Mai 2019 – Modèle 015 Cisbio Bioassays
Parc Marcel Boiteux - BP 84175 – 30200 Codolet / France - Tél. 33 (0)4.66.79.67.00
CGA-ELISA
Trousse ELISA destinée à la mesure de la chromogranine A humaine dans le sérum et le
plasma.
Pour diagnostic In Vitro
ELISA kit designed to measure the chromogranin A human in serum and plasma.
For In Vitro diagnostic use
ELISA-Kit zur Bestimmung des Human CgA im Serum oder plasma.
Zur In Vitro-Diagnostik
La trousse contient : Kit content: Inhalt des Kits:
Microplaque 1x 96 puits Microplate 1 x 96 wells Microtiterplatte 1 x 96 Vertiefungen
Conjugué 2 x qsp 11 mL Conjugate
Buf-conj 2 x qsp 11 mL
1 x 24 mL Komplex
Buf-con 2 x q.s 11mL
1 x 24mL Buf-conj
Calibrateur 0 / Diluant 1 x 24 mL
1 x 80 mL Calibrator 0 / Diluent 1 x 80mL Kalibrierprobe 0 / Verdünnungs 1 x 80 mL Calibrateurs 1 - 5 5 x qsp 0,25 mL Calibrators 1 - 5 5 x qs 0.25 mL Kalibrierproben 1 - 5 5 x q.s. 0,25 mL
Contrôle 1 x qsp 0,25 mL Control 1 x qs 0.25 mL Kontrolle 1 x q.s. 0,25 mL
Solution de lavage concentrée 1 x 10 mL Concentrated washing solution 1 x 10 mL Konzentrierte waschlösung 1 x 10 mL
Substrat 1 x 15 mL Substrate 1 x 15 mL Substrat 1 x 15 mL
Solution d’arrêt 1 x 22 mL Stop solution 1 x 22 mL Stopplösung 1 x 22 mL
Film adhésif pour microplaque 3 Adhesive for microplate 3 Klebefolie fûr microtiterplatte 3
Sachet plastique 1 Plastic bag 1 Plastikbeutel 1
Notice d’utilisation 1 Instruction for use 1 Gebrauchsinformation 1
Attention : Certains réactifs contiennent de l’azoture de
sodium Warning: Some reagents contain sodium azide Achtung: Einige Reagenzien enthalten Natriumazid
Kit ELISA destinato alla misurazione della CGA umana nel siero o plasma.
Per uso diagnostico In Vitro
Equipo ELISA diseñado para medir la CGA humana en el suero o plasma.
Para uso de diagnóstico In Vitro
Δοκιμή ELISA που προορίζεται για τη μέτρηση της ανθρώπινης CGA στον ορό.
Για διάγνωση In Vitro
Contenuto del kit: Contenido del equipo: ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΗΣ ΤΥΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ
Micropiastra 1x 96 pozetti Microplaca 1x 96 pozos ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΑ 1X 96 ΦΡΕΑΤΙΑ
Coniugato
Buf-conj 2 x q.b a 11mL
1 x 24 mL Conjugado
Buf-conj 2 x csp 11mL
1 x 24mL ΣΥΖΕΥΓΜΑ
Buf-conj 2 x QS 11 mL
1 x 24mL Calibratore 0 / Diluente 1 x 80 mL Calibrador 0 / Diluyente 1 x 80 mL ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ 0/ ΑΡΑΙΩΤΙΚΟ 1 X 80mL Calibratori 1 - 5 5x q.b a 0,25 mL Calibradores 1 - 5 5 x csp 0,25 mL ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ 1-5 5 X QS 0,25mL
Controllo 1 x q.b a 0,25 mL Control 1 x csp 0,25 mL ΜΑΡΤΥΡΑΣ 1 X QS 0,25mL
Soluzione di lavaggio concent 1 x 10 mL Solución de lavado concent. 1 x 10 mL ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΕΝΟΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ 1 X 10 ML
Substrato 1 x 15 mL Substrato 1 x 15 mL ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ 1 X 15 ML
Soluzione d’arresto 1 x 22 mL Solución de parada 1 x 22 mL ΔΙΑΛΥΜΑΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΥ 1 X 22 ML
Film adesivo per micropiastra 3 Film adhesivo para microplata 3 ΑΥΤΟΚΟΛΛΗΤΗΤΑΙΝΙΑ 3
Sacchetto di plastica 1 Bolsa de plástico 1 ΠΛΑΣΤΙΚΟΣΑΚΟΥΛΑΚΙ 1
Istruzioni per l’uso 1 Instrucciones de uso 1 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΕΩΣ 1
