Thesis
Reference
Analyse protéomique des granules de sécrétion à insuline : identification de la ProSAAS
BRUNNER, Yannick
Abstract
Le but de cette thèse a été d'établir le protéome des granules à insuline. Cette analyse protéomique a permis de mettre en évidence pour la première fois la présence de Rab37, de VAMP8 et de la ProSAAS, au niveau des granules à insuline. Nous avons également mis en évidence la présence au niveau des granules à insuline de plusieurs enzymes lysosomales, suggérant un lien entre les granules à insuline et les lysosomes. Nous avons également étudié les modifications quantitatives du protéome des granules à insuline en réponse à une hyperglycémie chronique. Cette étude a permis d'identifier un certain nombre de protéines dont l'expression est modifiée par une hyperglycémie chronique. Nous avons ensuite confirmé la modulation de l'expression d'une de ces protéines, la ProSAAS, en réponse à diverses concentrations de glucose. Enfin, des expériences préliminaires ont été menées afin de tester le rôle de la ProSAAS dans la sécrétion d'insuline.
BRUNNER, Yannick. Analyse protéomique des granules de sécrétion à insuline : identification de la ProSAAS. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2008, no. Sc. 3999
URN : urn:nbn:ch:unige-6246
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:624
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:624
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UNIVERSITE DE GENEVE
Département de biologie cellulaire FACULTE DES SCIENCES
Professeur Jean-Claude Martinou
Département de Biologie Structurale FACULTE DE MEDECINE
et Bioinformatique Professeur Denis Hochtrasser
Docteur Jean-Charles Sanchez
Analyse protéomique des granules de sécrétion à insuline:
identification de la ProSAAS
THÈSE
présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologie
par
Yannick BRUNNER de
Chêne-Bougeries (GE)
Thèse n°3999
GENEVE
Atelier de reproduction de la Section de physique 2008
Analyse protéomique des granules de sécrétion à insuline:
Identification de la ProSAAS RESUME:
Le diabète est une pathologie caractérisée par une concentration de glucose dans le sang (glycémie) trop élevée. L’insuline est une des principales hormones impliquées dans le contrôle de la glycémie, puisqu’elle permet aux cellules de pouvoir assimiler et stocker le glucose présent dans le sang, en vue d’une utilisation ultérieure. Lors de troubles de la sécrétion ou de l’action de l’insuline, le glucose sanguin ne pourra plus être capté par les cellules, provoquant ainsi une augmentation importante de la glycémie et l’apparition du diabète.
Les granules à insuline sont des organelles intracellulaires de environ 300 nanomètres de diamètre, localisées dans les cellules β du pancréas et permettant la libération d’insuline par exocytose. Chaque cellule β contient approximativement 10’000 granules à insuline. Au début de ce travail de thèse, seule une trentaine de protéines des granules à insuline, ou associées avec celles-ci avaient été identifiées. Cependant, il a été mis en évidence, principalement grâce à la technique de l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE), que ces granules contiennent potentiellement plus de 150 polypeptides différents, dont les identités et les fonctions physiologiques étaient pour la plupart inconnues.
Le but premier de cette thèse a donc été d’établir le protéome des granules à insuline. Cette analyse protéomique a permis de mettre en évidence pour la première fois la présence de Rab37, de VAMP8 et de la ProSAAS, au niveau des granules à insuline. Nous avons également mis en évidence la présence au niveau des granules à insuline de plusieurs enzymes lysosomales, suggérant un lien entre les granules à insuline et les lysosomes.
Dans un deuxième temps, nous avons étudié les modifications quantitatives du protéome des granules à insuline en réponse à une hyperglycémie chronique. Cette étude a permis d’identifier un certain nombre de protéines dont l’expression est modifiée par une hyperglycémie chronique.
Nous avons ensuite confirmé la modulation de l’expression d’une de ces protéines, la ProSAAS, en réponse à diverses concentrations de glucose. Enfin, des expériences préliminaires ont été menées afin de tester le rôle de la ProSAAS dans la sécrétion d’insuline.
REMERCIEMENTS:
J’aimerais tous d’abord remercier mes directeurs de thèse, le professeur Denis Hochstrasser et le docteur Jean-Charles Sanchez, pour m’avoir permis d’effectuer ce travail, tout au long duquel ils m’ont conseillé et guidé.
Je remercie également les professeurs Romano Regazzi et Jean-Claude Martinou pour avoir accepté de juger ce travail de thèse, respectivement en tant qu’expert externe à l’Université de Genève et répondant à la Faculté des Sciences.
Je remercie grandement le docteur Yohann Couté toujours disponible pour répondre à mes nombreuses questions et qui a grandement contribué à la réussite de ce travail de thèse.
Merci également au docteur Michelangelo Foti pour sa précieuse aide concernant la microscopie électronique ainsi qu’au professeur Claes Wollheim pour ses conseils avisés.
Je tiens encore à remercier tous les membres du BPRG pour leur soutien tout au long de ces quatre dernières années.
Finalement, j’aimerais remercier mes parents pour leur support et leurs encouragements tout au long de mes études, ainsi que Eva pour sa patience, sa compréhension et son amour.
