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Correction TP 2 SV-D : Méthodes d’étude des protéines
Chromatographie d’exclusion : séparer selon la taille
Application : On entreprend de séparer par chromatographie d’exclusion six protéines à peu près sphériques présentes en mélange dans un extrait. Le tableau 1 donne le nom des protéines, leur masse moléculaire, la racine cubique de leur masse et le volume d’élution ; la figure 3 montre le profil d’élution.
Protéine Masse moléculaire M (kDa) 3√ M Volume d’élution V (mL)
Ribonucléase A 13 2,35 250
Chymotrypsinogène 25 2,92 228
Ovalbumine 43 3,50 199
Albumine sérique bovine 67 4,06 176
Aldolase 158 5,40 146
Catalase 232 6,14 123
Tableau 1 : Masse moléculaire des 6 protéines du mélange et volumes d’élution sur colonne de chromatographie d’exclusion.
Elution d’une colonne de chromatographie d’exclusion
Figure 3 : profil d’élution d’un mélange de 6 protéines, fractionnées par chromatographie
d’exclusion. L’absorbance à 280 nm est une mesure de la concentration protéique.
Chacun des pics est identifié par son volume d’élution.
2 1. Expliquez l’ordre d’élution des protéines
Dans la chromatographie d’exclusion, les protéines plus grosses que la taille d’exclusion des billes explorent un plus petit volume de la colonne. Logiquement, elles sont éluées avant les petites protéines, qui pénètrent dans les pores des billes. Comme la taille d’exclusion des billes n’a pas une valeur précise mais représente plutôt un intervalle, les protéines ne sortent pas en deux groupes (exclues/non exclus) mais se succèdent lors de l’élution.
2. Construisez le graphe M = f(V) et le graphe 3√ M = f(V).
3. Lequel des deux graphes donne une droite ? Voyez-vous une explication ? (Indice : on considèrera que la masse moléculaire est proportionnelle au volume sphérique de la protéine) Le volume d’élution semble inversement proportionnel à 3√ M, plutôt qu’à M. En effet, la masse d’une protéine est approximativement proportionnelle à son volume, et le volume d’une protéine sphérique est proportionnel au cube de son rayon : la racine cubique de la masse doit donc être approximativement proportionnelle au rayon de la protéine. Or c’est le rayon (ou le diamètre) qui importe dans la chromatographie d’exclusion, car une protéine de diamètre supérieur au diamètre des pores des billes sera exclue.
50 100 150 200 250
Vélution
0
2 4 6 8
3√ M
200
100 M (kDa)
3
Application : séparation des protéines de la membrane des globules rouges par chromatographie d’exclusion
On solubilise les protéines de fantômes d’hématie puis on soumet le mélange à une chromatographie d’exclusion. Le volume d’élution (en mL) est noté Ve. On récupère différentes fractions d’élution (e1 à e8) puis on les fait migrer sur un gel d’électrophorèse SDS-PAGE. Les protéines sont révélées par coloration au bleu de Coomassie. (A. Desrames & al. (2020), BBA – Biomembranes 1862, 183126) 1) Pourquoi la protéine 4.2 apparaît elle plus tard (c’est-à-dire pour un plus grand volume d’élution) que la spectrine ?
La protéine 4.2 a une masse moléculaire inférieure à celle de la spectrine, elle sort donc de la colonne d’exclusion après (mais elle migre avant sur le gel d’électrophorèse SDS-PAGE).
2) Qu’indique la position d’une bande ? qu’indique son intensité ?
En SDS-PAGE, la distance de migration d’une protéine (distance entre le puits de dépôt et le front de la bande) est fonction de sa masse moléculaire (proportionnelle au logarithme de la masse). L’intensité de la bande est proportionnelle à la quantité de cette protéine dans l’échantillon déposé.
3) Quelles fractions « pooler » (rassembler) si l’on veut récupérer plus des ¾ de la protéine 4.2 ? (estimer grossièrement l’abondance relative) Quel volume de solution cela représentera-t-il ?
En poolant les fractions 3 à 6 (soit un peu moins de 0,5 mL d’éluat), on récupèrerait plus des ¾ de la protéine 4.2
4) Quelle serait la fraction la plus pure en protéine de bande 4.2 ?