Attenzione: Alcuni reagenti contengono sodio azide Precauciones: Algunos reactivos contienen azida sódica ΠΡΟΣΟΧΗ: ΟΡΙΣΜΕΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΑΖΙΔΙΟ ΝΑΤΡΙΟΥ
Explication
des symboles Explanation of
symbols Erläuterung der
Sumbole Spiegazione dei
simboli Significado de
los simbolos Eπεξήγηση
των συμβόλων Significadodo
s simbolos Symbol förklaring
Symbol
forklaring Wyjaśnienie
symboli Jelmagyaráz at
Vysvětlení
symbolů Sembollerin açıklaması
T° limite de stockage
Storage temperature
limitation
Limitierung der Lagertemperatur
Limiti per la temperatura di
conservazione
Limites de temperatura de almacenamiento
Περιορισμός θερμοκρασίας
φύλαξης
Limite da temperatura de
armazenagem T°-gräns vid förvaring
T° grænse for
opbevaring Graniczna temperatura przechowywania
Tárolási hőmérsékleth
atár
Mezní teplota
skladování Depolama sıcaklığı sınırlaması N° de lot Batch code Chargencode codice lotto Código de lote Κωδικός
παρτίδας Lote Lotnr. Lot nr. Numer partii Gyártási
szám Č. šarže Parti kodu
Utiliser jusqu’au Use by Verwendbar bis utilizzare entro Consumir antes
de Ημερομ. λήξης Utilizado por Används
senast Udløbsdato Zużyć do Felhasználhat ó az alábbi
dátumig :
Použitelné do Son kullanım tarihi Consulter la
notice d’utilisation
Consult operating instructions
Das Handbuch zu Rate ziehen
consultare le istruzioni per
l‘USO
Consultar las instrucciones de
manejo o funcionamiento
Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης
Consulte o manual de operações
bruksanvisninLäs gen
brugsvejledningeSe n
Patrz dołączona ulotka
Olvassa el a használati
utasítást
Přečtěte si návod
k použití İşletim talimatlarına
danışın Diagnostic In
Vitro In Vitro Diagnostic
device
VitroDiagnostischIn- e Anwendung
Dispositivo Diagnostico In
Vitro
Dispositivo de diagnóstico In
Vitro
Διαγνωστική συσκευή In Vitro
Dispositivo de diagnostico In
Vitro In vitro-
diagnos In vitro diagnose Diagnostyka In
Vitro In vitro diagnosztika
Diagnostika in
vitro In Vitro Tanılama cihazı Fabriqué par Manufactured
by Hergestellt von Prodotto da Fabricado por Κατασκευάζεται
από την Fabricado por Tillverkad av Fremstillet af Wyprodukowane
przez Gyártja: Vyrobil Üretici
Référence Catalogue
number Katalog Nr. N. catalogo Número de
catálogo Αριθμός
καταλόγου Número do
catalogo Referens Reference Wzorzec Referenciaké
szítmény Reference Katalog numarası Nombre de
tests Number of
determinations Anzahl der
Bestimmungen Numero di
determinazioni Número de
determinaciones Αριθμός
προσδιορισμών Número de
determinações Antal rör Antal glas Liczba probówek A kémcsövek
száma Počet zkumavek Saptama sayısı
Conjugué Conjugate Komplex Coniugato Conjugado Σύζευγμα Conjugado Konjugat Kombineret Koniugat Kétfázisű
elegy Konjugát Konjugat
Calibrateur Calibrator Kalibrator Calibratore Calibrador Βαθμονομητής Calibrador Kalibrator Kalibrator Kalibrator Kalibrátor Kalibrátor Kalibratör
Contrôle Control Kontrolle Controllo Control Μάρτυρας Controle Kontroll Kontrol Kontrola Kontroll Kontrola Kontrol
Solution
concentrée Concentrated
solution Konzentrierte
Lösung Soluzione
concentrata
Solución
concentrada Συμπυκνωμένο
διάλυμα Solução
concentrada Koncentrerad
lösning Koncentreret
opløsning Roztwór
skoncentrowany Koncentrált oldat
Koncentrovaný
roztok Derişik çözelti Microplaque Microplate Mikrotiterplatte Micropiastra Microplaca Μικροπλάκα Microplaca Mikroplattan Mikropladen mikropłytka mikrolemez Mikrotitrační
destička Mikroplaka
Diluant Diluent Verdünnungs-
mittel Diluente Diluyente Αραιωτικό Diluente Spädningsme