ABBREVIATIONS:
2-DE Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis 2D-LC Two-dimensional liquid chromatography
ATP Adenosine triphosphate ADP Adenosine diphosphate ADN Acide desoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique
CID Collision-induced dissociation CRE cAMP-responsive elements ESI Electrospray ionization
EGFP Enhanced green fluorescent protein ICER Inducible cAMP early repressor IEF Isoelectric focusing
IRP Immediately releasable pool
iTRAQ Isobaric tags for relative and absolute quantitation pI Point isoélectrique
PC1 Prohormone convertase 1 POMC Proopiomelanocortin
GSI Granules de sécrétion à insuline
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
MS Mass spectrometry
MS/MS Tandem mass spectrometry OMS Organisation mondiale de la santé PMF Peptide mass fingerprint
PNS Post nuclear supernatant RT-PCR Real-time PCR
RRP Readily releasable pool SDS Sodium dodecyl sulfate
SILAC Stable isotope labeling with amino acids in cell culture siRNA Silencing RNA
TOF Time of flight
UV Ultraviolet
TABLE DES MATIERES
RESUME...i REMERCIEMENTS...ii ABBREVIATIONS ...iii CHAPITRE I: INTRODUCTION...p.1 1. Introduction au diabète... p.2
1.1. Les différents types de diabète ... p.3 2. La glucotoxicité... p.4 3. Les granules de sécrétion à insuline ... p.6 3.1. Mécanisme menant à la libération d’insuline... p.7 3.2. Biogénèse des granules à insuline ... p.7 3.3. Caractérisation des granules à insuline matures et immatures ... p.9 3.4. Existence de «pools» de granules à insuline ... p.10 3.5. Importance des granules à insuline ... p.12 4. Introduction à la protéomique ... p.13 4.1. Développement de la protéomique... p.13 4.2. Le sous-fractionnement cellulaire ... p.13 4.3. La séparation des protéines ... p.14 4.3.1. SDS-PAGE... p.14 4.3.2. Electrophorèse bidimensionnelle ... p.15 4.3.3. Détection des protéines séparées sur gel ... p.15 4.4. Identification des protéines par spectrométrie de masse ... p.16 4.4.1. Digestion des protéines ... p.16 4.4.2. Principes généraux de spectrométrie de masse ... p.16 4.4.3. Méthodes d’ionisations des protéines ... p.17 4.4.3.1. Ionisation par MALDI... p.17 4.4.3.2. Ionisation par électrospray ... p.18 4.4.4. Méthodes d’identification des protéines ... p.19 4.4.4.1. Identification par PMF ... p.19 4.4.4.2. Identification par spectrométrie de masse en tandem ... p.19 4.5. Méthodes de quantifications par spectrométrie de masse ... p.20 4.5.1. La quantification absolue ... p.20 4.5.2. La quantification relative ... p.20 4.5.3. La quantification non-isotopique ... p.21 5. Plan de recherche ... p.22 6. Références ... p.24
CHAPITRE II: Chapitre de livre: Proteomic: Beyond cDNA...p.31 CHAPITRE III: Revue: Glucotoxicity and pancreatic proteomics...p.75 CHAPITRE IV: Revue: Proteomics of secretory vesicles ...p.120 CHAPITRE V: Article: Proteomic analysis of insulin secretory granules ...p.162 CHAPITRE VI: Article: In-depth analysis of SILAC to study glucotoxicity
in ȕ-cells...p.198 CHAPITRE VII: Effect of chronic hyperglycaemia on insulin granule protein
expression: Identification of ProSAAS...p.210 CHAPITRE VIII: DISCUSSION ET PERSPECTIVES...p.244 1. Caractérisation du protéome des granules à insuline ... p.245 1.1. Isolation des granules à insuline... p.245 1.2. Validation de la localisation de certaines protéines identifiées par
spectrométrie de masse... p.246 2. Etude des modifications quantitatives du protéome des granules à insuline en
réponse à une hyperglycémie chronique ... p.247 2.1. Détermination des conditions de stimulation cellulaire ... p.247 2.2. Validation de la méthode du SILAC pour les cellules INS-1E... p.249 2.3. Stimulation des cellules INS-1E ... p.250 2.4. Identification des protéines différentiellement exprimées ... p.250 3. Etude de la ProSAAS ... p.250 3.1. Localisation de la ProSAAS... p.252 3.1.1. Immunofluorescence ... p.252 3.1.2. Immuno-microscopie électronique... p.252 3.2. Etude de l’expression de la ProSAAS en fonction de la concentration
de glucose ... p.253 3.3. Rôle biologique de la ProSAAS... p.253 4. Perspectives ... p.255 4.1. Identification de nouvelles protéines des granules à insulines... p.255 4.2. Modification du protéome des granules à insuline... p.255 4.3. Etude de la ProSAAS ... p.256 4.3.1. Localisation de la ProSAAS dans les cellules INS-1E ... p.256 4.3.2. Fonction biologique de la ProSAAS ... p.256 5. Conclusions ... p.259 6. Références ... p.260
CHAPITRE I: INTRODUCTION
CHAPITRE I: INTRODUCTION
1. Introduction au diabète:
Contrairement à ce que l'on pense généralement, le diabète est une maladie connue depuis très longtemps. Aussi loin que nous puissions remonter dans l'histoire de l'humanité et de la médecine, il semble qu’il y ait eu des signes de l'existence du diabète [1]. À la fin du 19ème siècle, des chercheurs se sont aperçus que le pancréas était responsable du contrôle de la concentration de sucre dans l’organisme. Ils notèrent qu'en enlevant le pancréas de chiens, ceux-ci devenaient diabétiques [2, 3]. À partir de ce moment, les scientifiques se mirent à la recherche de cette molécule appelée "Insuline", responsable de la régulation de la concentration de sucre dans le sang. En 1921, Frédéric Grant Banting et Charles Herbert Best réussirent à mettre au point une méthode de préparation d’extraits pancréatiques à la fois sûre et efficace pour la production d'insuline [2]. Cette découverte leur value le prix Nobel en 1923. Le 11 janvier 1922, de l'insuline fut injectée à Léonard Thompson, un garçon de 14 ans en état d'acidocétose [3].
L'insuline lui sauva la vie et depuis ce jour, des milliers d'êtres humains ont été traités avec de l'insuline porcine, puis plus récemment humaine, afin de contrôler leur diabète [4]. Cette découverte fut particulièrement importante pour les diabétiques de type 1 qui purent ainsi survivre à leur maladie.
Le diabète est une maladie touchant aujourd’hui plus de 170 millions de personnes dans le monde [5] (Figure 1). Des prévisions de l’OMS pour 2025 laissent à penser que plus de 300 millions de personnes seront alors atteintes du diabète [6]. Cette augmentation importante durant les prochaines années sera provoquée par la sédentarisation toujours plus importante de la population, par une suralimentation, mais également par l’allongement de la durée de vie. [7].
Figure 1: Estimation en 2001 du nombre (en millions) de personnes âgées de 20–79 ans atteint par le diabète Figure de Stumvoll et al. [8].
Le diabète peut se définir comme une perte de contrôle du taux de sucre dans le sang. Une des principales hormones responsables d'empêcher la glycémie de s'élever dans le sang est l'insuline.
Chez l’homme à jeun, on considère qu’une glycémie normale correspond à une concentration comprise entre 0,8 et 1.26 grammes de sucre par litre de sang (4,5mmol à 7mmol/l) [8].
Le sucre sanguin, qui correspond au glucose, est la source principale d'énergie pour l'ensemble des cellules de l'organisme et en particulier pour le cerveau. En cas de diabète, la pénétration du glucose dans les cellules est diminuée, provoquant une augmentation de la glycémie. Une forte concentration de glucose sanguin peut, à long terme, provoquer de graves conséquences, telles que la glycation de protéines capable de perturber l’activité biologique de ces dernières [9]. Les symptômes d’un diabète peuvent se présenter de différentes manières, tels que fatigue, difficulté de concentration, vision embrouillée, soif intense, miction fréquente, faim insatiable, perte de poids et faiblesse musculaire [10-12]. Certains de ces symptômes sont présents chez les patients souffrants de diabète dès le début de la maladie. Cependant, dans de nombreux cas, la maladie est asymptomatique durant de nombreuses années. Le diabète est alors dépisté lors d'un prélèvement sanguin [13]. Le dépistage précoce est d'une importance capitale puisque, à long terme, un diabète non traité peut provoquer diverses affections au niveau oculaire, rénal et cardio- vasculaire, telles que rétinopathies [14], hypertension artérielle [15] et néphropathies [16].
1.1. Les différents types de diabètes:
Le diabète se divise en deux types:
1) Le diabète de type 1 consiste en une destruction auto-immune des cellules β du pancréas.
L'âge du patient au début de la maladie peut varier de quelques mois jusqu'à environ 35 ans. Les causes de la maladie sont encore inexpliquées mais on suppose que des prédispositions génétiques favorisent son apparition. L’absence de production d'insuline par l’organisme nécessite des injections journalières d’insuline chez le patient atteint. Le diabète de type 1 représente 5% à 10% des patients diabétiques [17].
