Les outils pour décrire la biodiversité
I. La biodiversité
Le terme « biodiversité », association des 2 mots « biologie » et « diversité », est un terme relativement récent. En effet, apparu au début des années 80 dans le monde scientifique, il sera publié pour la première fois dans une revue scientifique en 1988 par Edward O. Wilson, lorsque celui-‐ci réalise le compte-‐rendu de la XVIIIème assemblée générale de l’Union Internationale de Conservation de la Nature qui se déroule à Costa-‐Rica (UICN, aujourd’hui devenue l’Union Mondiale pour la Nature).
Cette assemblée donne d’ailleurs la première définition officielle de la biodiversité :
« La diversité biologique, ou biodiversité, est la variété et la variabilité de tous les organismes vivants. Ceci inclut la variabilité génétique à l’intérieur des espèces et de leurs populations, la variabilité des espèces et de leurs formes de vie, la diversité des complexes
d’espèces associées et de leurs interactions, et celles des processus écologiques qu’ils influencent ou dont ils sont les acteurs. »
La biodiversité est donc détaillée en 3 niveaux :
• La diversité génétique : elle correspond à la diversité des gènes au sein d’une même espèce (=diversité intraspécifique)
• La diversité spécifique ou taxinomique : elle correspond à la diversité des différentes espèces (=diversité interspécifique)
• La diversité écosystémique : elle correspond à la diversité des écosystèmes existants.
Pour mieux comprendre et décrire notre planète, il est donc nécessaire de décrire cette biodiversité, mais cela n’est pas toujours aisé. En effet, la nature est en constante évolution, et l’on n’a décrit qu’une petite partie des espèces (avec 16000 à 17000 nouvelles espèces décrites par année, on estime connaître environ 2,5millions d’espèces, alors qu’il y en aurait plus de 10 millions sur notre planète).
Pour la décrire, les méthodes d’échantillonnage ont été les premières utilisées, mais elles sont aujourd’hui délaissées au profit des méthodes moléculaires, beaucoup plus précises grâce aux avancées technologiques.
II. Les techniques moléculaires
A. Les différents types de génomes
Bien que chez les Eucaryotes, la majeure partie de l’ADN soit présente dans le noyau, une partie de cet ADN est située dans les mitochondries des animaux, des plantes et des champignons, ainsi que dans les chloroplastes des plantes.
1. L’ADN nucléaire (ADNn)
L'ADNn est localisé dans le noyau des cellules eucaryotes sous forme de chromosomes. Il est hérité pour moitié du père et pour l'autre moitié de la mère, et détermine le sexe des individus puisqu'il contient les chromosomes sexuels.
Figure 1 : L’ADN situé dans les noyaux de chaque cellule, composé d’un enchaînement de nucléotides.
L’ADNn a une taille beaucoup plus importante que les autres types d'ADN. A titre d’exemple, l'ADNn humain contient plus de 3,4 milliards de paires de base (pb), alors que l'ADNmt n'en contient qu'environ 16 000.
2. L’ADN mitochondrial (ADNmt)
On trouve environ 100 à 1000 mitochondries par cellule. Ces mitochondries sont le siège des processus biochimiques qui fournissent l’énergie dont la cellule a besoin.
L’ADN mitochondrial (ADNmt) est situé à l’intérieur de la mitochondrie, dans une région appelée matrice.
Figure 2 : molécules d’ADNmt dans une cellule en cours de croissance d’Euglena gracilis
L'ADNmt est caractérisé par une transmission exclusivement maternelle. En effet, lors de la fécondation d’un ovule par un spermatozoïde, ce dernier n’apporte qu’un nombre modeste de mitochondries, en comparaison aux milliers de mitochondries présentes dans l’ovule. Il se pourrait également qu’il existe des mécanismes d’élimination des mitochondries paternelles éventuellement survivantes, mais rien n’est encore prouvé.