La fraction qui contient le plus de protéine 4.2 est la fraction 4 ; toutefois la fraction 5 serait la plus pure, car elle contient à peine moins de protéine 4.2 mais nettement moins des autres protéines.
0 0,5 1,0 1,5 2,0
Ve (mL)
e1 e2 e3 e4 e5 e6 e7 e8
Fantômes4
Chromatographie d’affinité : séparer selon l’affinité
Application : Chez les Mammifères, NOV (nephoblastoma overexpressed) est une protéine extracellulaire de 48 kDa interagissant avec la matrice extracellulaire, et en particulier avec les glycosaminoglycanes. Elle est impliquée dans la prolifération de cellules cancéreuses.
On cherche à produire et à purifier la protéine NOV. On suit le protocole suivant :
On cultive des cellules préalablement modifiées de façon à produire la protéine NOV, en milieu liquide, dans une boîte de Petri.
Après 48 h de culture, on récupère le surnageant de la culture cellulaire. Il devrait normalement contenir la protéine NOV, qui est une protéine sécrétée.
On fait subir à ce surnageant une chromatographie d’affinité en utilisant un gel constitué d’héparine, un glycosaminoglycane pour lequel la protéine NOV a une affinité.
L’élution utilise une solution de NaCl à 0,8 mol.L–1. Chaque fraction récupérée lors de la chromatographie d’affinité est analysée à la fois par SDS-PAGE (électrophorèse dénaturante) puis par western blot avec un anticorps dirigé contre NOV. Le résultat est présenté dans la figure 5.
Figure 5 : Analyse par SDS-PAGE (a) et par western blot (b) de la composition des diverses fractions isolées par chromatographie d’affinité. Sur le gel SDS-PAGE, les protéines totales sont colorées au rouge ponceau. Le western blot, quant à lui, est révélé avec un anticorps anti-NOV.
Surnageant total : échantillon initial non purifié.
Filtrat primaire : première fraction récupérée.
Lavages 1 et 2 : deux fractions successives obtenues après un ou deux lavages à l’eau.
Élution 1, 2 et 3 : trois fractions successives obtenues après un, deux ou trois lavages avec une solution de NaCl à 0,8 mol.L–1.
Les tailles des protéines, en kDa, sont données à gauche de chacune des deux images. Les anticorps utilisés pour le western blot sont des anticorps anti-NOV. (Source : Dunod ; Modifié d’après Bohr et al., 2010, PLoS ONE 5(12): e16000 ) .
5 1) Est-ce que toutes les protéines NOV du surnageant ont été fixées sur la colonne ?
Oui, car le western blot du filtrat primaire ne montre aucune bande.
2) Pourquoi les pistes « surnageant total » et « filtrat primaire » sont-elles semblables en SDS-PAGE et différentes sur le western blot ?
La coloration du gel au rouge ponceau montre de très nombreuses bandes, et l’aspect est similaire pour le surnageant avant filtration et pour le filtrat primaire. En effet, la protéine NOV représente sans doute une toute petite fraction des protéines totales qui ont été sécrétées, et son absence dans le filtrat primaire n’est donc pas visible.
3) Est-ce que d’autres protéines que NOV se sont fixées sur la colonne ?
Oui : en effet, lorsqu’on décroche la protéine NOV de la colonne par élution avec la solution salée, on voit de nombreuses bandes (dont NOV à peine visible) : beaucoup d’autres protéines se sont fixées de façon non spécifique à la colonne.
4) Les protéines NOV se décrochent-elles de la colonne lors des lavages ?
Non, aucune bande à la hauteur de NOV n’apparait dans le produit du premier lavage (et aucune bande tout court dans le second) : NOV est bien accroché.
5) Est-ce que deux lavages ont suffi ?
Oui, on aurait même pu se contenter d’un seul lavage pour enlever les protéines non accrochées dans la colonne (mais c’est plus facile à dire après coup).
6) Est-ce que trois élutions ont suffi ?
Oui, on aurait même pu se contenter de deux élutions car il n’y a plus de protéines NOV dans la troisième élution.
7) Quel serait l’intérêt de ne retenir que l’élution 2 pour étudier la protéine NOV ? Quel serait l’inconvénient ?