2) Le Diabète de type 2 quant à lui, est induit par une perte de contrôle de la glycémie et est souvent associée avec une obésité à prédominance familiale. Ce diabète résulte à la fois d'une perte d'efficacité de l'insuline et d'une baisse de sécrétion de l'insuline [18]. De nombreux débats ont eu lieu depuis plusieurs années afin de déterminer si la cause première de la perte de contrôle
de la glycémie est due à l’apparition d’une résistance à l’insuline de tissus cibles tels que le foie, les muscles ou le tissu adipeux, ou si elle est plutôt causée par une diminution de la quantité d’insuline sécrétée par les cellules ȕ [19]. Aujourd’hui, une des théories souvent avancées stipule qu’une des premières étapes impliquées dans l’apparition du diabète correspond à l’apparition d’une résistance progressive à l’insuline de tissus cibles, probablement dû à une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux telle que l’obésité [20, 21]. Afin de compenser cette résistance à l’insuline, les cellules ȕ du pancréas augmentent leur sécrétion d’insuline, provoquant ainsi une hyperinsulinémie [22]. Cependant, après un certain temps, les cellules ȕ ne sont plus capables d’adapter leur sécrétion d’insuline afin de contrebalancer la résistance à l’insuline. A partir de ce moment une hyperglycémie chronique s’installe menant à l’apparition d’un diabète [23, 24].
2. La glucotoxicité:
Une des conséquences néfaste la plus importante d’un diabète est la présence chronique de concentration élevée de glucose dans le sang. Cette toxicité biologique du glucose a été démontrée par de nombreuses études et a été nommée glucotoxicité [25]. Le rôle de la glucotoxicité dans l’apparition et le développement du diabète a été étudié depuis de nombreuses années. Aujourd’hui, il semble que la glucotoxicité ne soit pas impliquée dans l’apparition initiale d’un diabète mais en soit plutôt une des conséquences [26]. Cependant, il parait de plus en plus probable que la glucotoxicité joue également un rôle central dans l’évolution de la maladie. En effet, la glucotoxicité a été démontré comme induisant des dysfonctionnements importants de la sécrétion d’insuline par les cellules ȕ [27]. De ce fait, une hyperglycémie chronique induit probablement le début d’un cercle vicieux où la diminution de la sécrétion d’insuline par les cellules ȕ induit une augmentation de la glycémie, qui elle-même induit à son tour une aggravation des dysfonctionnements de la sécrétion d’insuline [28]. Au niveau clinique, il a été démontré que la normalisation précoce de la glycémie chez des patients diabétiques permet de retarder significativement l’évolution de la maladie [29]. En plus d’affecter le fonctionnement des cellules ȕ, l’hyperglycémie chronique induit également des troubles dans d’autres types cellulaires. En effet, il a été démontré qu’une hyperglycémie chronique affecte également la sécrétion du glucagon par les cellules Į pancréatiques [30]. Elle semble également jouer un rôle important dans l’aggravation de la résistance à l’insuline de certains tissus [31].
Enfin, l’hyperglycémie chronique est responsable des principales complications microvasculaires observées lors d’un diabète, telles que néphropathie, neuropathie ou rétinopathie. Elle est également impliquée dans les complications macrovasculaires dues au diabète, telles que
l’augmentation des risques d’incidents cardiovasculaires ou d’accidents vasculaires cérébrales [32].
Les mécanismes moléculaires de la glucotoxicité ont été longuement étudiés et de nombreux mécanismes ont été proposés. Aujourd’hui, plusieurs hypothèses sont toujours en vigueurs. Il a par exemple été démontré qu’une hyperglycémie chronique est capable d’induire l’activation de plusieurs protéines impliquées dans la réponse au stress du réticulum endoplasmique, telles que Bip, Grp94 ou Edem [33]. Dans les cellules ȕ pancréatiques, cette réponse pourrait être provoquée par une production excessive de proinsuline, ce qui engendrerait un dysfonctionnement de la machinerie du réticulum endoplasmique [34]. Un stress prolongé du réticulum endoplasmique lors d’une hyperglycémie, entraîne également l’expression de plusieurs protéines connues pour provoquer la voie de mort cellulaire par apoptose, telles que CHOP ou GADD34 [35].
Un second type de mécanisme mis en avant pour expliquer les effets délétères d’une hyperglycémie chronique correspond à l’induction d’un stress oxydatif, qui est responsable de la production excessive de radicaux libre. Ces derniers sont capables d’altérer le fonctionnement des protéines cellulaires et de l’ADN [36]. Les cellules du pancréas sont particulièrement sensibles au stress oxydatif, puisqu’elles ne possèdent naturellement qu’une faible quantité d’enzymes antioxydantes [37]. Il a été montré que les personnes diabétiques possèdent de fortes concentrations de marqueurs du stress oxydatif [38]. De plus, il a été prouvé que l’utilisation de molécules antioxydantes permets de protéger les cellules ȕ et les ilots pancréatiques des effets toxiques d’une hyperglycémie chronique [39].
Une hyperglycémie chronique provoque également une production excessive de calcium cytoplasmique. Ces concentrations élevées en calcium peuvent ensuite provoquer l’induction de la voie apoptotique, via la libération de cytochrome c par la mitochondrie [40, 41].
La glycation des protéines est probablement également impliquées dans les effets toxiques d’une hyperglycémie chronique. Il a par exemple été montré que la glycation de l’hémoglobine provoque d’importantes modifications de la structure et de la fonction de l’hémoglobine [42].
Cependant l’effet de la glycation de protéines sur les modifications des fonctions biologiques de ces dernières reste encore peu connu.
Enfin, il a été mis en évidence qu’une hyperglycémie chronique est capable de moduler l’expression de nombreux gènes. Ainsi, dans les cellules ȕ, une hyperglycémie chronique induit une surexpression de certains gènes pro-apoptotiques [43] mais également une sous-expression de plusieurs gènes impliqués dans la sécrétion d’insuline, tels que la glucokinase, Glut2 ou l’insuline [44].
3. Les granules de sécrétion à insuline:
Les Granules de Sécrétion à Insuline (GSI) sont des organelles intracellulaires d’approximativement 300 nanomètres de diamètre, responsables de la libération de l'insuline [45]. Elles sont localisées à l’intérieur des cellules β du pancréas, eux-mêmes regroupées dans les Ilots de Langerhans, qui ne représentent qu’une faible partie du pancréas (environ 1% en masse).
En plus des cellules β, les Ilots de Langerhans sont également composés de cellules α, des cellules γ et des cellules PP (Pancreatic Peptide), qui libèrent respectivement du glucagon, de la somatostatine et des peptides pancréatiques. Les cellules β représentent environ 70% de l’ensemble des cellules des Ilots de Langerhans, les 30% restants étant composés de cellules α, γ et PP [46].
Les GSI libèrent leur contenu par exocytose à partir des cellules β. Ce processus est hautement régulé dans 99% des cas [47]. Il existe également une sécrétion constitutive d’insuline permettant de maintenir constamment une concentration minimum d’insuline dans le sang. Le principal stimulant de l’exocytose des GSI est le glucose. Cependant, il existe d’autres stimulants possibles tels que certains acides aminés ou les acides gras [48, 49].