del
Fortyndings
middel Rozcieńczalnik Hígítószer ředidlo Seyreltici
Substrat Substrate Substrat Sustrato Substrato Υπόστρωμα Substrato Substrat Substrat Substrat Szubsztrátum Substrát Substrat
Solution d’arrêt Stop solution Stopplösung Soluzione d’arresto
Solución de
parada Διάλυμα
τερματισμού Solução de
paragem Stopplösning Stopoløsning Roztwór
hamujący reakcje Semlegesitó oldat
Zastavovacó
roztok Durdurma
çözeltisi
FRA ENG DEU ITA SPA ELL POR SWE DAN POL HUN CES TUR
MISE A JOUR / UPDATING
Modifications par rapport à la version précédente : Modification du volume SUBS TMB.
Changes from the previous version:
Volume SUBS TMB modification.
Änderungen gegenüber der Vorgängerversion:
Volumen SUBS TMB modifikation.
Modifiche rispetto alla versione precedente:
Modifica volume SUBS TMB.
Cambios desde la versión anterior:
Modificación SUBS TMB de volumen.
Αλλαγές από την προηγούμενη έκδοση:
Τροποποίηση όγκου SUBS TMB.
Alterações em relação à versão anterior:
Modificação de volume SUBS TMB.
Ändringar från föregående utgåva:
Volym SUBS TMB modifiering.
Ændringer fra den tidligere version:
Volumen SUBS TMB modifikation.
Zmiany w stosunku do poprzedniej wersji:
Modyfikacja objętościowa SUBS TMB.
Változások az előző verzióhoz képest:
Volume SUBS TMB módosítás.
Změny od předchozí verze:
Změna objemu SUBS TMB.
Bir önceki sürüm üzerinde yapılan değişiklikler:
Hacim SUBS TMB modifikasyonu.
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays – Mai 2019 - Modèle 015
FRA
ENG DEU
ITA SPA ELL
SWE
POL POR
HUN DAN
CES
TUR
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays _ 2019 Május - 015. modell
4 HUN
1. NÉV ÉS RENDELTETÉS
A CHROMOGRANINE A készlet szérum vagy plazma humán chromogranin-A (CgA) tartalmának enzimatikus meghatározására szolgál.
A kit professzionális használatra készült.
2. BEVEZETÉS
A CgA egy (49 kD molekulasúlyú) hidrofil fehérje, 439 aa sav, mely a neuroendokrin sejtek kromaffin szemcséiben található. A graninok családjába tartozik.
A CgA előhormonként viselkedhet. Fiziológiájának ugyanis egyik kulcsfontosságú eleme a proteolízis. Ez a bomLás biológiailag aktív peptideket szabadít fel (vasostatin, chromostatin, pancreastatin, parastatin), melyek különböző parakrin és autokrin funkcióval rendelkeznek. Ez a proteolízis szövet-specifikus, lokalizációjától függően a fehérje-feldarabolódás eltérő módon történik. Főként a sejtekben, a kromaffin szemcsék belsejében megy végbe. Az immunhisztokémiában a CgA daganatos sejtekben való jelenléte neuroendokrin eredetű daganatot feltételez. A keringő CgA létezik egészséges alanyoknál, a kapott eredmények kortól és nemtől függetlenek. A CgA-koncentráció szérumban történő mérésének fontosságát először a feokromocitóma esetében mutatták ki, majd alkalmazása gyorsan kiterjedt egyéb endokrin rákokra is, különösen magas koncentráció-emelkedést mutatva a belek carcinoid tumorai és a pancreas endokrin daganatai esetében. Friss tanulmányok rámutattak, hogy a keringő CgA-koncentráció neuroendokrin
differenciálódással jár és összefüggésben áll a daganat tömegével, anélkül, hogy specifikusabb szekréciókat – mint az NSE-t – helyettesítene a kissejtes tüdőrák esetén. Néhány szerző arra is rámutatott, hogy a CgA jelenléte prosztatarák esetén kedvezőtlen irányú fejlődés jele lehet. Ezeket a patológiai koncentrációkat összefüggésbe lehetett hozni egy korábbi elhalálozással, mely független a betegség stádiumától.
