LES OUTILS POUR DÉCRIRE LA BIODIVERSITÉ

LES OUTILS POUR DÉCRIRE LA BIODIVERSITÉ

INTRODUCTION :

De nos jours la biodiversité est au centre de nombreux débats, aussi bien politiques, économiques ou dans la vie de tous les jours. Elle est souvent mise en relation avec l'écologie, la protection de l'environnement en somme elle est un sujet d'actualité. Mais à quoi correspond-elle réellement? Et comment l'étudier?

I - LA BIODIVERSITÉ

a) Histoire :

Il faut tout d'abord savoir que la biodiversité est un processus long, mis en place à l'échelle des temps géologique.

Le terme de biodiversité est récent, autrefois l'on parlait plutôt de Nature.

XVIIIème : Au départ simple description de la Nature, pas d' étude de l'évolution donc uniquement des classifications sur des critères morpho-anatomiques : Théorie fixiste

• Carl Von Linné : (18ème siècle) classification binomiale parfois un peu « arbitraire » Genre, espèce

• Georges Louis Leclerc, comte de Buffon( fin 18ème) est un naturaliste ses théories ont influencé Charles Darwin et Jean-Baptiste de Lamarck. Précurseur de l'anatomie comparative, il remarque des ressemblances entre l'Homme et le singe et envisage une généalogie commune.

• Georges Cuvier : promoteur de l'anatomie comparée moderne et de la paléontologie. Il énonce le principe de coordination des organes et de corrélation des formes. Il va créer une classification du règne animal en 4 parties : Ordre, Famille, Genre, espèce.

• Jean-Baptiste de Lamarck : Est le premier à proposer une théorie matérialiste et mécaniste des êtres vivants à partir de laquelle il met en place une théorie de leur évolution : la théorie transformiste s'appuyant sur deux principes : le complexification de l'organisation des êtres

vivants et la diversification ou spécialisation des êtres vivants en plusieurs espèces.

Donc au départ théorie fixiste puis transformiste.

XIXème

• Darwin : Sélection naturelle : les individus sont capables de s'adapter à l'environnement dans lequel ils vivent en évoluant. Théorie de l'évolution.

XX ème

• Évolutionnisme avec redécouverte des lois de Mendel , avancée de la génétique et de la biologie moléculaire ont permis de confirmer la théorie de l'évolution de Darwin et de la compléter avec l'essor de la phylogénie

• Le mot biodiversité apparaît en 1988 pour la première fois dans une publication des Actes du Colloque de E.O Wilson et F.M Peter.

• La Conférence de Rio de 1992 a réuni 172 gouvernements dont le but était d'assurer le développement durable de la Planète.C'est là que le terme de biodiversité a été utilisé pour la première fois.Sa définition est la suivante : biodiversité=diversité biologique ou plus précisément à Rio : « variabilité des êtres vivants de toute origine y compris, entre autres,les écosystèmes terrestres, marins et autres écosystèmes aquatiques et les complexes écologiques dont ils font partis;cela comprend la diversité au sein des espèces et entre espèces ainsi que celle des écosystèmes. »

La biodiversité peut décrire des variations entre individus, espèces, communautés et écosystèmes.

b) Les niveaux d'étude de la biodiversité : Individu

espèces communauté écosystèmes Biomes

La biodiversité s'organise en trois niveaux hiérarchiques:

• la diversité génétique ou intraspécifique: diversité des gènes à l'intérieur même des espèces.

• la diversité spécifique ou des espèces, diversité en espèces pour une zone géographique donnée (celle dont on parle dans les média)

• la diversité écologique ou écosystémique : diversité des écosystèmes et des interactions qui les composent.