Les GSI sont au nombre d’environ 10000 dans une cellule β primaire et se divisent en deux classes selon l’étape de biogenèse à laquelle elles se trouvent: les granules immatures et les granules matures [50]. Il a été mis en évidence que les GSI contiennent en plus de l’insuline de nombreux autres polypeptides, tels que la preptine, dont l’action reste encore peu claire [51].
3.1. Mécanisme menant à la libération d’insuline:
Le processus menant à la libération d’insuline par les GSI est le suivant:
Peu après un repas, le taux de glucose extracellulaire augmente, ce qui permets une entrée de glucose à l’intérieur des cellules β, grâce à des transporteurs tels que GLUT-2. Le glucose est ensuite phosphorylé par une glucokinase, pour donner naissance à du glucose-6-phosphate qui est ensuite métabolisé, entraînant une variation dans le rapport ATP/ADP de la cellule β. Le changement du rapport ATP/ADP provoque la fermeture de canaux potassiques ATP-dépendants et empêche ainsi la sortie d’ions potassium. Cette fermeture induits une dépolarisation de la membrane plasmique, causant une ouverture de canaux calciques sensibles à cette dépolarisation, ce qui permet finalement une entrée de calcium à l’intérieur de la cellule. C’est cette entrée de calcium qui est l’événement principal qui permet d’induire la libération d’insuline via l’exocytose des GSI [52] (Figure 2).
Figure 2: Mécanisme principal contrôlant la sécrétion d’insuline. Figure modifiée à partir de Fujimoto et al. [53].
3.2. Biogénèse des granules à insuline:
Les GSI sont formées au niveau du réticulum endoplasmique. Elles traversent ensuite le réseau de l’appareil de Golgi pour donner naissance à des granules immatures. La principale caractéristique des granules à insuline immatures est qu’elles possèdent un manteau de clathrine.
En perdant ce manteau de clathrine (via la voie constitutive de dégradation), les granules deviennent matures et vont se regrouper pour former un «pool». Une partie de ce pool de granules à insuline peut être rapidement recrutée afin de fusionner avec la membrane plasmique, lors d’une entrée de calcium [54] (figure 3 et 6).
Figure 3: Présentation de la voie de sécrétion constitutive et régulée des vésicules sécrétoires. Figure de Kim et al.
[55].
Les granules à insuline immatures pourraient être un centre de triage pour l’acheminement des diverses protéines cellulaires à leurs lieus de destinations finales. Traditionnellement, le triage des différentes protéines cellulaires s’effectue au niveau du trans-Golgi. Ce type de triage a été nommé «sorting for entry». Cependant dans certains types de cellules endocrines et neuroendocrines, il semble que le lieu de triage des protéines cellulaires pourrait plutôt se trouver au niveau des granules immatures. Ce mécanisme a été nommé «sorting by retention» [56]
(figure 4).
Figure 4: Présentation de deux modèles possibles, lors de la biogenèse des vésicules de sécrétion.
Figure de Tooze et al. [56].
3.3. Caractérisation des granules à insuline matures et immatures:
En plus de leur manteau de clathrine, les granules à insuline immatures se différencient également des granules à insuline matures par leur contenu intragranulaire. En effet, lors du passage du stade immature à mature, la proinsuline (~9kDa) contenue dans les granules immatures va, sous l’effet d'endoprotéases, donner naissance à l’insuline (~6kDa) et au peptide C. L’activation d'endoprotéases comme la PC 1 (Prohormone convertase 1) et la PC 2 (Prohormone convertase 2) est due à une acidification de la matrice granulaire [57]. Cette acidification se produit grâce à des canaux chloriques et à des pompes à protons (V-ATPase) qui permettent une entrée de protons et d’ions chlorures à l’intérieur des GSI [58]. Une fois produite, l’insuline est stockée dans les granules matures sous forme d’hexamères autour de deux atomes de zinc [54, 58]. En accord avec l’hypothèse du «sorting by retention», d’autres protéines ont également été montrées comme étant présentes dans les granules à insuline immatures mais absentes des granules à insuline matures. Ainsi, il a pu être mis en évidence que la syntaxine 6, une protéine transmembranaire impliquée dans la fusion homotypique des granules immatures des cellules PC12 [59], n’est détectée que dans les granules à insuline immatures des cellules ȕ.
Il a également été démontré que le récepteur du mannose-6-phosphate ainsi que la cathepsine B sont présents dans les granules à insuline immatures mais absents des granules à insuline matures
[60, 61] (Figure 5). Le temps de demi-vie pour la conversion des granules immatures en granules matures est estimé à environ 45 minutes [59, 62].
Figure 5: Double immuno-marquages de la proinsuline et de la cathepsine B en microscopie électronique montrant la présence de la cathepsine B dans les granules à insuline immature (i). Au contraire très peu de cathepsine B est retrouvée dans les granules à insuline mature (M). Figure de Kuliawat et al. [61].
3.4. Existence de «pools» de granules à insuline:
Les granules à insuline sont regroupées dans différents «pools». En effet, seule une partie des granules à insuline (environ 5%) est capable de fusionner rapidement avec la membrane plasmique lors d’une entrée de calcium. Ces granules sont regroupées dans ce que l’on appelle la RRP (Readily Releasable Pool). De plus, certaines GSI de la RRP sont groupées à proximité immédiate de canaux calciques dépendant du voltage (de type L), ce qui permets à ces granules de fusionner et de libérer l’insuline avec une très grande rapidité. Ces granules sont localisées dans ce que l’on appelle la IRP (Immediatly Releasable Pool) [63]. Les GSI de la RRP et de la IRP sont toutes deux connectées à la membrane plasmique via différentes protéines SNARE (Soluble NSF Attachment protein REceptor). Il est important de noter que plus de 95% des GSI ne font partie ni de la RRP ni de la IRP et ne sont donc pas capables de fusionner immédiatement lors d’une entrée de calcium. Ces granules font partie du «pool» de réserve de la cellule [64].
Les GSI de la IRP et dans une moindre mesure de la RRP, permettent une libération rapide d’insuline et correspondent à la première phase de sécrétion d’insuline observée lors d’une absorption de glucose. Cette première phase correspond à un pic de sécrétion d’insuline observé après quelques minutes dans les îlots de Langerhans de souris. Lors de ce premier pic, environ 50 GSI sont libérées, ce qui correspond à environ 12 millions de molécules d’insuline [63]. La
seconde phase de sécrétion d’insuline qui intervient plus tard, implique la mobilisation de granules à partir du «pool» de réserve et la formation de nouvelles GSI, ce qui explique le temps plus élevé nécessaire pour observer cette seconde phase. La mobilisation de granules à partir du
«pool» de réserve est vraisemblablement une étape ATP-dépendante [65].
Bien que les cellules β du pancréas possèdent moins de canaux calciques (<500) que d’autres types de cellules neuroendocrines (comme les cellules chromaffines adrénergiques), la fusion des GSI avec la membrane plasmique est efficace et très rapide (100 à 200 millisecondes) comparée à ces autres types de cellules [66]. Cette rapidité est due à un très bon couplage dans les cellules β, entre l’entrée du calcium et la libération de l’insuline par exocytose. Cette optimisation de la fusion des GSI est justement causée par l’existence de la IRP. En effet, les granules de la IRP sont non seulement très proches des canaux calciques mais on suppose qu’ils sont également physiquement liées avec ces canaux calciques, via différentes interactions protéiques. Plus précisément, c’est la sous unité α1-C des canaux calcique de type L qui va permettre de lier certaines GSI, afin que celles-ci soit rapidement exposées à une augmentation de la concentration calcique intracellulaire, permettant une libération rapide d’insuline [63].