Dans la deuxième élution, la protéine NOV est beaucoup plus pure que dans la première, où elle n’est même pas majoritaire. L’inconvénient de ne pas pooler les deux élutions est que l’on perd le peu de NOV qui était présente dans la première, mais ce n’est pas cher payé pour l’avoir pure.
Chromatographie par échange d’ions : séparer selon la charge
Application : Vous êtes chargé de purifier une protéine X à partir d’un extrait brut. Au cours de vos études préliminaires, vous avez déterminé que votre protéine partiellement purifiée est stable (conserve une activité) entre pH = 5,0 et pH = 7,5. De part et d’autre de cet encadrement, la protéine n’est plus active.
Votre directeur de thèse souhaite maintenant que vous réalisiez une rapide expérience afin de déterminer les conditions d’une purification de la protéine X par chromatographie par échange d’ions.
Il vous a laissé des instructions :
D’abord, vous êtes censé mélanger un peu de l’extrait brut avec une faible quantité de résine échangeuse d’ions DEAE-Sépharose dans une série de solutions tampons dont les pH s’échelonnent entre 5,0 et 7,5.
Ensuite, vous devez centrifuger le mélange pour faire descendre la résine au fond du tube, puis tester la présence de la protéine X dans le surnageant.
Enfin, il vous dit d’utiliser cette information pour choisir le pH adapté à la chromatographie par échange d’ions.
Vous avez mené à bien les deux premières étapes et avez obtenu les résultats présentés dans la figure 7. Mais vous êtes un peu incertain quant à la manière d’utiliser ces informations pour choisir le pH de la chromatographie.
6 1) A quelle extrémité de la gamme de pH la charge nette globale de votre protéine est-elle la plus positive ? A quelle extrémité est-elle la plus négative ? (sur cette gamme de pH, les groupements aminés chargés positivement portés par les billes de DEAE-Sépharose ne sont pas affectés)
Les billes sont chargées positivement à tout pH. Si l’on ne retrouve pas la protéine dans le surnageant, c’est qu’elle s’est accrochée aux billes. Ceci se produit pour les pH de 6,5 à 7,5. On suppose donc qu’à ces pH, sa charge globale est négative. Il est logique qu’en augmentant le pH, on crée des charges négatives sur la protéine (la fonction -COOH s’ionisant en -COO-) et que l’on supprime des charges positives (les groupements –NH3+ perdant un proton pour redonner la fonction amine –NH2)
2) Pour la chromatographie, devriez-vous choisir un pH auquel la protéine se lie aux billes (pH 6,5 à 7,5) ou un pH auquel elle ne se lie pas (pH 5,0 à 6,0) ? Expliquez votre choix.
On choisit un pH pour lequel la protéine se lie aux billes : ainsi, toutes les protéines qui ne s’y lient pas traverseront la colonne et seront éliminées. On décrochera la protéine de la colonne dans un second temps. La protéine recherchée ne sera pas pure pour autant : il restera toutes les autres protéines qui se lient aux billes comme elle.
3) Devriez-vous choisir un pH proche de la frontière (c’est-à-dire 6,0 ou 6,5) ou éloigné de la frontière (c’est-à-dire 5,0 ou 7,5) ? Expliquez votre raisonnement. (indice : raisonnez en termes de « force » de liaison de la protéine à la colonne)
Mieux vaut choisir un pH « proche de la frontière » (soit 6,0). Ainsi, la protéine ne sera pas trop difficile à décrocher lors de l’élution. Mieux vaut éviter de soumettre la protéine à une trop large gamme de pH pour ne pas la dénaturer.
4) Comment allez-vous mener la chromatographie par échange d’ions de votre mélange pour purifier la protéine X ? Détaillez les étapes.
Tamponner l’extrait protéique brut à pH 6,5. Le faire passer sur la colonne, jeter le filtrat ; réaliser un ou deux lavages avec un tampon de pH 6,5 et jeter les filtrats ; décrocher la protéine de la colonne avec un tampon d’élution de pH = 6,0 et récupérer l’éluat.
Figure 7 : A gauche, bille de sépharose greffée avec du DEAE (di-éthyl-amino-éthanol). Ce DEAE- sépharose est une résine échangeuse d’ions. A droite, expérience visant à déterminer les conditions de l’accrochage de la protéine X à la résine. On note pour chaque tube, donc pour chaque pH, si la protéine X est encore présente dans le surnageant.