La caractérisation de la biodiversité constitue un élément important pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes. L'étude de la diversité du vivant permet notamment de conserver certains écosystèmes ou encore les restaurer.

c) Intérêts de la biodiversité:

Intérêt économique Intérêt politique

Volonté de protéger les ressources (conscience humaine pour le futur) ,protection de l'environnement : Biologie de la conservation

Mieux comprendre l'histoire évolutive , les grandes extinctions

Inventaire, classification des espèces vivantes sur Terre, volonté de connaître la Planète sur laquelle on vit pour tenter d'expliquer certains phénomènes.

Évaluation, mesures d) But :

Classifications Phylogénie IBP, Hotspot,

Indicateurs fonctionnels tels que : Taux d'échange génétique entre les populations, Taux de croissance des populations, Taux de recyclage des éléments nutritifs.

Biologie de la conservation

2 Description de la biodiversité

a) Méthodes

Des méthodes morpho-anatomiques

Des méthodes Statistiques : exemple taux de croissance ou de développement d'une espèce Des méthodes biochimiques

Des méthodes moléculaires

Génétique des populations : étude des 4 forces évolutives migration, mutation, sélection naturelle, dérive

b) étude du polymorphisme.

Depuis longtemps, les espèces ont été décrites grâce à des méthodes morphologiques, cependant ces méthodes trouvent leurs limites lorsque l'on souhaite étudier des organismes trop petits ou peu variables pour que seule leur morphologie nous permette de les différencier, c'est le cas notamment des micro organismes. Les découvertes génétiques (ADN), les avancées en biologie moléculaire, et en biochimie, ont permis de faire des différenciations plus précises des organismes vivants.

Description importante de la Biodiversité avec l'explosion de création de classification par les taxonomistes.

Aujourd'hui classification phylogénétique grâce aux méthodes d'études moléculaires sur l'ADN s'intéressant au polymorphisme génétique.

Le polymorphisme signifie « plusieurs formes », c'est-à-dire que chaque individu d'une même espèce se distingue des autres par des différences:

Polymorphisme phénotypique

Par exemple la différence de couleurs ou mélanisme des ailes chez les phalènes :

La différence de durée de vie chez la betterave maritime :

Le polymorphisme génétique :

Variation entre les individus dans la séquence de gène ; ces variations qui rendent compte des différentes allèles dans une population normale et qui ne sont pas pathogènes.

II - LES MÉTHODES ACTUELLES DE DESCRIPTION DE LA BIODIVERSITÉ : LES TECHNIQUES DE PCR

Le polymorphisme génétique est étudié grâce aux différentes techniques de biologie moléculaire.

Au sein des êtres vivants il existe différentes formes de génome.

Chez les procaryotes il n'y a pas de noyau donc l'ADN est compris au sein d'un chromosome circulaire libre dans le cytoplasme et il existe aussi un génome extrachromosomique au sein des plasmides et des épisomes.

Les points communs de tout le génome bactérien sont

• ADN bicaténaire et circulaire

• un seul chromosome

• pas de noyau

• enroulement avec histones

• pas d'introns

Les différenciations se font donc au niveau de la taille de ce génome, de la composition de l'ADN

(% de GC) et au niveau des plasmides.

L'étude des plasmides est importante car ce sont des molécules d'acides nucléiques les plus faciles à étudier et plus simple à extraire des cellules.

Par ailleurs on peut étudier la diversité du monde bactérien par le biais de l'étude des protéines mais cette méthode est moins intéressante car il faut veiller aux conditions de culture.

Chez les eucaryotes il existe aussi plusieurs formes de génomes comme le génome nucléaire contenu dans le noyau,et le génome des différents organites comme le génome mitochondrial et le génome chloroplastique (végétaux).Les ADN mitochondriaux et chloroplastiques sont souvent utilisés dans les études moléculaires car ils sont à transmission monoparentale: de lignée maternelle.

Cependant l'étude de l'ADN nucléaire n'est pas exclu car il permet l'étude de certain fragment comme les microsatellites et les scnp (single copy nuclear polymorphic sequence) alors que pour le génome des organites il faut étudier les séquences en entier.