Figure 6: A. Illustration des différents «pools» de granules à insuline B. Illustration des 2 phases de sécrétion d’insuline en réponse à une stimulation au glucose. Figure de Olofsson et al. [45].
Il a également été montré que les granules à insuline nouvellement formées sont préférentiellement recrutées dans le «pool» de RRP alors que les granules à insuline plus anciennes se trouvent plutôt localisées au niveau du cytoplasme dans le «pool» de réserve. Ce mécanisme pourrait permettre d’assurer une transmission rapide de l’information lors de la surexpression ou sous-expression de protéines des granules à insuline. Cette ségrégation des GSI serait également un avantage en cas de dégradation des protéines des granules à insuline au cours du temps [67]. Enfin, afin de maintenir un contenu en insuline constant, les granules à insuline les plus anciennes sont dégradées au cours d’un processus de fusion avec des lysosomes. Ce mécanisme de dégradation nommé crinophagie, semble être dépendant de la concentration de
glucose extracellulaire. En effet, à une faible concentration de glucose, on observe une importante dégradation d’insuline, alors qu’à de fortes concentrations de glucose cette dégradation est minime [68].
3.5. Importance des granules à insuline:
L’importance des protéines des granules à insuline dans le bon fonctionnement de la sécrétion d’insuline a été démontrée par plusieurs expériences. En effet, diverses études d’interférence à ARN et/ou de surexpression menées sur plusieurs protéines localisées au niveau des granules à insuline, ont montré une diminution significative de la sécrétion d’insuline par les cellules ȕ, lors d’une stimulation par le glucose. Parmi ces protéines, on peut citer différents isoformes de la synaptotagmine [69-71], Rab27a et sa protéine partenaire Slac2c/MyRIP [72], Rab3 et sa protéine partenaire RIM [73, 74], la myosine Va [75], Noc2 [76], la Granuphiline [77] et la tomosyn-1 [78]. De plus, il a été récemment démontré qu’une hyperglycémie chronique induit une diminution de l’expression de plusieurs de ces protéines (Rab27a, Rab3, Noc2 et Granuphilin) [79]. La même étude a également démontré que les gènes codants pour ces quatre protéines possèdent tous dans leur région promotrice un domaine CRE (cAMP-responsive elements) permettant l’attachement d’ICER (inducible cAMP early repressor), un inhibiteur de la transcription. La diminution de l’expression de Rab27a, Rab3, Noc2 et Granuphilin dans les cellules ȕ lors d’une hyperglycémie chronique, est accompagnée d’une augmentation de l’expression d’ICER. De plus, la diminution de l’expression d’ICER grâce à l’interférence à ARN, permet d’empêcher la diminution d’expression des quatre protéines susmentionnées, lors d’une hyperglycémie chronique. Enfin, la surexpression d’ICER a permis de montrer une importante diminution de la sécrétion d’insuline, en cas de stimulation des cellules ȕ avec du glucose [79].
Il semble également qu’un mécanisme permet de coupler la sécrétion des granules à insuline avec une augmentation de la production d’insuline. En effet, il a été montré que la région cytoplasmique d’une protéine transmembranaire des granules à insuline nommée ICA512, est clivée lors de l’exocytose. Le fragment cytosolique d’ICA512 est ensuite transloqué dans le noyau, où il va promouvoir l’expression d’insuline [80].
4. Introduction à la protéomique:
4.1. Développement de la protéomique:
Depuis de nombreuses années, des efforts importants ont été menés par de nombreux laboratoires afin de séquencer le génome de différents organismes. Aujourd’hui, on connaît le génome entier de plusieurs bactéries, de plantes, de la drosophile et de plusieurs mammifères dont l’homme [81]. Cependant, ces données brutes ne nous permettent pas de comprendre et d’interpréter la complexité des phénomènes biologiques. En effet, il reste encore beaucoup de travail afin de comprendre comment environ 25000 gènes chez l’homme peuvent donner naissance à probablement environ 100000 protéines [82, 83]. Cependant, l’utilisation du concept fondamental qu’est le protéome peut aider à cette compréhension. Le mot PROTEOME qui représente le lien entre les PROTEines et le génOME a été proposé par Marc Wilkins en 1996 [84]. C’est aujourd’hui un domaine de recherche en pleine expansion. Contrairement au génome, le protéome n’est pas constant dans un même organisme. En effet, il peut varier selon l’état de développement de l’organisme mais également selon l’environnement et les conditions dans lesquelles il se trouve. C’est pour ces raisons qu’un génome peut être représenté par plusieurs protéomes.
La protéomique est la science qui étudie l'ensemble des protéines d'un type cellulaire à un instant précis et sous des conditions définies. Un des avantages de la protéomique est l’analyse directe des molécules fonctionnelles et non du code source comme c’est le cas lors d’analyses génomiques. En effet, il a été montré que l’abondance et l’activité des protéines n’est pas corrélée à la quantité d’ARN messager [85]. Pour ces raisons, la protéomique est le complément idéal de la génomique. Cette technique basée sur la séparation, l’identification et la caractérisation des protéines peut également aider à la découverte de marqueurs moléculaires et de cibles thérapeutiques, dans le cas d’une affection donnée [86].
4.2. Le sous-fractionnement cellulaire:
Vu la complexité du mélange de protéines d'une cellule, il est souvent nécessaire avant une analyse protéomique de simplifier l’échantillon de départ. Une des méthodes souvent employées à cet effet est le sous-fractionnement cellulaire. L'enrichissement d’organelles par sous- fractionnement cellulaire tend à obtenir une préparation protéique homogène de particules sous- cellulaires, correspondant à une fonction cellulaire précise et par conséquent à un groupe de protéines simplifié par rapport aux protéines totales. La plupart des méthodes de sous- fractionnement cellulaire sont basées sur les différences de taille et de densité des différentes
structures sous-cellulaires. La première étape de cette méthode consiste en une disruption des cellules. Les diverses techniques de disruption cellulaire sont un compromis entre une lyse efficace de la cellule et la préservation de l'intégrité des organelles. Diverses méthodes sont utilisées selon le type de cellules utilisées et d'organelles à enrichir: cavitation à l'azote, ultrasons, potter, dounce, seringue [87, 88].
Une fois la disruption cellulaire obtenue, l'étape suivante consiste à séparer à partir d’un homogénat de cellules, les noyaux et les débris cellulaires des organelles cytoplasmiques. Cette première séparation s’effectue par centrifugation à basse vitesse afin de sédimenter les noyaux et les débris cellulaires, alors que les autres organelles intactes de la cellule reste dans le surnageant, appelé PNS (Post Nuclear Supernatant). Le PNS est ensuite soumis à différentes étapes de centrifugation dans des gradients de densité afin de séparer l’organelle d’intérêt des autres structures sous-cellulaires [71, 89]. L’approche du sous-fractionnement cellulaire a par exemple été utilisé afin d’étudier l’effet de différentes concentrations de glucose sur l’expression des protéines mitochondriales de cellules ȕ. Cette étude a permis de mettre en évidence plusieurs protéines dont l’expression est régulée par le glucose [90].