Lors de la mitose, chaque cellule fille reçoit approximativement le même nombre de mitochondries, mais cette répartition n’est pas toujours exacte. D’autre part, chaque mitochondrie contient de multiples molécules d’ADNmt.
Ainsi, la quantité totale d’ADNmt dans une cellule dépend :
• du nombre de mitochondries
• de la taille de l’ADNmt
• du nombre de molécules d’ADNmt par mitochondries
Chez de nombreux organismes, les ADNmt codent pour des ARNt, des ARNr et des protéines mitochondriales essentielles.
Toutes les protéines codées par l’ADNmt sont synthétisées dans des ribosomes mitochondriaux, tandis que la plupart des protéines trouvées dans les mitochondries (telles que les ADN et les ARN polymérases mitochondriales) sont synthétisées dans des ribosomes cytosoliques et sont ensuite importées dans la mitochondrie.
La taille de l’ADNmt, le nombre et la nature des protéines qu’il code, et même le code génétique mitochondrial, varient fortement entre les organismes (sachant que le code génétique utilisé dans les mitochondries d’animaux et de champignons diffère déjà du code standard utilisé dans tous les gènes nucléaires procaryotes et eucaryotes).
Figure 3 : les modifications du code génétique standard dans les mitochondries
La plupart des animaux pluricellulaires ont un ADNmt qui a presque la même taille que l’ADNmt des humains, et code des produits de gènes similaires, tandis que l’ADNmt des levures est environ cinq fois plus long.
Les ADNmt des végétaux ont une taille bien plus importante et variable que les ADNmt des autres organismes (par exemple, à l’intérieur d’une même famille de plantes, la taille des ADNmt peut varier jusqu’à huit fois), et au contraire des animaux, levures et champignons, les ADNmt des plantes contiennent des gènes codant un ARNr mitochondrial 5S, présent uniquement dans les ribosomes mitochondriaux des plantes.
D’autre part, il est à noter que l’ADNmt accumule des mutations plus rapidement que l’ADNn.
3. l’ADN chloroplastique (ADNcp)
Les chloroplastes, organites présents dans le cytoplasme des cellules eucaryotes photosynthétiques (c’est-‐à-‐dire les plantes et les algues), sont nés d'une endosymbiose entre des cellules eucaryotes primitives et des cyanobactéries, qui a eu lieu il y a 1,6 milliard d'années environ. Leur structure présente beaucoup de similitudes avec celle des mitochondries.
Figure 4 : Ultrastructure d'un chloroplaste 1-‐membrane externe
2-‐espace intermembranaire
3-‐membrane interne (1+2+3: enveloppe) 4-‐stroma (fluide aqueux)
5-‐lumière du thylakoïde 6-‐membrane du thylakoïde 7-‐granum (thylakoïdes accolés) 8-‐thylakoïde inter-‐granaire (lamelle) 9-‐grain d'amidon
10-‐ribosome 11-‐ADN
12-‐plastoglobule (gouttelette lipidique)
Ces chloroplastes contiennent leur propre ADN (ADNcp), des ribosomes, et tout l’appareillage moléculaire nécessaire pour synthétiser des protéines.
Ainsi, ils contiennent de nombreuses copies d’ADN d’organites et de ribosomes, qui synthétisent certaines des protéines codées par les chloroplastes à l’aide du code génétique standard, ce sont donc des organismes semi-‐autonomes. L'ADN du chloroplaste ne lui permet pas de subvenir à tous ses besoins ; il y a donc une coopération entre la cellule et les chloroplastes, (de même qu’il existe des relations entre la cellule et ses mitochondries).
L’ADNcp est circulaire et non associé à des histones, de petite taille (120 000 à 160 000 pb selon les espèces). L’hérédité du chloroplaste est non-‐mendélienne, uniparentale chez la majorité des plantes : paternelle le plus souvent chez les Gymnospermes, et maternelle chez les Angiospermes.