3. A MÉRÉS ALAPELVE
Az Chromogranin-A egy ELISA típusú kvantitatív immunteszt. Egy első monoklonális antitest a mikrolemezhez kötve befogja a kalibrátorokban és a mintákban lévő CgA fehérjéket. A mosások elvégzése után a rögzült fehérjéket egy második monoklonális, HRP- vel (Horse-Radish-Peroxidase) párosított antitest ismeri fel. Egy második inkubációt követően a nem rögzült reagensek mosással eltávolításra kerülnek, majd a HRP szubsztrátumának, a TMB-nek (3, 3’, 5, 5’ Benzidin-tetrametil) hozzáadásával beindul a színskálás reakció. A reakció leállását követően minden mélyedés optikai sűrűségét 450 nm-en leolvassuk. A mért optikai sűrűségek arányosak a kalibrátorokban és mintákban jelen lévő CgA fehérje koncentrációjával.
4. REAGENSEK
Minden készlet 96 teszthez elegendő reagenst tartalmaz. A lejárati dátum a külső címkén látható.
REAGENSEK JELEK MENNYISÉG TÁROLÁS
MIKROLEMEZ: Használatra kész.
a mélyedés aljára rögzített, egérben termelt CgA specifikus monoklonális antitest, marha albumin.
1 db 96 mélyedést tartalmazó mikrolemez
2-8°C a lejárati dátumig.
Felnyitás után a fel nem használt
lemezsávok 6 hétig tárolhatók a készletben található műanyag tasakban, gondosan lezárva, keretein belül a lejárati idő KÉTFÁZISÚ ELEGY: Liofilizált.
HRP-vel konjugált, egérben termelt CgA specifikus monoklonális antitest, nem immunizált egerek immunglobulinjai, marha fehérjék, cukrok.
Rekonstituálja mindegyik flakont 11 mL BUF CONJ-mal.
2 flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
A visszanyerés után ne tárolja 2 óránál tovább 18-25°C-on, – 20°C-on történő mélyfagyasztással 6 hétig tárolható, keretein belül a lejárati idő
A KÉTFÁZISÚ ELEGY VISSZANYERÉSÉRE SZOLGÁLÓ OLDAT: Használatra kész.
Puffer oldat, marha fehérjék, tartósítószer.
1 db
24 mL-es flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
KALIBRÁTOROK: Liofilizáltak.
Újra vegyíthető humán CgA, humán szérum, EDTA ,tartósítószer.
60 – 120 – 225 – 450 – 820 ng /mL * Rekonstituálja 0,25 mL desztillált vízzel.
5 flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
A rekonstitúció után ne tárolja egy óránál tovább szobahőmérsékleten, maradék nélkül elosztva, – 20°C-on történő mélyfagyasztással hat héten át tárolható, keretein belül a lejárati idő
KONTROLL: Liofilizált.
Újra vegyíthető humán CgA, humán szérum, tartósítószer.
80 ng/mL **
Rekonstituálja 0,25 mL desztillált vízzel.
1 flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
A rekonstitúció után ne tárolja egy óránál tovább szobahőmérsékleten, aliquot részekre elosztva, – 20°C-on történő mélyfagyasztással hat hétig tárolható, keretein belül a lejárati idő.
PUFFER OLDAT: Használatra kész.
Ez a reagens inkubálásra, hígításra és 0 standard-ra használható puffer oldat.
Puffer oldat, marha szérum, nátrium-azid, EDTA.
1 db
80 mL-es flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays _ 2019 Május - 015. modell
5 HUN
TWEEN 20: Koncentrált mosóoldatot.