4.3. La séparation des protéines:
Les études protéomiques n'ont été rendues possibles que par le développement de techniques de séparation efficaces des protéines. Aujourd’hui, plusieurs approches sont utilisées, dont une des plus courantes est la séparation sur gel. Cette technique permet de séparer les protéines selon leurs poids moléculaire (SDS-PAGE) ou selon leurs points isoélectriques (IEF). Il est également possible de combiner ces deux types de séparation afin d’obtenir une séparation des protéines en deux dimensions (2-DE). Enfin, il existe également des moyens de séparation des protéines en milieu liquide utilisant des méthodes de chromatographies, telles que la 2D-LC [91].
4.3.1. SDS-PAGE:
La technique de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence d’un détergent ionique comme le SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) permet de séparer un mélange de polypeptides selon leurs tailles, que l’on peut considérer comme proportionnelle à leurs masses. La première étape consiste à dénaturer les polypeptides à une température de 100°C en présence de SDS et d’un agent réducteur afin de casser les ponts disulfures. Dans ces conditions, le SDS va se lier aux polypeptides avec un rapport masse de SDS sur masse du polypeptide approximativement constant (environ une molécule de SDS pour deux résidus d'acides aminés). La charge intrinsèque du polypeptide est alors négligeable par rapport aux charges négatives apportées par le SDS. Les
polypeptides migrent dans le gel de polyacrylamide proportionnellement au logarithme de leurs tailles lorsqu’ils sont soumis à un champ électrique [92].
4.3.2. Electrophorèse bidimensionnelle:
L’invention de l'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) a représenté une avancé majeure dans la séparation de mélanges complexes de protéines. Sous des conditions dénaturantes, on peut visualiser de façon distincte, sur un seul gel 2-DE, des milliers de polypeptides. La technique a été développée au même moment par trois groupes de chercheurs différents [93-95]. Lors d’une électrophorèse bidimensionnelle, la séparation s’effectue selon deux propriétés distinctes.
Premièrement, les différentes protéines sont séparées selon leurs points isoélectriques (pI) (première dimension). La focalisation isoélectrique (IEF) est une technique électrophorétique dans laquelle des composés amphotériques vont se séparer selon leurs points isoélectriques le long d’un gradient continu de pH [96]. Le point isoélectrique d’une protéine correspond au pH auquel la charge globale de la protéine est nulle. Lorsque la protéine atteint le pH qui correspond à son pI, la protéine n’est plus chargée et cesse donc de migrer. Aujourd’hui, la technique la plus utilisée pour la première dimension est la focalisation isoélectrique sur un gradient de pH immobilisé. Ce type de gradient est obtenu grâce à des acides et des bases faibles, polymérisés dans un gel d'acrylamide [97]. Après la séparation selon la première dimension, les polypeptides sont séparés selon leurs tailles par le principe du SDS-PAGE (seconde dimension).
4.3.3. Détection des protéines séparées sur gel:
Une fois les protéines séparées par 2-DE ou simplement par SDS-PAGE, les polypeptides peuvent être détectés par coloration, par radiation (pour les protéines marquées radioactivements) ou encore par immunologie. Une des colorations fréquemment utilisées est celles à l’argent.
Cette coloration est capable de détecter jusqu'à 1 nanogramme de protéines mais ne permet pas d’analyses ultérieures par spectrométrie de masse [98]. Il existe cependant une méthode à l’argent sans glutaraldéhyde, qui permet d’effectuer par la suite des analyses de spectrométrie de masse [99]. Ce type de coloration possède un seuil de détection protéique plus élevé que la coloration à l’argent classique. Le bleu de Coomassie est également un colorant très populaire mais est environ 50 fois moins sensible que l’argent standard [100]. D’autres méthodes existent basées sur la fluorescence (SyproRubis) ou la coloration négative avec du zinc [101, 102].
Suite à une coloration, les images des gels peuvent être numérisées, puis analysées grâce à des programmes informatiques développés afin d'effectuer des analyses quantitatives et des comparaisons automatiques de gels [103].
4.4. Identification des protéines par spectrométrie de masse:
Une fois les protéines séparées, l'étape suivante d’une analyse protéomique consiste en l’identification des protéines qui peut s’effectuer à travers plusieurs techniques, telles que la dégradation d’Edmann ou la comparaison de positions sur un gel [104]. La récente avancée technologique de la spectrométrie de masse lui a permis de prendre une part de plus en plus importante dans l’identification des polypeptides, notamment grâce aux outils informatiques toujours plus rapides et performants [105].
4.4.1. Digestion des protéines:
Les techniques d’identification par spectrométrie de masse exigent au préalable que les protéines soient spécifiquement clivées en peptides. Dans le cas d’une séparation des protéines par gel, ces digestions se déroulent dans la plupart des cas à l’intérieur du gel après excision des bandes ou des spots intéressants. Pour la digestion des protéines, la trypsine est l’enzyme la plus couramment utilisée en protéomique. Cette enzyme va couper les liaisons peptidiques du côté C-terminal des résidus lysine et arginine, lorsque ceux-ci ne sont pas suivis d’une proline. D'autres enzymes possédants des spécificités différentes sont également utilisés, de même que certains clivages chimiques [106-108].
4.4.2. Principe généraux de spectrométrie de masse:
La spectrométrie de masse a déjà une longue histoire derrière elle, puisqu’elle fut développée il y a 1 siècle déjà. Cependant, celle-ci n’a commencé à jouer un rôle central dans les sciences de la vie qu’au début des années 1990 [109, 110]. Le principe de base de tous les spectromètres de masse est la mesure du rapport masse sur charge d'un ion (m/z). La spectrométrie de masse convient très bien pour des molécules chimiques de petites tailles et a été utilisée en chimie organique depuis fort longtemps [111]. Au contraire, les molécules biologiques étant souvent grandes et polaires, il était difficile d’obtenir des ions en phase gazeuse à partir de ces molécules.
Le développement de méthodes nouvelles permettant d’ioniser des biomolécules sans les fragmenter a ouvert le champ de la spectrométrie de masse à celles-ci. Il existe différents types de spectromètres de masse. Ceux-ci diffèrent entre eux par la technique d’ionisation utilisée mais également par la méthode de détermination du rapport m/z. L'introduction d’un échantillon de protéines dans un spectromètre de masse s’effectue essentiellement selon deux principes différents. Le premier est l’ionisation par électrospray (ESI pour «ElectroSpray Ionisation»). Le second est l’ionisation laser assistée par matrice (MALDI pour «Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation»). Trois types principaux d’analyseurs ont été développés: la séparation
par un champ électrique produit par un quadrupôle (Q), la séparation basée sur le temps de vol d’un ion (TOF) et finalement la séparation sélective d’un ion par un puits de potentiel généré par un champ électrique (Ion Trap) [112].