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Synthèse : la purification d’une enzyme
La purification d’une protéine nécessite généralement de multiples étapes et implique souvent plusieurs types de colonnes de chromatographie. Pour réaliser une purification, il faut pouvoir contrôler la présence de la protéine désirée. Ce contrôle peut passer par la mise en évidence d’une bande sur un gel d’électrophorèse, d’une structure en microscopie électronique, d’une capacité de liaison à une autre molécule ou d’une activité enzymatique.
On se place ici dans ce dernier cas : on essaie de purifier une mystérieuse enzyme X dont on sait doser l’activité.
Le tableau 2 présente les étapes de cette purification. Le volume total, la quantité totale de protéines, l’activité enzymatique X et l’activité spécifique X sont donnés à chaque étape.
A) Qu’est-ce qui vous permet de dire que la purification a avancé à chaque étape ?
Le critère de progrès de la purification est l’augmentation de l’activité spécifique. Si par exemple, à l’issue d’une étape de purification, on conserve la même activité enzymatique, mais qu’il y a moins de protéines totales qu’à l’étape précédente, on a une activité spécifique plus élevée. On conclut que la part de l’enzyme dans le mélange protéique augmente : on a gardé toute l’enzyme mais l’on s’est débarrassé d’autres protéines. En général, on perd un peu de l’enzyme à chaque étape, c’est inévitable, mais on perd davantage des autres protéines, ce qui fait que l’enzyme est plus pure : l’activité diminue, l’activité spécifique augmente.
B) Laquelle des étapes de purification a été la plus efficace ? Laquelle a été la moins efficace ?
L’étape la plus efficace est la dernière (chromatographie d’affinité) car l’on passe d’une activité spécifique de 875 U/mg à une activité spécifique de 15 000 U/mg, soit un facteur d’accroissement de x17. La moins efficace est la première (précipitation au sulfate d’ammonium : facteur de x3,5).
C) Si vous deviez continuer la purification à travers de nouvelles étapes, de quelle manière l’activité spécifique changerait-elle ? Comment pourriez-vous dire d’après les mesures de l’activité spécifique que l’enzyme est enfin pure ? Comment pourriez-vous vérifier cette conclusion ?
Si l’on progresse dans la purification de l’enzyme, l’activité spécifique ne peut qu’augmenter (puisque la part de l’enzyme dans 1 mg de protéines totales ne fait qu’augmenter). Si l’enzyme est enfin pure, alors l’activité reste constante à sa valeur maximale, puisqu’il n’y a plus d’autres protéines que l’enzyme dans le tube. Un dépôt sur gel d’électrophorèse permettrait de vérifier qu’on n’observe plus qu’une bande (correspondant à l’enzyme).
D) Supposons que l’enzyme soit pure à la fin de la dernière étape de purification dans le tableau : combien de mg d’enzyme seraient alors présents dans l’extrait brut de départ ? Quelle proportion des protéines totales représenterait alors l’enzyme X dans l’extrait brut (donc dans la cellule) ?
Si l’enzyme est pure à 15 000 unités par mg de protéines totales, alors on a 15 000 unités
d’activité enzymatique pour 1 mg d’enzyme. Comme on mesure une activité de 75 000
unités dans le tube, c’est que l’on a 5 mg d’enzyme (5 x 15 000 = 75 000). Dans l’extrait de
départ, on avait mesuré une activité de 150 000 unités, soit le double : il y avait donc 2x5 =
10 mg d’enzyme, parmi les 15 000 mg de protéines diverses. Soit 0,07% … Ceci est normal
car il y a des dizaines de milliers de protéines différentes, plus ou moins abondantes.