Hígítson fel 9 mL Tween 20-at 3 liter desztillált vízben.
Finoman rázza fel.
1 db
10 mL-es flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
A felhígított tween oldat 2-8°C-on egy hétig tárolható, keretein belül a lejárati idő.
SZUBSZTRÁTUM: Használatra kész.
3, 3’, 5, 5’ Benzidin tetrametil: TMB
1 db
15 mL-es flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
Stop OLDAT: Használatra kész.
0,5 M Kénsav.
1 db
22 mL-es flakon 2-8°C a lejárati dátumig.
ÖNTAPADÓS FILM A MIKROTÁLCÁHOZ 3
MŰANYAG ZACSKÓ 1
(*) A fentebb megadott értékek célértékeknek tekinthetőek, a valós értékek a flakonok címkéjén vannak feltüntetve.
(**) Az elfogadhatósági határértékek a flakon címkéjén vannak feltüntetve.
5. HASZNÁLATI ÓVINTÉZKEDÉSEK 5.1. Biztonsági intézkedések
A készletben található reagensek jóváhagyott készletekkel vizsgált emberi eredetű alapanyagai negatív eredményt adtak a HIV1, HIV2, HCV antitestek és a HBs antigén tekintetében. Mivel azonban semmilyen vizsgálati módszer nem képes teljes mértékben garantálni, hogy egy emberi eredetű alapanyag nem közvetíti a hepatitiszt, a HIV-vírust vagy bármely más fertőző vírust, minden emberi eredetű alapanyagot, - így a vizsgálandó mintákat is - potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni.
Ne szívjon fel semmit szájjal.
Ne dohányozzon, egyen vagy igyon olyan helyiségekben, ahol a mintákat vagy a készlet reagenseit kezelik.
A reagensek vagy minták kezelése közben hordjon egyszer használatos kesztyűt, majd ezt követően alaposan mosson kezet.
Vigyázzon, hogy ne fröccsenjen ki.
Távolítsa el a mintákat és fertőtlenítsen minden potenciálisan szennyezett felszerelést, mintha fertőzőek lennének. Ennek legjobb módja a legalább egy órán keresztül 121,5 °C hőmérsékleten történő autoklávos kezelés.
A nátrium-azid reakcióba léphet a csatornahálózat ólom- és rézcsöveivel, melyekkel rendkívül robbanásveszélyes fém-azidokat alkothat. Ennek elkerülése érdekében a hulladékok eltávolítása során bőven fel kell azokat hígítani.
5.2. Kezelési óvintézkedések
Ne használja a készlet alkotórészeit azok lejárati dátuma után. Ne keverje össze a különböző szállítmányokból származó reagenseket.
Ügyeljen rá, hogy sem a reagensek, sem a víz ne lehessen mikrobiológiai szennyeződés tárgya. Tartsa be az inkubációs időket.
6. MINTAVÉTEL ÉS ELŐKÉSZÍTÉS
A vizsgálatot közvetlenül szérumon vagy plazmán kell elvégezni. A 4 órán belül végzett vizsgálathoz a mintákat szobahőmérsékleten (18–25 °C) kell tárolni. A 48 órán belül végzett vizsgálathoz a mintákat 2–8 °C-on kell tárolni a mintavétel után. A 48 órán túl végzett vizsgálathoz a mintákat aliquot részekre kell osztani, amelyeket fagyasztva kell tárolni (-20 °C), legfeljebb 10 hónapig. Plazmán végzett mintavétel esetén a kapott értékek szisztematikusan magasabbak.
Tajvan : A vizsgálatot végzik közvetlenül szérum.
Hígítás: Magas CgA-koncentráció gyanúja esetén a hígítást a készletben található hígító pufferrel kell elvégezni. A hígítások elvégzése eldobható műanyag csövekben javasolt.