La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une synthèse réitérative d'ADN par une ADN polymérase à partir de 2 amorces encadrant la séquence d'intérêt, découverte en 1983 par K Mullis et reprise et développée pour le diagnostic de la drépanocytose en 1985 par Saiki-Erhlich.

Cette technique s'appuie sur une succession de cycle (n~30-40) comprenant chacun trois étapes successives

1 la dénaturation de l'ADN

2 hybridation des amorces (annealing)

3 élongation des amorces par l'ADN polymérase

ces étapes sont répétées N fois pour obtenir 2n copies (multiplications exponentielles)

Le matériel nécessaire pour faire la PCR est une matrice d'ADN, des amorces (sens et antisens) des désoxyribonucléotides, une ADN Polymérase (Taq ADN Polymérase), une solution tampon et MgCl2 indispensable au fonctionnement de la polymérase.

Les techniques de barcoding, les microsatellites,RFLP-PCR, AFLP-PCR et SSCP-PCR, s'appuient sur la technique de PCR.

1 Le barcoding code barre génétique

comparaison avec une banque de données rapide

mission Santo 2006

a) Généralités :

C'est une technique qui permet d'identifier à partir d'ADN des espèces,de reconstituer des paléoenvironnements ou encore d'étudier les régimes alimentaires. C'est une méthode rapide et fiable, apparue il y a environ une dizaine d'années et qui porte le nom de « code barre ADN ».

Par exemple pour les espèces animales, l'on a découvert en 2003 que c'est le fragment du gène mitochondrial qui code pour la cytochrome oxydase 1 qui est intéressant et qui est donc le fragment de référence des espèces animales.

Méthode importante pour les taxonomistes et les écologues pour qui permet l'identification d'espèces présentes dans un milieu et qui sont difficilement caractérisables : par exemple les microorganismes ou encore les macroorganismes dont la présence est détectée grâce aux traces d'ADN qu'ils laissent : cadavres, excréments, mucus...

b) Principe :

On amplifie le fragment d'ADN considéré par une technique de PCR (cf description aurore) puis

l'on compare à une base de données de référence (ou l'on utilise des amorces spécifiques propres à certaines espèces.)

Le code-barre doit être variable entre les espèces mais très conservé intraspécifiquement.

Il doit par conséquent être discriminant.

Les séquences sont analysées grâce à des outils informatiques qui permettent de comparer l'ADN à une base de données préexistante.

(Ces codes-barres d'ADN doivent être informatifs pour la phylogénie, c'est-à-dire que les divergence entre les séquences doivent correspondre aux divergence entre les espèces.)

Une fois le code-barre défini, l'on peut identifier l'ensemble des taxons d'un échantillon (de la famille à l'espèce.)

c) Exemple d'application :

Mission Santo 2006 : c'est une expédition scientifique internationale d'inventaire de la biodiversité réunissant des biologistes sur l'île d'Esperitu Santo (île Montagneuse du Vanautu ds le Pacifique Sud).Pendant près de 5 mois de Décembre à Août 2006.

2 Les microsatellites

Les gènes microsatellites sont des séquences d'ADN formées par une répétition continue de motifs composés de 2 à 10 nucléotides. Également appelés simple sequence repeats (SSR) ou short tandem repeat (STR) ou encore variable number tandem repeat (VNTR).

Motif très important chez les eucaryotes, il peut être présent à des milliers d'exemplaires dans le génome d'une espèce. Ces séquences sont présentes sur l'ensemble du génome souvent au niveau des introns mais aussi au niveau des exons.

Leur transmission suit les lois de l'hérédité de Mendel.

La longueur de ces séquences varie mais en revanche la localisation de celles-ci est relativement conservée au sein des espèces. En effet pour des espèces proches phylogénétiquement la localisation des gènes microsatellites reste sensiblement la même.

Ainsi ces gènes sont utilisés pour déterminer l'appartenance à une espèce et pour définir la biodiversité génétique au sein d'une espèce.