4.4.3. Méthodes d’ionisation des protéines:
4.4.3.1. Ionisation par MALDI:
La technique d’ionisation par MALDI a été développée vers la fin des années 1980 [113]. Cette technique est très souvent combinée avec un analyseur de type TOF (MALDI-TOF). La préparation de l'échantillon consiste à co-cristalliser la substance à analyser avec une matrice organique. La matrice et l’échantillon à analyser sont dissous dans un solvant, puis déposés sur la cible MALDI. Enfin, le mélange est cristallisé par évaporation du solvant sous vide. La cible est ensuite bombardée brièvement par un laser UV pulsé (337 nm), provoquant une excitation de la matrice, qui lors de son retour à l’état fondamental va transférer de l’énergie à l’échantillon, provoquant sa désorption et sa ionisation. Cette étape de «bombardement» s’effectue sous un vide poussé. Différents types de matrice sont utilisés selon la nature de l’échantillon à analyser mais tous comprennent un cycle aromatique absorbant les rayonnements ultraviolet. Une des matrices souvent utilisée pour l’analyse de peptides de petite masse moléculaire est l’acide α- cyano-4-hydroxycinnamique [114]. Pour les polypeptides de masse plus élevée, on utilise de préférence l’acide sinapinique [115].
Dans un spectromètre de masse de type MALDI-TOF, les ions sont accélérés par un champ électrique, après avoir été ionisés. Le temps de vol des ions de la cible jusqu’ à un détecteur est mesuré, ce qui permets de déterminer la masse de ces ions. Plus le ion sera léger, plus il atteindra rapidement le détecteur. Deux innovations ont permis d’améliorer la résolution et la précision des mesures de temps de vol des ions. La première est l’utilisation du réflectron (ou miroir à ion) qui diminue la dispersion énergétique des ions. Le principe du réflectron consiste à décélérer les ions dans un champ électrique et de les renvoyer dans le sens opposé [112]. La deuxième est l'introduction d'un délai avant l’extraction des ions. Ce dernier permet un regroupement des ions avant leur accélération [116, 117]. L’introduction de ces deux techniques a conduit à une meilleure résolution des pics et à une réduction de l’erreur sur la mesure de m/z.
L’ionisation par MALDI crée essentiellement des ions monochargés MH+, dont les spectres sont plus simples et plus faciles à interpréter. Un autre avantage du MALDI est que celui-ci tolère une faible présence de sels dans le mélange matrice-analyte, ce qui évite des étapes de dessalement
longues et fastidieuses, lors desquelles du matériel est perdu. La sensibilité d’un spectromètre MALDI-TOF est de l’ordre du femtomole [118, 119].
Il a également été montré que la technique d’ionisation par MALDI est capable d’induire la fragmentation de certains ions en dehors de la source d’ionisation. Les spectres issus de ces fragmentations obtenues avec un spectromètre MALDI-TOF, permettent de déterminer une séquence partielle d’un peptide ou sa séquence complète [120, 121]. La fragmentation se déroule fréquemment le long du squelette peptidique. La liaison peptidique entre le groupement -CO- et le groupement NH- est majoritairement rompue. Lors de cette rupture la charge est retenue soit du coté C-terminal soit du côté N-terminal [122].
4.4.3.2. Ionisation par électrospray:
L’électrospray (ESI) est une technique permettant l’ionisation de biomolécules de grandes tailles [123]. Contrairement à la technique du MALDI, l’analyse de l’échantillon se fait en solution, qui est introduite à l’intérieur de la source, par pompage à travers un capillaire avec un très faible débit. Une haute tension est appliquée sur le capillaire créant un cône d’éjection de gouttelettes (spray) de quelques micromètres. La formation de la goutte s’effectue à température ambiante et à pression ordinaire. L’action d’un gaz de désolvatation accompagnée de température élevée provoque ensuite l’évaporation partielle du solvant de l’échantillon. Les gouttelettes subissent ensuite une série de réactions coulombiennes qui aboutissent finalement à la formation d’ions complètement désolvatés. Ces ions seront ensuite accélérés et séparés dans un analyseur [124, 125]
La technique d’ionisation par électrospray est douce et ne provoque pas de fragmentation des ions. La technique d’ionisation par électrospray donne souvent naissance à des ions multichargés.
Cette technique convient à l’analyse de nombreux composés, comme des peptides, des oligonucléotides, des lipides et des sucres [123, 126].
Il existe une version alternative de l’électrospray appelée nanoélectrospray, dans laquelle le débit est très faible (environ 200 nanolitres par minute). La solution est placée directement dans le capillaire dans lequel la haute tension est appliquée. Cette tension suffit pour créer le spray [127].
La source d’électrospray peut être associée à plusieurs types d’analyseurs et est également compatible avec l’utilisation de deux analyseurs séparés par une chambre de collision (spectrométrie de masse en tandem ou MS/MS).
4.4.4. Méthodes d’identification des protéines:
4.4.4.1. Identification par PMF:
Une des premières méthodes d’identification des protéines par spectrométrie de masse a été le PMF (Peptide Mass Fingerprint). Cette méthode est basée sur l’analyse du ratio m/z des peptides obtenus après digestion de protéines avec une enzyme spécifique. La masse de chacun des peptides obtenus expérimentalement est ensuite comparée avec les masses théoriques des peptides que l’on obtiendrait si l’ensemble des protéines d’un organisme était digéré par la même enzyme qu’utilisée expérimentalement. Les peptides théoriques de la banque de données dont les masses sont le plus proche des masses expérimentales sont retenus par un logiciel qui va leur attribuer un score, proportionnel au degré de confiance de l’identification. Un des désavantages du PMF est que cette technique est limitée à un mélange de quelques protéines. En effet, un mélange plus complexe augmente fortement les possibilités d’erreurs lors de la comparaison des masses expérimentales et théoriques [128].
4.4.4.2. Identification par spectrométrie de masse en tandem:
Dans le cas de la spectrométrie de masse en tandem, un seul ion est sélectionné par un premier analyseur. Cet ion appelé ion parent, est ensuite envoyé dans une chambre de collision où la présence d’un gaz inerte comme l’hélium ou l’argon cause sa fragmentation. Le rapport m/z des ions résultants de cette fragmentation est alors mesuré par un deuxième analyseur. Les diverses fragmentations du ion parent se déroule préférentiellement le long du squelette peptidique au niveau de la liaison peptidique (Figure 7). Ainsi, la différence de masse entre deux ions adjacents correspond à la présence d’un acide aminé spécifique. La séquence du peptide peut ainsi être reconstruite grâce à la comparaison des masses entre les divers ions fragmentés. Par la suite, des programmes bioinformatiques permettent d’assigner une protéine à chaque peptide identifié, par comparaison avec des banques de données de protéines [129].
Figure 7: Nomenclature pour la fragmentation de peptides en spectrométrie de masse au niveau de la liaison peptidique. La fragmentation du peptide qui maintient la charge du côté C-terminal engendre des ions nommés ions- y et celle qui maintient la charge du côté N-terminal engendre des ions nommés ions-b.
4.5. Méthodes de quantifications par spectrométrie de masse:
Au-delà de l’identité d’une protéine, il peut aussi être important de connaître le taux d’expression de cette protéine dans un échantillon donné. Ces dernières années, plusieurs méthodes ont été développées afin de permettre la quantification de protéines en spectrométrie de masse.