7. MÉRÉSI ELJÁRÁS 7.1. Szükséges felszerelés
20, 50, 100, 200 és 1000 µL adagolást biztosító precíziós mikropipetták vagy hasonló, eldobható végű eszközök. A kalibrációjukat rendszeresen ellenőrizni kell. Desztillált víz. Eldobható műanyag csövek. Vortex típusú keverő. Mikrotálca-mosó (opcionális). Mikrotálca- olvasó, mely képes 450 nm-es abszorbancia mérésére. Esetlegesen a leolvasó egy 610-650 nm közti hullámhossz mellett
abszorbanciát leolvasni képes szűrővel is fel lehet szerelve. Ez a második leolvasás lehetővé teszi a mikrotálca tökéletlenségeinek korrekcióját
7.2 Protokoll
A felhasználást megelőzően legalább 30 perccel minden reagenset szobahőmérsékletre kell melegíteni (18-25°C). A reagensek előkészítése és a mélyedésekbe történő szétosztása szobahőmérsékleten (18-25°C) történik. Minden kalibrátort, kontrollt vagy mintát két példányban kell tesztelni.
Határozza meg a méréshez szükséges mélyedések számát és tegye félre a fel nem használt lemezsávokat. Tárolja azokat 2-8°C-on az erre a célra mellékelt műanyag tasakban, gondosan lezárva.
Rekonstituálja a kalibrátorok és a kontroll flakonjait. Ellenőrizze alaposan, hogy az egész liofilizátum feloldódott és a rekonstitúciót követő egy órán belül használja fel.
A kétfázisú elegy elkészítése 10 perccel a felhasználás előtt történik a kétfázisú elegy hígítójával.
A megbízható és megismételhető eredményekhez elkerülhetetlen, hogy a különböző mosási fázisokat a leírtak szerint legyenek elvégezve. A mosóoldat reziduális mennyiségének a lehető legkisebbnek kell lennie.
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays _ 2019 Május - 015. modell
6 HUN
Tartsa be a reagensek hozzáadásának sorrendjét:
hosszú protokoll (16-20 óra + 2 óra)
Osszon szét minden mélyedésbe 200 µl inkubálási pufferoldatot.
Adjon hozzá 20 µL kalibrátort, kontrollt vagy mérendő mintát.
Fedje be az öntapadós filmmel, keverje 700 rpm fordulattal 1 percen át, majd inkubálja 16-20 órán át szobahőmérsékleten (18-25°C) keverés nélkül.
Mossa ki a mélyedéseket a következőképpen:
Szívja ki a mélyedések tartalmát.
Osszon szét 300 µL mosóoldatot minden mélyedésbe. TWEEN 20
Még kétszer ismételje meg ezt a műveletet, hogy összesen három mosási ciklus legyen elvégezve.
Fejezze be kiszívással. A mosóoldat reziduális mennyiségének a lehető legkisebbnek kell lennie.
Osszon szét minden mélyedésbe 200µL HRP konjugátumot.
Fedje be az öntapadós filmmel és inkubálja 2 órán át +/- 5perc szobahőmérsékleten (18-25°C) 700 fordulat/perc keveréssel Mossa ki a mélyedéseket a fentiek szerint, majd:
Osszon szét minden mélyedésbe 100 µL TMB-t. Fedje be az öntapadós filmmel.
Hagyja a kolorimetrikus reakciót pontosan 10 percig fejlődni szobahőmérsékleten (18-25°C), (700 fordulat/perc) keveréssel.
A reakció leállításához tegyen minden mélyedésbe 50 µL stop oldatot.
Fedje be az öntapadós filmmel.
Keverje 1 percig 700 rpm fordulattal.
Vegye le az öntapadós filmet.
Olvassa le az abszorbanciát 450 nm-en. Végezze el még egyszer (opcionális) az abszorbancia leolvasását 610 és 650 nm közötti hullámhosszon.
rövid protokoll (2 óra + 2 óra)
Osszon szét minden mélyedésbe 200 µl inkubálási pufferoldatot.
Adjon hozzá 20 µl kalibrátort, kontrollt vagy mérendő mintát.
Fedje be az öntapadós filmmel, keverje 2 óráig 700 rpmen szobahőmérsékleten (18-25 °C).
Mossa ki a mélyedéseket a következőképpen:
Szívja ki a mélyedések tartalmát.
Osszon szét 300 µL mosóoldatot minden mélyedésbe. TWEEN 20
Még kétszer ismételje meg ezt a műveletet, hogy összesen három mosási ciklus legyen elvégezve.
Fejezze be kiszívással. A mosóoldat reziduális mennyiségének a lehető legkisebbnek kell lennie.