Le nombre de gènes est d’environ 120. Ceux-‐ci codent pour 4 ARNr, 30/31 ARNt et 55 protéines, dont 30 n’ont pas de fonction connue, les autres étant impliquées dans la photosynthèse.
Bien que l’organisation générale des chloroplastes soit assez similaire chez les différentes espèces, il existe certaines différences dans la composition des gènes. Par exemple, l’ADNcp
du tabac est plus grand que celui de l’Hépatique, mais ce dernier possède certains gènes que l’autre n’a pas, et inversement.
B. la technique du PCR
Mise au point par Kary Mullis en 1985, cette technique de réplication ciblée in vitro permet, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant d’une région d’un acide nucléique choisi, d’obtenir une quantité très importante de copies de ce fragment d’ADN (de l’ordre de plusieurs millions en quelques heures), afin de pouvoir mieux l’étudier.
Principe : Une PCR se déroule dans un thermocycleur programmable. Tous les « acteurs » du PCR sont ajoutés dans un tube : l’ADN à amplifier, les oligonucléotides (ou amorces) spécifiques du segment d’ADN à étudier, l’Adn polymérase ainsi que les désoxyrubonucléotides constitutifs de l’ADN. Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l’ADN à amplifier.
La technique du PCR repose sur la répétition de plusieurs cycles comprenant chacun 3 étapes différentes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation.
Premier cycle :
• La dénaturation : Elle se déroule à 95°C. Les liaisons faibles qui assurent la cohésion du brin d’ADN sont rompues, on obtient alors deux brins simples d’ADN. Cette étape permet également d’homogénéiser le milieu réactionnel.
• L’hybridation : Elle se déroule à une température comprise entre 51 et 65°C (selon le choix des amorces). Les amorces se fixent de manière complémentaire sur les brins d’ADN. Ces amorces doivent remplir certains critères : leurs séquences nucléotidiques doivent être spécifiques des séquences complémentaires d’ADN simple-‐brin auxquelles elles vont s’apparier ; et leurs séquences doivent être choisies de manière à minimiser les possibilités d’appariement entre elles.
• L’élongation : A environ 72°C, les ADN-‐polymérases polymérisent le brin d’ADN : il y a alors synthèse du brin complémentaire d’ADN, à partir des désoxyribonucléotides libres présents dans le milieu réactionnel. Les brins ainsi obtenus serviront à leur tour de matrice pour le second cycle.
Deuxième cycle : On recommence à nouveau les trois étapes, et à la fin de ce second cycle, l’ADN a été multiplié par quatre.
Troisième cycle : A la fin du troisième cycle, la quantité d’ADN est huit fois supérieure à la quantité initiale.
Généralement, lors des manipulations, on procède à une trentaine de cycle.
Les quantités de copies d’ADN ainsi obtenues subiront une électrophorèse pour établir l’empreinte génétique de l’individu auquel elles appartiennent.
Figure 5: Etapes de la technique du PCR
C. Les microsatellites
Les microsatellites sont des séquences d’ADN composées de répétitions en tandem (c’est-‐à-‐dire toujours dans le même sens) d’un nombre variable de nucléotides (de 1 à 4 le plus souvent). Elles ont l’avantage d’être des « témoins neutres » : en effet, ils sont transmis de génération en génération mais ils ne sont pas source de sélection naturelle.
Pour que ces microsatellites puissent être un repère non ambigu, ils doivent être entourés à droite et à gauche de séquences uniques.
Figure 6: Détail d’un microsatellite
La longueur de ces séquences, c'est-‐à-‐dire le nombre de répétitions, est variable d'une espèce à l'autre, d'un individu à l'autre voire d'un allèle à l'autre chez un même individu. En revanche, la localisation de ces séquences sur le génome est relativement conservée entre les espèces, c'est-‐à-‐dire que leur localisation est sensiblement la même entre des espèces phylogéniquement proches. Ce sont donc de bons marqueurs pour la cartographie génétique.