4.5.1. La quantification absolue:
Deux méthodes de quantification par spectrométrie de masse peuvent être distinguées: la quantification absolue et la quantification relative. Dans le cas de la quantification absolue, un standard interne à la protéine d’intérêt possédant une concentration connue est ajouté dans l’échantillon. Le marquage du standard interne avec un isotope stable permet de le distinguer sur le spectre de masse par rapport à la protéine que l’on désire quantifier. La comparaison de l’intensité des pics correspondants au standard interne et à la protéine d’intérêt, permet ensuite de déterminer la concentration de cette protéine [130]. Le désavantage majeur de la quantification absolue est qu’elle requiert une connaissance préalable de la séquence de la protéine que l’on désir quantifier.
4.5.2. La quantification relative:
La quantification relative permet au contraire de la quantification absolue d’identifier et de quantifier plusieurs protéines simultanément, en comparant l’expression relative de protéines provenant au minimum de deux échantillons biologiques. Typiquement, un tissu provenant d’un organisme sain est comparé au même type de tissu provenant d’un organisme malade. Il est
COOH N
C C
H2N C C N C C N C
O O O
R1 R2 R3 R4
H H H H H H H
y3 y2 y1
b1 b2 b3
également possible de comparer l’expression de protéines provenant de cellules traitées ou non avec une drogue. Comme pour la quantification absolue, un marquage isotopique d’un des deux échantillons à quantifier est nécessaire, afin de pouvoir le distinguer en spectrométrie de masse [131]. Différents types de marquage isotopiques ont été développés. Le SILAC par exemple, a été spécifiquement développé pour le marquage des protéines provenant de lignées cellulaires. Il consiste à remplacer dans une population cellulaire, un acide aminé naturel du milieu de culture avec un isotope stable de cet acide aminé possédant par exemple des carbones-13 au lieu de carbone-12. Les protéines cellulaires sont ainsi marquées lors de l’incorporation de cet acide aminé isotopique. La seconde population de cellules est quant à elle cultivée avec un milieu de culture standard. Par la suite, il est possible de traiter spécifiquement une des deux populations de cellules de la manière désirée (avec une drogue par exemple), de la mélanger avec la population cellulaire non traitée et d’identifier par spectrométrie de masse les protéines différentiellement exprimées entre les deux populations de cellules [132]. D’autres types de marquages, nommés isobarique, ont été développés, tels que iTRAQ [133] ou le TMT [134]. Dans ce cas ce ne sont plus des acide aminés isotopiques qui seront incorporés aux cellules mais divers composés chimiques possédant chacun une masse différente et n’affectant pas le comportement des protéines marquées. L’incorporation aux protéines se déroule de manière chimique. L’avantage de ce types de marquage est qu’il permet de comparer jusqu’ à 10 échantillons simultanément [135].
4.5.3. La quantification non-isotopique:
Le développement récent de nouveaux spectromètres de masse d’une très grande précision à permis l’émergence de méthodes de quantification relative n’utilisant aucun marquage isotopique. Ces méthodes sont basées sur l’analyse d’un grand nombre de réplicas biologiques et techniques de chaque type d’échantillon à comparer, ce qui permet de déterminer avec une bonne confiance, des différences d’expressions de protéines entre plusieurs types d’échantillons [136, 137].
5. Plan de Recherche:
Comme nous avons pu le voire lors des paragraphes précédents, une hyperglycémie chronique est capable d’induire d’importantes perturbations de la sécrétion d’insuline. La modulation de l’expression de plusieurs protéines des cellules ȕ, lors d’une hyperglycémie chronique, pourrait expliquer cette toxicité du glucose [44].
Au niveau des granules de sécrétion à insuline, il est connu que certaines protéines de cette organelle jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la libération de l’insuline [71, 75]. De plus, il a été montré que le glucose est capable de moduler l’expression de certaines protéines des granules à insuline [79]. Cependant, au début de ce travail de thèse, les identités et les fonctions de nombreuses protéines des granules à insuline restaient inconnues, puisque seule une petite partie du protéome de cette organelle était connue.
Nous avons ainsi émis l’hypothèse que la modulation de l’expression de certaines protéines encore inconnues des granules à insuline, pourrait être en partie responsables des perturbations de la sécrétion d’insuline observées lors d’une hyperglycémie chronique.
Le but de ce travail de thèse a consisté à établir à partir de la lignée cellulaire ȕ INS-1E, l’identité des ces protéines, grâce à des techniques de spectrométries de masse et de biologie cellulaires et moléculaires.
Ce manuscrit de thèse se divise ainsi en 5 grandes parties:
1) Trois études bibliographiques correspondants à:
i) Chapitre II: Un chapitre de livre publié portant sur les différentes méthodes pouvant être employées lors d’analyses protéomiques.
ii) Chapitre III: Un manuscrit soumis pour publication portant sur les différents mécanismes impliqués dans le contrôle de la glycémie ainsi que dans le développement de la glucotoxicité.
Différents travaux publiées portant sur l’étude de la glucotoxicité envers les cellules pancréatiques, grâce à des méthodes protéomiques, sont également présentés dans ce manuscrit.
iii) Chapitre IV: Un manuscrit soumis pour publication présentant les principaux mécanismes régulant la sécrétion cellulaire. Différentes analyses protéomiques de vésicules sécrétoires sont également présentées dans ce manuscrit (chapitre IV).
Ces trois chapitres permettent de compléter le chapitre d’introduction de ce manuscrit de thèse.
2) La caractérisation du protéome des granules à insuline qui a permis de mettre en évidence la colocalisation avec les granules à insuline de nouvelles protéines. Ce travail a été publié en 2007 dans Molecular and Cellular Proteomics et correspond au chapitre V de ce manuscrit de thèse.
3) L’étude des modifications quantitatives du protéome des granules à insuline en réponse à une hyperglycémie chronique. Dans un premier temps, l’effet de la présence d’acides aminés isotopiques sur l’expression des gènes et des protéines des cellules INS-1E a été étudié. Un manuscrit présentant ces résultats a été soumis au journal «Nature Methods» et correspond au chapitre VI de ce manuscrit de thèse. Dans un deuxième temps, les conditions d’hyperglycémie cellulaire ont été déterminées et les protéines dont l’expression est modulée par cette hyperglycémie chronique ont été identifiées par spectrométries de masse. Ces résultats sont présentés dans le chapitre VII de ce manuscrit de thèse.
4) L’étude de l’une des protéines, nommée ProSAAS, trouvée sous-exprimée en réponse à une hyperglycémie chronique des cellules ȕ. Cette étude a consisté à déterminer la localisation de la protéine, ainsi que son expression en fonction de la concentration de glucose. Enfin, une étude a été débutée afin d’étudier le rôle de la ProSAAS dans la sécrétion d’insuline des cellules INS-1E.
L’ensemble de ces résultats se retrouvent dans le chapitre VII de manuscrit de thèse.
5) Une discussion générale sur l’ensemble des résultats obtenus lors de ce travail de thèse est présentée dans le chapitre VIII de ce manuscrit.
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