Les microsatellites peuvent être utilisés comme marqueurs pour construire des cartes génétiques.

Les microsatellites sont intéressants car ils présentent un polymorphisme élevé (taille), ils sont mulltialléliques, codominants (on peut distinguer des homozygotes, des hétérozygotes et des neutres)

Exemple : Étude de deux chênes: Chêne liège (Quercus suber) et Chêne Vert (Quercus rotundifolia) :

Pour comprendre l'importance des marqueurs microsatellites, nous allons nous intéresser à l'étude de deux chênes, Quercus suber : le chêne liège et Quercus rotundifolia, le chêne vert dans un espace où les deux espèces sont en sympatrie en région méditerranéenne dans le moyen Atlas . Pour étudier la différenciation génétique entre ces espèces, des marqueurs microsatellites ou SSR sont utilisés. Les marqueurs microsatellites sont connus pour avoir un polymorphisme extrêmement élevé (taille), sont mulltialléliques, codominants et neutres.

Méthode :

• extraction ADN

• PCR

• électrophorèse

Les analyses ont été faites sur 5 loci microsatellites chloroplastiques

• ssrQpZAG119

• ssrQpZAG9

• ssrQrZAG7

• ssrQrZAG20

• MSQ4

Ces marqueurs microsatellites possèdent des répétitions en tandem d'une séquence à « motif » court de type (GA)n, (AG)n ou (TC)n

Résultat :

QrZAG7,QrZAG20, et MSQ4 ont montré un polymorphisme élevé chez les deux chênes étudiés, et QpZAG9a détecté une mutation de type insertion:délétion chez le chêne vert.

L'analyse de la diversité de l'ADNcp par RFLP-PCR du chêne liège montre que le chloroplaste du chêne vert est présent dans son cytoplasme.

Le marqueur QrZAG20 est le seul a avoir montré qu'il y a eu un échange de génome chloroplastique entre Q.suber et Q.rotundifolia . MSQ4 montre un plus fort polymorphisme que celui révélé par QRZAG20.

Les chênes liège et les chênes vert du haut Atlas qui possédaient le même haplotype R2 ont été séparés par RFLP PCR. Les microsatellites ont montrés un polymorphisme élevé intraspécifique, ce qui montre que ceux ci sont bien appropriés à l'étude de la diversité génétique au sein des chênes.

Le marqueur QrZAG20 à démontré que ces marqueurs sont transmis par voie maternelle.

Quercus rotundifolia

Quercus suber

3 La RFLP-PCR ( Restriction Fragment Length Polymorphism) Basée sur l'étude du profil de restriction du produit de PCR

Cela permet la mise en évidence des mutations : polymorphisme siégeant au niveau de site de restriction enzymatique.

1) Amplification par PCR de la région d'intérêt

2) hydrolyse du produit PCR par l'enzyme de restriction

3) séparation par électrophorèse en gel d'agarose (BET Bromure d'éthydium) 4) visualisation par hybridation avec une sonde radioactive ou fluorescente.

4 L'AFLP-PCR ( Amplified Fragment Length Polymorphism )

Technique qui est une combinaison entre la RFLP et RADP (Random Amplified Polymorphism DNA), utilise les microsatellites comme amorce). Digestion par une enzyme de restriction de l'ADN (EcoR1 ou Mse1) puis des adaptateurs vont se fixer au bout des produits de digestion.

5 La SSCP-PCR (Single Strand Conformation Polymorphism )

On dépose sur un gel de polyacrylamide des fragments d'ADN dénaturés,ainsi ces molécules d'ADN en se renaturant adoptent des conformations secondaires particulières qui sont dépendantes de la séquence de nucléotidique.

Si sur un des fragments il y a eu une mutation alors ce fragment va adopter une conformation différente. Cette différence de conformation est utilisée ensuite pour différencier les brins, en effet ils sont ensuite chargés et placés dans un gel de polyacrylamide non dénaturant. Les ADN simple brin ne vont pas migrer de la même manière en fonction de leur taille et de leur conformation secondaire.