Ainsi, après amplification de ces séquences d’ADN grâce à la méthode du PCR, on peut par exemple comparer deux colonies pour savoir si elles sont plus ou moins apparentées (la taille des fragments étant plus semblables pour des colonies apparentées que pour des colonies non apparentées).
Figure 7: les différentes étapes permettant l’étude des microsatellites
D. La technique RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
En 1980 Botstein et Coll ont publié une carte génétique du génome humain qui, pour la première fois, utilisait des marqueurs génétiques issus de la technique RFLP.
Cette technique, longue et laborieuse, est l’une des toutes premières techniques d’analyse d’ADN. Elle nécessite environ une semaine, et a donc très vite été supplantée par la méthode PCR..
Principe :
• On extrait tout d’abord de l’ADN du génotype à étudier.
• Une enzyme de restriction est alors utilisée afin de découper l’ADN en fragments de tailles différentes
• Ces fragments sont séparés par la suite selon leur taille grâce à une électrophorèse en gel d’agarose. L'ADN étant chargé négativement, il migre de la cathode vers l'anode. Les fragments les plus petits sont les plus rapides, on les retrouve donc à la borne positive. Ces enzymes coupent l’ADN au niveau de sites spécifiques, donc si une base change, le brin d’ADN ne sera pas coupé par l’enzyme de restriction. Des fragments d’ADN de différentes longueurs seront ainsi obtenus, ce qui nous permettra de différencier des individus différents.
On applique alors la méthode du Southern Blot :
• L'ADN est transféré sous forme dénaturée sur une membrane de nylon. La position relative des fragments d'ADN est préservée durant le transfert.
• Cette membrane est incubée dans une solution contenant une sonde marquée préalablement, soit par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie.
• L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est fixée sont révélés en plaçant la membrane au contact d'un film sensible à la radioactivité (radiographie) qui sera développé afin d’obtenir une image des bandes d’ADN ( cette image obtenue correspond à une carte génétique, ou carte de restriction d’une molécule d’ADN), ou en réalisant une réaction enzymatique colorée spécifique dans le cas des sondes marquées chimiquement. Tout cela nous permet alors d’identifier un fragment d’ADN donné.
Figure 8: Etapes de la révélation du RFPL porté par un ADN.
E. La technique SSCP (Single strand conformation polymorphism)
Cette technique vise à séparer différents allèles d’un même gène en misant sur la différence de migration dans un gel non dénaturant de leurs différentes conformations.Cette technique est utilisée sur des gènes variables.
Principe : Cette technique est basée sur le comportement électro phorétique de molécules d’ADN simple brin dans un gel d’acrylamide non dénaturant.
Une molécule simple brin a la propriété de former des structures secondaires par des appariements internes de bases. Ces structures sont dépendantes des séquences et
produisent des formes particulières pour chaque molécules simple brin. Ces différences dans la structure secondaire conduisent les molécules à migrer différemment dans le gel. Ainsi, les SSCP peuvent distinguer deux séquences d’ADN très similaires, uniquement sur la base de la forme particulière de leur structure simple brin. En principe, même deux allèles du même gène peuvent être discriminés.
La séquence d’intérêt est ensuite amplifiée par une PCR, et son produit est dénaturé à 95°C et refroidi très rapidement dans de la glace. Les molécules simple brin ne s’apparient donc pas, mais forment des structures secondaires simples. Les fragments réassociés sont ensuite soumis à une électrophorèse :
-‐S’il s’agit d’un homozygote, on observe deux bandes, chacune correspondant à une structure secondaire légèrement différente.
-‐S’il s’agit d’un hétérozygote, au moins quatre bandes peuvent être observées.
Cette technique est donc une technique simple, mais il existe tout de même deux inconvénients majeurs :
-‐Le comportement électrophorétique des molécules simple brin dépend en majeure partie des conditions de température et de migration, il ne peut donc pas être prédit.