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Procédure Volume
total de solution (en mL)
Quantité totale de protéines
(en mg)
Activité enzymatique X totale (en unités)
Activité spécifique (en unités / mg de protéines totales)
Extrait brut 2 000 15 000 150 000 10
Précipitation au sulfate
d’ammonium
320 4 000 140 000 35
Chromatographie échangeuse d’ions
100 550 125 000 227
Chromatographie par filtration sur gel
85 120 105 000 875
Chromatographie d’affinité
8 5 75 000 15 000
Tableau 2 : étapes de la purification de l’enzyme X
Synthèse : la purification d’une hexokinase de rat (G2E 2006) L’hexokinase est une enzyme qui catalyse la réaction :
Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP
Une hexokinase a été purifiée à partir de muscle de rat. Cette purification a eu lieu en 6 étapes :
1. Extraction et centrifugation
2. Chromatographie échangeuse d’ions : DEAE-Cellulose, chargée + 3. Chromatographie échangeuse d’ions : DEAE-Séphadex, chargée +
4. Chromatographie d’affinité : Sépharose greffé avec un dérivé de glucosamine
5. Concentration sur colonne DEAE-Cellulose et chromatographie d’exclusion (Séphadex G-200)
6. Concentration sur colonne DEAE-Cellulose
Les résultats des différentes étapes de purification sont donnés dans le tableau 3 et sur la figure 8 (dépôt sur gel d’électrophorèse après chaque étape).
Etape Volume solution (mL)
Concentration en protéines totales (mg/mL)
Activité hexokinase (unités)
Activité spécifique (unités / mg)
Facteur de purification (n/n-1)
1 2300 66,0 1000 6,6 10
-3-
2 356 4,7 980 0,58 87,9
3 280 0,8 700 3,12 5,4
4 138 0,03 600 144,93 46,5
5 146 0,01 490 335,62 2,3
6 16 0,14 480 214,28 0,6
Tableau 3 : Etapes de purification de l’hexokinase II de rat
9 Figure 8 : électrophorèse sur gel de polyacrylamide après dénaturation au SDS (SDS-PAGE) pour les étapes de purification du tableau 2. Holroyde & Trayer, FEBS letter, 1976 62, 215-219
1) Calculez l’activité spécifique à chaque étape de purification.
Pour calculer l’activité spécifique (c’est-à-dire l’activité enzymatique par mg de protéines présentes), on divise l’activité enzymatique mesurée dans l’extrait par la quantité de protéines présentes. Celle-ci se trouve en multipliant la concentration en protéines totales par le volume. En résumé, Activité spécifique = Activité / (concentration protéique x volume).
2) Calculez, pour deux étapes successives, le facteur de purification, c’est-à-dire le rapport des activités spécifiques obtenues à l’issue de ces étapes.
Le facteur de purification, à une étape donnée (sauf la première), s’obtient en divisant l’activité spécifique obtenue à l’issue de cette étape par celle obtenue à l’issue de l’étape précédente. Il indique par quel facteur on a enrichi l’enzyme parmi les autres protéines.
3) Utilisez ces calculs pour dire l’étape au cours de laquelle on a le plus purifié l’hexokinase.
La majeure partie de la purification a lieu à l’étape 2, lors de la collecte de la fraction contenant l’activité hexokinase après un premier passage sur colonne (augmentation de l’activité spécifique d’un facteur 100X) ; puis lors de la chromatographie d’affinité à l’étape 4 (facteur 50X), qui utilise la glucosamine comme « hameçon » pour retenir spécifiquement l’enzyme sur la colonne (après quoi on décroche les protéines retenues sur la colonne).
4) Votre réponse est-elle cohérente avec l’électrophorèse ?
On constate qu’entre l’étape 3 et l’étape 4, on passe d’un « smear » (nombreuses protéines présentes) à une bande unique (ou du moins majoritaire), correspondant à l’hexokinase.
Toutefois, la purification n’est pas achevée à ce stade, puisqu’on double l’activité spécifique à l’étape 5 (peut-être s’est-on débarrassé de protéines qui migraient à la même hauteur que l’enzyme). Les pistes 1 et 2 sont moins faciles à expliquer : il devrait y avoir moins de protéines dans la 2 que dans la 1. Peut être la piste 2 et suivantes correspondent elles à un zoom ? ou bien la piste 1 est tellement chargée que les agrégats qui se forment ne migrent pas normalement.
5) L’étape 4 est une chromatographie d’affinité : pourquoi greffe-t-on la colonne avec un dérivé de glucosamine (glucose avec fonction amine) pour purifier l’hexokinase ?
La glucosamine ressemble beaucoup au glucose, qui est le substrat de l’hexokinase. Une enzyme reconnait son substrat grâce à la structure 3D de son site actif, où le substrat vient se loger. La glucosamine est donc comme un hameçon auquel l’enzyme se lie spécifiquement (mais qu’elle ne transforme pas en glucose 6 phosphate).
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