DE LA RECHERCHE À L INDUSTRIE

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DE LA RECHERCHE À L’INDUSTRIE

u Développement de tests de diagnostic pour la COVID-19

u Congrès de la Société Française de Médecine de Catastrophe – Nice - 3 octobre 2020

u Laurent Bellanger, Laboratoire innovations technologiques pour la détection et le diagnostic

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Quels sont les besoins adaptés au contexte et aux objectifs ?

• Tests pour laboratoires centralisés, laboratoires de référence, CNR.

• Tests pour laboratoire de proximité, laboratoires mobiles.

• Tests de terrain.

• Tests rapides, tests au pied du malade (TDR).

Connaissance de l’agent infectieux ?

• Agent pathogène connu.

• Agent pathogène identifié mais nouveau.

• Agent pathogène inconnu.

Types de prélèvements pertinents ?

• Adaptation au contexte.

• Cinétique pour chaque type de prélèvement.

• Quantités à détecter selon type de prélèvement.

Tests diagnostiques pré-existants ?

• Validés ?

• Adaptés ?

• Disponibles ?

• Si pas de test ou kit, existence de réactifs ?

Contraintes risque biologique et réglementation

Emergence = situation imprévue = situation d’urgence  Réaction rapide et adaptée, nécessaire à tous les niveaux

Développement de tests diagnostiques dans un contexte d’émergence épidémique

Ebola 2014

 (CTE)



Sang, sérum



 qPCR

CNR

Laboratoires 1

fournisseur Très rares

P4, MOT

COVID-19

?

? ?





Ecouvillonnages NP, salive ?

?

1 qPCR développée par CNR Laboratoires des ESR & CHUCNR

À implémenter Réactifs SARS-CoV

P3

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Contexte de la crise de la COVID-19 et des premiers diagnostics

Ø Diffusion très rapide de l’information scientifique initiale

Reusken C et al, Euro Surveill. 2020;25(6)

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Emergence du SARS-CoV2 – Données scientifiques initiales

80 % d’homologie entre les génomes du SARS-CoV et celui du SARS-CoV2

(Rev Med Virol. 2020;30:e2106)

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« Cinétique des marqueurs » pour le diagnostic de la COVID-19

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Techniques (matures) utilisables…

Détection du génome viral (test moléculaire)

RT-qPCR manuelle (test de référence) RT-qPCR automatisée

RT-qPCR rapide

PCRs isothermes LAMP, RPA…

Détection des anticorps (test sérologique) ELISA manuels

ELISA automatisés TDR

TROD

Détection du virus (test antigénique) ELISA manuels ECL automatisés TDR

TROD

Réactifs génériques : kits extraction ARN enzymes, mix PCR.

Réactifs spécifiques : Sondes et amorces nucléotidiques Délai de mise au point des réactifs spécifiques : semaines Rendu de résultats : 1 à 5 heures, 30 min LAMP

Réactifs génériques : Anticorps anti-IgM humains Anticorps anti-IgG humains Réactifs spécifiques : Protéines virales

Délai de mise au point des réactifs spécifiques : mois Rendu de résultats : 15 min (TDR) à 2 heures (ELISA)

Réactifs spécifiques : Anticorps monoclonaux

Délai de mise au point des réactifs spécifiques : 5-6 mois Rendu de résultats : 15 min (TDR) à 2 heures (ELISA)

Amplification Immuno-détection

(Réactifs critiques)

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2- Extraction des ARN

3- RT-qPCR 1- Prélèvement

RT-qPCR

Gène n°1 Gène n°2

Seuil

Nombre de cycles d’amplification

Reverse transcriptase (RT)

Master Mix

Taq DNA, dNTP, fluorophore

Test de référence RT-qPCR (Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction)

Ct Ct

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Développement d’un test (manuel)

1 : Bio-informatique

• Analyse des génomes et sélection des meilleurs loci pour les sondes et amorces

• Design des sondes et amorces

• Contrôle in silico de la spécificité

2 : Développement des tests simplex

• Sélection du meilleur mix PCR

• Définition des contrôles positifs

• Définition des seuils analytiques

• Contrôle de la stabilité des réactifs

3 : Développement des test multiplex

• Choix de fluorophores compatibles

• Contrôle des spécificités croisées

4 : Validation analytique sur des échantillons réels

2 à 3 se m ain es (te sts d e la bo ra to ire )

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Les premiers kits RT-qPCR évalués

(van Kasteren P.B. et al., bioRxiv, April 24)

Sensibilité aux mutations à suivre attentivement

(E. Callaway Nature, 585, Sept 2020)

Mutations observées ?

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PCR rapide (tests unitaires – systèmes fermés PCR)

Xpert Xpress® SARS-CoV-2 (Cepheid, CA):

Résultats ≈ 45 min

Sensibilité à 97,4%. Spécificité à 99,4%1

Type d'échantillon : écouvillonage nasopharyngé (ENP) dans 3mL max. de milieu de transport

Film Array® Biomérieux Résultats ≈ 60 minutes

2 exemples (disponibles en France)

(Biomérieux)

(Biomérieux) (Cepheid)

(Cepheid)

(Smithgall M.C. et al., bioRxiv, April 25)

100 % de concordance avec Cobas® Roche pour tout type d’échantillons

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PCR rapide (L oop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)

N. L’Helgouach, medRxiv April 2020

Amplification isotherme à 65°C

Test validé pour une utilisation sur prélèvements de salive de patients symptomatiques

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Tests rapides sérologiques

Nécessite de produire et purifier (2-3 mois) les protéines virales cibles des anticorps ou d’acheter ces protéines (2500 à 4000 €/mg).