-‐Le SSCP semble mieux fonctionner pour des petites insertions et ou délétions, car pour de longs fragments, cette méthode devient insensible à certaines mutations.
Figure 9 : Principe de la technique SSCP.
Figure 10 : Sur cette figure sont représentés 2 profils de migration sur un gel non dénaturant : profil altéré d’un ADN provenant d’un sujet malade. La flèche rouge indique la modification de migration, liée à la présence d’une migration au niveau de l’ADN étudié, une troisième bande est présente ; profil de migration d’un ADN provenant d’un sujet normal (témoin sans mutation) avec deux bandes (chacun des deux simples brins).
F. La technique DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis)
Cette technique est une technique d’électrophorèse permettant la séparation de molécules d’acides nucléiques (ADN ou ARN) de même taille. Elle permet de détecter des polymorphismes ou des mutations sur de l’ADN de très petite taille.Principe :
• On dépose un échantillon d’acide nucléique sur un gel d’électrophorèse contenant un agent dénaturant, tel que l’urée par exemple. Une fois dans ce gel, les fragments d’acides nucléiques sont soumis à différentes concentrations croissantes en dénaturant.
• Les 2 brins d’ADN se séparent plus ou moins rapidement en fonction de leur composition en bases AT et GC (2 liaisons hydrogènes pour AT contre 3 pour GC). Les fragments migrent d’abord comme des molécules double brins, puis, lorsque le gel change de composition, les molécules se dénaturent et deviennent simple brin. Ce changement de structure conduit à des molécules qui ont une capacité de migration dans le gel diminuée. Deux molécules différentes peuvent avoir des brins qui ne se sépareront pas au même moment et migreront alors différemment. La molécule la plus stable migrera moins vite que celle qui se dénaturera dans le gradient.
On estime qu’au moins 95% des différences dans la composition de séquence peuvent être détectées avec cette procédure. Elle est appliquée à :
Ø La détection de mutations inconnues. Elle permet la détection des mutations ponctuelles, les délétions, ou les insertions
Ø L’étude de polymorphismes en épidémiologie moléculaire et en microbiologie (appliquée à l’étude du virus de l’hépatite C)
I. Les outils de mesure de la bioiversité
A. Les méthodes d’échantillonnage
Ces méthodes d’échantillonnage, dont voici quelques exemples, sont surtout des méthodes visuelles.
1. La méthode des itinéraires échantillons
L’observateur parcourt un itinéraire banalisé, et note tout ce qu’il entend/voit de chaque côté du chemin et dans une bande de largeur donnée.
Cette méthode est surtout utilisée pour les oiseaux et les mammifères. Elle ne permet pas d’avoir des chiffres exacts, mais renseigne sur une « abondance relative » : l’observateur applique un coefficient de 1 à 5 par parties de territoire.
2. Le comptage à vue
L’observateur ne se déplace pas, il observe avec des jumelles ou avec un avion à basse altitude. Cette méthode ne fonctionne que pour des animaux de grande taille et faciles à déterminer.
3. L’échantillonnage
L’échantillonnage a pour but d’obtenir, à partir d’une surface donnée aussi restreinte que possible, une image fidèle de l’ensemble du peuplement. Plusieurs techniques sont utilisées, telles que :
• le carré de ramassage : utilisé pour les végétaux, les insectes
• le biocénomètre : on pose un cube sur 1m² de sol. Ainsi, on peut également observer ce qui vole
• le filet à papillons
• le radeau des cimes : propre à la forêt tropicale. On place un filet au niveau de la canopée, et on relève tout ce qui a été pris dedans.
L’échantillonnage permet de définir la densité de population (qui correspond au nombre d’individus par unité de surface ou de volume), ainsi que la biomasse (poids de matière vivante sèche ou fraîche des individus par unité de surface ou de volume)
4. La méthode de capture/recapture
Cette méthode est beaucoup plus adaptée aux insectes, mais elle concerne tout de
Prenons l’exemple d’une population de coccinelles : on capture une première fois un certain nombre de coccinelles noté M, on les marque et on les relâche. Après un certain temps, on recapture au même endroit un certain nombre d’individus de la même espèce (noté C), et on dénombre ceux qui sont déjà marqués (notés Cm).
