuses du type

en qPCR.

En haut, détermination des valeurs de Cq. En bas, comparaison des valeurs de Cq des échantillons (X, en bleu) à celles de la gamme étalon (O, en vert).

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progrès sont très rapides et ces techniques en constante évolution, devenant au fil des années plus rapides, plus efficaces et moins coûteuses. De plus, la plupart des tech- niques utilisées aujourd’hui peuvent être automatisées pour traiter rapidement un grand nombre d’échantillons.

Cependant, la microbiologie des boues activées reste un domaine où de grandes inconnues subsistent, à cause de la complexité de ce milieu, tant au niveau des processus biologiques que des micro-organismes impliqués.

Aujourd’hui, le couplage systématique des méthodes de microbiologie moléculaire à celles du génie des procédés permet toutefois de mieux comprendre et optimiser les procédés de traitement des eaux résiduaires. n

de quantification » (Cq), correspondant au nombre de cycles pour lequel la fluorescence devient significati- vement différente du bruit de fond. Comparée à celles de la gamme étalon, la valeur de Cq permet d’estimer la quantité d’ADN cible de l’échantillon correspondant (figure ➍). Le nombre de micro-organismes d’intérêt peut ensuite être déduit en connaissant le nombre moyen de copies du gène ciblé par cellule (www.mmg.msu.edu).

Cette technique a permis de quantifier dans les boues activées des micro-organismes appelés AOA (Ammonium Oxidizing Archaea), archées capables de réaliser la première étape de la nitrification (Park et al., 2006). Développée à l’origine pour quantifier les séquences d’ADN et dénombrer ainsi les micro- organismes, cette technique est actuellement adaptée à la quantification des ARN afin de quantifier l’ex- pression de gènes d’intérêt et approcher l’activité des micro-organismes.

En routine, la qPCR peut être utilisée, par exemple, pour suivre l’impact d’un traitement curatif (chloration, sels métalliques) sur la quantité de bactéries filamenteuses pré- sentes dans les boues activées, et de pouvoir ainsi conclure sur son efficacité ou bien adapter le dosage sur site.

Conclusion

La liste de méthodes présentée ici est loin d’être exhaus- tive. De nombreuses autres techniques moléculaires sont utiles à l’analyse microbiologique des boues activées. Les

HUYBENS, N., MAINIL, J., MARLIER, D., 2009, Les techniques de biologie moléculaire d’analyse des populations bactériennes complexes, Annales de Médecine Vétérinaire., n° 153, p. 112-128.

KREUZINGER, N., FARNLEITNER, A., WANDL, G., HORNEK, R., MACH, R., 2003, Molecular biological methods (DGGE) as a tool to investigate nitrification inhibition in wastewater treatment, Water Science and Technology, n° 47, p. 165-172.

MOBARRY, B.K., WAGNER, M., URBAIN, V., RITTMANN, B.E., STAHL, D.A., 1996, phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria, Appl. Environ. Microbiol., 62(6), p. 2156-2162.

PARK, H.D., WELLS, G.F., BAE, H., CRIDDLE, C.S., FRANCIS, C.A., 2006, Occurrence of ammonia-oxidizing archaea in wastewater treatment plant bioreactors, Appl. Environ. Microbiol., 72(8), p. 5643-7.

WAGNER, A.M., CLOETE, E.T., 2002, 16S rRNA sequence analysis of bacteria present in foaming activated sludge, Systematic and Applied Microbiology, 25(3), p. 434-439.

Quelques références clés...

Consulter l’ensemble des références sur le site de la revue www.set-revue.fr Lauriane JUZAN et Jean-Jacques PERNELLE

Irstea, UR HBAN, Hydrosystèmes et bioprocédés, 1 rue Pierre-Gilles de Gennes, CS 10030, 92761 Antony Cedex

 lauriane.juzan@irstea.fr

 jean-jacques.pernelle@irstea.fr Patrick DABERT

Irstea, UR GERE,

Gestion environnementale et traitement biologique des déchets, 17 avenue de Cucillé, CS 64427,

35044 Rennes Cedex

 patrick.dabert@irstea.fr

Les auteurs