Les résultats sont ensuite lus grâce à une électrophorèse, ainsi on détecte le brin sur lequel il y a eu une mutation, ce qui permet de différencier les espèces et la biodiversité au sein des espèces.

Exemple : Application des techniques moléculaires de RFLP PCR et RFLP-SSCP-PCR dans l'étude de différenciation génétique de deux huîtres creuses : Crassostrea gigas et Crassostrea angulata.

Les huîtres creuse se divisent en deux genres Saccostrae et Crassostrea, ce dernier comprend une vingtaine d'espèces, dont les deux espèces étudiées.

Crassostrea angulata a été importé des côtes portugaises en 1868, ces huîtres ont fortement été touchées par la mortalité due à un virus. Par conséquent une nouvelle espèce a été importée Crassostrea gigas (huître creuse japonaise). L'homme à mis en contact deux espèces qui avaient des origines géographiques différentes. Ces deux espèces sont extrêmement semblables, en effet elles ont les mêmes caractéristiques morphologiques, leurs données physiologiques et écologiques sont similaires, elles ont donc une forte homologie génétique. De plus elles sont interfécondes la barrière reproductive entre ces deux espèce ne fonctionne pas. Le but de cette étude est de trouver les différences de ces deux espèces qui ont tant de similitudes.

Pour cela il a été utilisé des ADN mitochondriaux et des microsatellites.

Par le biais des méthodes de RFLP-SSCP-PCR, cette étude a conclu qu'il existe un polymorphisme important entre des deux espèces d'huître.

Crassostrea angulata

Crassostrea gigas

CONCLUSION

La biodiversité est un concept actuel mais les outils pour la décrire quant à eux ne sont pas tous récents.

En effet les découvertes récentes en biologie moléculaire et en génétique, ont permis de faire avancer les méthodes d'étude mais les anciennes méthodes sont toujours utilisées notamment pour poser les fondamentaux avant de se lancer dans des recherches qui malgré l'évolution sont encore coûteuses.

Bibliographie :

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Biodiversité,taxonomie, et barcode moléculaire-Nicolas Pullandre.pdf

http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Parker/method.html http://boomersinfokiosk.blogspot.com/2011/06/dna-barcoding-captures-international.html http://acces.inrp.fr/evolution/biodiversite/barcoding

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Revue biofutur mars 2011, Quand la génomique rencontre l'Ecologie, article Métabarcoding François Pompanon, Eric Coissac, Pierre Taberlet

Cours d'écologie L2-S3 Maxime Pauwels Université Lille 1 http://www.ird.fr/recherche/santo2006

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http://fr.wikipedia.org/wiki/microsatellites_(biologie)

Cours sur les Techniques de base en Biologie moléculaire: La technique de PCR: principe et applications de licence 3 en Ingénierie de la Santé. De MP Buisine (2009)

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http://www.israbat.ac.ma/html/PublicationsIS/bis_sv_26-27/Belahbib.pdf

http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/M1-BBCM/Classification_biodiversite.pdf

TABLE DES MATIÈRES

Introduction : ...1

I - La biodiversité...1

1Définition de la biodiversité...1

a)Histoire :...1

b)Les niveaux d'étude de la biodiversité : ...2

c)Intérêts de la biodiversité:...4

d)But : ...4

2Description de la biodiversité...4

a)Méthodes ...4

b)étude du polymorphisme...4

II - Les méthodes actuelles de description de la biodiversité : Les techniques de PCR ...5

1Le barcoding...6

a)Généralités : ...6

b)Principe : ...6

c)Exemple d'application : ...7

2Les microsatellites...7

3La RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism)...9

4L'AFLP-PCR (Amplified Fragment Length Polymorphism)...9

5La SSCP-PCR (Single Strand Conformation Polymorphism)...10

Conclusion...12