T= (M*C)/Cm
Avec T le nombre total d’individus de la population.Figure 11 : illustration de la méthode de capture/recapture dans une population de Coccinelles
Néanmoins, ces méthodes ne sont pas très efficaces, et surtout pas très précises. Les progrès technologiques aidant, les méthodes moléculaires ont donc supplanté ces techniques basiques d’échantillonnage.
B. Le Barcoding ; code-‐barre du vivant ?
Le barcoding est une méthode récente et en plein essor qui tente de caractériser les espèces animales et végétales par le minimum de petites séquences ADN, appelées DNA barcodes, choisies pour maximiser la variabilité entre espèces tout en minimisant la variabilité intra espèce.
Autrement dit, c’est une technique nouvelle qui vise à fournir, de façon rapide, précise et automatique, l’identification d’espèces ou unités taxinomiques en utilisant des régions standardisées de l’ADN comme une étiquette spécifique pour chaque espèce.
Ces DNA bardcodes étant courtes, il est alors facile d’appliquer la méthode PCR.
Principe général :
La première étape consiste donc à prélever des échantillons d’un milieu (par exemple de l’eau, des excréments, du sol…), selon des normes précises afin d’éviter toute contamination qui pourrait fausser les résultats.
L’étape suivante, l’extraction de l’ADN contenu dans ces échantillons, suit un protocole adapté au type d’échantillon à étudier. Les ADN ainsi extraits servent ensuite de matrice à une amplification par PCR à l’aide d’un couple d’amorces prédéfini correspondant au code-‐
barres.
Après cette étape, chaque produit PCR obtenu est donc un mélange d’amplicons représentatif des ADN des espèces contenus dans l’échantillon de départ. Reste à obtenir la séquence de ces amplicons afin d’identifier les espèces correspondantes, ce qui est possible grâce aux nouvelles technologies de séquençage.
Après cela, les séquences obtenues sont triées par échantillon grâce aux tags, puis assignées à des taxons par comparaison avec des séquences de référence, d’où l’importance de l’outil bioinformatique pour trier les données, constituer les bases de référence, assigner les séquences aux taxons via ces bases, définir des listes de tags et gérer les erreurs de séquençage.
Cette technique du Barcoding présente de nombreux avantages :
• Les critères morphologiques permettant de déterminer certaines espèces, ont une efficacité limitée : il existe certains groupes où ils sont très ressemblants, ou peu accessibles (comme par exemple pour bon nombre de micro-‐organismes), ou encore peu variables (comme chez les Nématodes).
• Le Barcoding peut aussi se substituer aux relevés botaniques classiquement utilisés, notamment dans les milieux où la diversité est extrêmement élevée (comme par exemple la forêt tropicale). Ces relevés ne permettent pas forcément d’identifier toutes les espèces en présence, ce qui conduit les chercheurs à ignorer involontairement jusqu’à 20 % des genres présents dans leurs études !
• Le Barcoding est aussi très utile lorsqu’il s’agit de reconstituer des paléo-‐
environnements, et que les espèces concernées ont disparu.
• Le metabarcoding se révèle également plus efficace que les méthodes traditionnelles pour étudier les régimes alimentaires à partir des excréments et des contenus stomacaux (à savoir l’identification au microscope de fragments de cuticule de plante chez les herbivores ou de restes de proies chez les carnivores), qui n’apportent que des informations très partielles.