Développement du test environ 2 mois

L. Dortet et al, Emerging Microbes & Infections 2020

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Au sein de ces études, les taux de sensibilité des tests sérologiques de type ELISA pour les IgG, IgM ou IgG et IgM variaient selon les études entre 75 et 93 %, tandis que pour les tests rapides, ils variaient entre 36 et 100 %.

Les taux de spécificité rapportés dans ces études étaient du même ordre entre les tests sérologiques de type ELISA (91,9 à 100 %) et les tests rapides (89 et 100 %).

La seule étude évaluant la spécificité des tests sérologiques de type ELISA pour les IgA rapportait une spécificité de 73 %.

Par conséquent, du fait de la grande hétérogénéité de ces études tant au niveau de leurs conceptions que de leurs résultats, il n’est pas possible de conclure sur la base des résultats de ces dernières sur l’utilité clinique des tests d’anticorps rapides dans leur globalité dans ce contexte d’urgence sanitaire.

Validé par le Collège le 14 mai 2020

Tests rapides sérologiques, rapport de l’HAS d’avril 2020

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Test rapide antigénique (immunochromatographie)

q Nécessite le développement d’anticorps monoclonaux (5 à 6 mois)

q Les premiers tests développés utilisent des anticorps anti-SARS-CoV d’origine chinoise « réorientés ».

q Développement en urgence d’anticorps monoclonaux anti-SARS-CoV2 issus d’une filière nationale (disponibles depuis fin août).

Ø Sélection des meilleurs anticorps :

Tests autorisés le 16 septembre 2020

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Test rapide antigénique

Tests autorisés le 16 septembre 2020

SD Biosensor (Roche) : Sensibilité 96.5 % Spécificité 99.7 % AAZ (Nephrotek) Sensibilité 93 %

Spécificité 98 % Binax* (Abbott) Sensibilité env 95 %

… la Haute Autorité de santé est favorable à l’inscription de la détection antigénique du virus SARSCoV-2 sur prélèvement nasopharyngé sur la liste des actes et prestations, mentionnée à l’article L. 162-1-7 du code de la sécurité sociale (service attendu suffisant et amélioration du service attendu de niveau IV) dans l’indication de diagnostic des patients symptomatiques jusqu’à 7 jours après apparition des symptômes, en alternative à la RT-PCR sur prélèvement nasopharyngé ou salivaire, si le test utilisé présente une sensibilité clinique supérieure ou égale à 80 % (en accord avec la valeur proposée par l’Organisation Mondiale de la Santé) et une spécificité clinique supérieure ou égale à 99% (afin de limiter les réactions croisées avec les autres virus hivernaux).

Les performances cliniques du test (sensibilité/spécificité) doivent être établies par le fabricant sur la base d’une étude clinique prospective comparative portant sur une série d’individus de statut inconnu (vis-à-vis de l’infection au SARS-CoV-2) recrutés consécutivement ou de manière aléatoire. …

… Les résultats du test index devront être déterminés en aveugle des résultats du test de référence….

… Le test utilisé lors de la détection antigénique du SARS-CoV-2 doit être marqué CE.

Evaluations menées par les fabricants sur sujets symptomatiques

Avis n° 2020.0050/AC/SEAP du 24 septembre 2020 du collège de la Haute Autorité de santé relatif à l’inscription sur la liste des actes et prestations mentionnée à l’article L. 162-1-7 du code de la sécurité sociale, de la détection antigénique du virus SARS-CoV-2 sur prélèvement nasopharyngé (extrait)

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CONCLUSIONS

Les tests de références restent ceux mettant en œuvre la RT-qPCR, ils présentent la meilleure sensibilité.

Ils peuvent rester positifs au-delà de la présence de virus infectieux.

Il est possible d’augmenter les débits de ces tests en utilisant des automates d’extraction et/ou d’analyse

ü Ces tests sont adaptés aux laboratoires et aux gros plateaux techniques.

« Décentralisation » possible des analyses

• RT-qPCR en cartouches intérgrées (test unitaire), systèmes transportables, tests par panel, sensibilité identique à RT-qPCR mais débits plus faibles et cout très élevé.

• PCR rapides isotherme (LAMP) validés sur prélèvements salivaires, sensibilité plus faible que RT-qPCR à réserver aux patients symptomatiques.

• Tests antigéniques rapides, sensibilité plus faible que RT-qPCR à réserver aux patients symptomatiques.

Ces tests rapides doivent être clairement intégrés dans la chaine diagnostique avec une doctrine d’emploi clairement établie (à clarifier dans l’usage).

• Définition claire de leur doctrine d’emploi dans la chaine diagnostique.

• Nécessité d’une évaluation précise de leurs performances.

• Toute comparaison doit être établie sur le même panel d’échantillons.

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PERSPECTIVES

Pour le diagnostic du futur près des patients…

ü Aujourd’hui, il y a un effet de levier important des financements dédiés à la recherche pour la gestion de la crise qui entraine une émergence de projets à bas TRL visant au développement de nouvelles méthodes de diagnostic associant les nouvelles technologies

- Micro-fluidique

- Nano-capteurs

- Micro-électronique

- …

Ø Effet bénéfique à moyen terme.

Ø Le temps de la recherche est souvent un temps long, il faudra soutenir ces projets sur la durée…

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Commissariat à l’énergie atomique et aux énergies alternatives - www.cea.fr