• Etc…
Un exemple : Régime alimentaire du Bison d’Europe en hiver dans la forêt de Biatowieza Primeval (en Pologne)
Figure 12 : Bison européen Bison bonasu
Figure 13 : Variations selon l’habitat et l’apport de rations de foin (=nourrissage)
C. Exemple d’application de la méthode PCR-‐SSCP:
Une espèce de champignon pathogène, Rhizoctonia solani s'attaque à une vaste gamme de cultures horticoles, céréalières ou ornementales, et est présente dans la plupart
des sols cultivés du monde. On compte plus d'une douzaine de sous espèces, appelées groupes anastomotiques (AG), et reconnues sous la désignation AG-‐1 à AG-‐11 et AG-‐B1.
La virulence de ces différents groupes et sous-‐groupes varie pour une même culture sensible. L'agronome doit donc identifier précisément les groupes et sous-‐groupes présents dans un sol afin de recommander des cultures résistantes ou de proposer des moyens de lutte efficaces.
Les groupes et sous-‐groupes AG se distinguent par des variations au sein d’une séquence d’un gène du R. solani. La méthode PCR-‐SSCP permet d’amplifier la séquence et de détecter les diverses variantes de la séquence par l’analyse du profil électrophorétique des simples brins amplifiés.
Amplification PCR :
Les groupes et sous-‐groupes du R. solani sont isolés du sol par culture sur une gélose semi sélective.
Les doubles brins d'ADN génomique de chaque champignon isolé sont ensuite extraits pour être amplifiés. Après 30 à 40 cycles, la séquence génétique qui permet l'identification spécifique du groupe ou sous-‐groupe est multipliée exponentiellement par un facteur de plus d'un milliard.
La méthode PCR-‐SSCP :
Les produits ADN double brins amplifiés par PCR sont dénaturés en simples brins, et sont ensuite séparés par électrophorèse en gel d'acrylamide grâce à un courant électrique. Les profils des simples brins sont colorés par fluorescence et comparés à une collection photo documentée de profils. L’analyse du profil permet d’identifier précisément chaque groupe et sous-‐groupe AG isolé du sol.
Ainsi, l'agronome a donc identifié précisément les groupes et sous-‐groupes présents dans un sol, et peut alors recommander des cultures résistantes ou proposer des moyens de lutte efficaces.
Figure 14 : Exemple de séparation des simples brins par électrophorèse sur gel d’acrylamide selon la
méthode SSCP
D. La génétique des populations des chênes basés sur le polymorphisme d’ADNcp
En raison de son niveau (relativement) plus élevé de diversité, l'ADNcp est particulièrement intéressant pour les études phylogéographiques.
Les informations tirées de l’analyse de l’ADNcp et associées à des études paléobotaniques (pollen, restes de fossiles) ou historiques, permettent de comprendre et de retracer les voies de colonisation des espèces. Ainsi, on a une meilleure compréhension de l’impact de l’histoire sur la diversité génétique actuelle.
L’ADNcp a donc été largement utilisé chez les Angiospermes pour retracer les voies de migration empruntées après les dernières glaciations pour reconquérir l’espace vacant. Elle a aussi permis d’élaborer des modèles de recolonisation pour les chênes, mettant en évidence le rôle essentiel des rares événements de fondations à longue distance.
Chez la plupart des espèces, lors des glaciations, des lignées différentes se sont mises en place dans les différents refuges européens. Vu le taux d’évolution très lent de l’ADNcp, il est donc ensuite assez facile de suivre une lignée, c’est-‐à-‐dire un ensemble haplotype (génotypes haploïdes) proche génétiquement sur l’ensemble de l’aire. Ceci est vrai uniquement dans le cas où ces espèces ont, d’une part, trouvé refuge et, d’autre part, n’ont fait l’objet d’aucun transfert de matériel important ni par les animaux ni par les humains. Si ces conditions sont bien vérifiées alors il doit avoir une concordance entre la phylogénie et la structuration géographique de la diversité.
Le projet FAIROAK :
Cartes de synthèse de la diversité génétique et la performance de provenance, pour l'utilisation et la conservation des ressources génétiques en Europe de chêneCe projet avait pour objectifs :
• de construire des cartes géographiques sur la base des différences génétiques des lignées maternelles et du pollen fossile
• d'évaluer les provenances soulevées dans les différents pays dans les cartes géographiques, et de les comparer avec la carte géographique des lignées maternelles
• d'estimer le niveau de diversité génétique et la variation phénotypique dans Q. petraea et Q. robur dans les différents domaines de la distribution naturelle
• de fournir des informations de base pour définir les règles de transfert de semences entre les différents pays européens.
Une description de 39 haplotypes trouvés lors de l’enquête est fournie dans un tableau (que nous n’avons pas reporté dans ce dossier) avec également les codes couleurs utilisés pour les cartes. Un arbre a aussi été édifié afin de montrer les relations entre les haplotypes.
Figure 15
Toutes ces études ont été réalisées grâce à l’amplification par PCR de fragments prélevés chez les différents haplotypes découverts durant le dépistage préliminaire. Ces fragments ont ensuite servis de matrice aux techniques RFLP (entre autres).
Figure 16: Répartition des différents haplotypes existant en France
Haplotype 1 (rouge): Grogna
Haplotype 2 (rose): Klostermarienberg Haplotype 10a (jaune): Mimizan Haplotype 7 (turquoise): Lucatelli Haplotype 17a (vert): Chieuti
Halotype 25 (marron): Maroon (Maroc) Haplotype 12a (orange): Hostens
Figure 17: Carte géographique du Q. robur
Figure 18: carte géographique des chemins de colonisations des différents haplotypes
Bibliographie
http://www.cyberjunior.com/tifenn/adgenelab/agro-‐alimentaire/prestations.html http://www.ens-‐lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm
http://www.jle.com/e-‐docs/00/03/FE/CF/vers_alt/VersionPDF.pdf http://archimer.ifremer.fr/doc/2000/rapport-‐1768.pdf
http://www.irda.qc.ca/_documents/_Results/28.pdf
http://www.futura-‐sciences.com/uploads/RTEmagicC_adn_dp_txdam21598_a9600a.jpg Biologie moléculaire de la cellule, Harvey Lodish,Arnold Berk,Paul Matsudaira,Chris A.
Kaiser,James Darnell, éditions Darnell, 2005
Preuve par l'ADN: la génétique au service de la justice, Raphaël Coquoz, Franco Taroni, éditions des Presses polytechniques et universitaires romandes,
http://biologie.univ-‐mrs.fr/upload/p222/6_Les_Plastes_Caffarri.pdf
Biologie cellulaire et moléculaire, Eduardo D. P. De Robertis,E. M. F. De Robertis,
Making PCR, a story of biotechnology, Paul RABINOW, éditions The university of Chicago Press
PCR, Second edition, Michael McPerson et Simon Meller, éditions The Basics http://archimer.ifremer.fr/doc/2000/rapport-‐1768.pdf
Techniques et utilisations des marqueurs moléculaires, André Bervillé, Michel Tersac, Les Colloques n°72
http://www.irda.qc.ca/_documents/_Results/28.pdf
Microsatellites: evolution and applications , David B. Goldstein, Christian Schlötterer, éditions Oxford university Press
http://genome.cshlp.org/content/1/1/34.full.pdf
Principes de biologie moléculaire en biologie clinique, Nedjma Ameziane,Marc Bogard,Jérôme Lamoril, éditions Elsevier
http://gepv.univ-‐lille1.fr/downloads/enseignements/M1-‐S7/M1-‐S7-‐Vekemans-‐Chap2-‐BioCons.pdf Biofutur numéro 319 ; mars 2011, pp 30-‐32
http://acces.inrp.fr/evolution/biodiversite/barcoding http://www.barcodeoflife.org/
Barcodes for Mobile Devices, Hiroko Kato,Keng T. Tan,Douglas Chai, editions Cambridge university
http://www.inra.fr/dpenv/pdf/demesd21.pdf http://www.pierroton.inra.fr/Fairoak/
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