Osszon szét minden mélyedésbe 200µL HRP konjugátumot.
Fedje be az öntapadós filmmel és inkubálja 2 órán át +/- 5perc szobahőmérsékleten (18-25°C) 700 fordulat/perc keveréssel Mossa ki a mélyedéseket a fentiek szerint, majd:
Osszon szét minden mélyedésbe 100 µL TMB-t. Fedje be az öntapadós filmmel.
Hagyja a kolorimetrikus reakciót pontosan 10 percig fejlődni szobahőmérsékleten (18-25°C), (700 fordulat/perc) keveréssel.
A reakció leállításához tegyen minden mélyedésbe 50 µL stop oldatot.
Fedje be az öntapadós filmmel.
Keverje 1 percig 700 rpm fordulattal.
Vegye le az öntapadós filmet.
Olvassa le az abszorbanciát 450 nm-en. Végezze el még egyszer (opcionális) az abszorbancia leolvasását 610 és 650 nm közötti hullámhosszon.
8. MINŐSÉGELLENŐRZÉS
A helyes laboratóriumi gyakorlat megköveteli, hogy minden egyes mérési sorozatban ellenőrző mintákkal ellenőrizzék a kapott eredmények minőségét. Az ellenőrző mintákat ugyanúgy kell kezelni, mint a mérendő mintákat és az eredményeket ajánlott megfelelő statisztikai módszerekkel elemezni.
9. EREDMÉNYEK
Minden páros esetén, számolja ki az optikai sűrűségek átlagát.
Opcionális optikai sűrűség korrekció: vonja ki a 620 nm-en (610-650 nm) leolvasott értéket a 450 nm-en leolvasott értékből Készítsen egy kalibrálási görbét a kalibrátorok optikai sűrűségei alapján a koncentrációjuk függvényében. A javasolt matematikai illesztési modell a 4-paraméteres logisztikus függvény (4PL). A görbéből kiindulva olvassa le a minták értékeit, melyeket adott esetben módosítson a hígítási faktorral.
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays _ 2019 Május - 015. modell
7 HUN
Kalibrálási görbére példa (hosszú protokoll mellett): ezeket az adatokat semmilyen körülmények között sem szabad a laboratóriumban kapott eredmények helyett felhasználni.
Kalibrátor Átlag (Optikai sűrűség) Koncentráció (ng/mL)
CAL 0
0,02 0
CAL 1
0,16 55
CAL 2
0,34 115
CAL 3
0,68 225
CAL 4
1,28 430
CAL 5
2,04 740
Kontroll
0,24 82
10. AZ MÓDSZER KORLÁTAI
A zavaros, a hemolízist vagy hiperlipémiát mutató vagy fibrint tartalmazó minták téves eredményt adhatnak.
A minták eredményeit ne extrapolálja az utolsó kalibrátoron túl. Hígítsa fel a mintákat és végezzen el egy új mérést.
11. VÁRHATÓ ÉRTÉKEK
Valamennyi laboratóriumnak meg kell határoznia saját normaértékeit a gyakran használt mintavétel típusának megfelelően. A chromogranin-A egy kálciumot megkötő fehérje, keringő koncentrációját befolyásolja a Ca ++ koncentráció. A kapott normaértékek különböznek attól függően, hogy száraz kémcsőre vett szérumminta vagy EDTA plazma mérése történik. Az alábbi értékek csak jelzés értékűek; ezek szérumon vagy EDTA plazmán, 114 vagy 60 egészségesnek tekintett alanyon végzett mérések eredményei.
A szérumminták normál értékei:
A populáció 95%-a 27 és 94 ng/mL közötti értéket adott, a középátlag 44 ng/mL.
Az EDTA plazmaminták normál értékei:
A populáció 95%-a 32 és 104 ng/mL közötti értéket adott, a középátlag 52 ng/mL.
Heparin plazmán végzett mérés esetén meg kell állapítani a heparin plazmamintákon végzett mérés normaértékeit.
12. A MÉRÉS SPECIFIKUS JELLEMZŐI 12.1. Pontatlanság
hosszú protokoll
Minták n Átlag
koncentráció (ng/mL) Azonos sorozat mérésein
(CV%)
Minták n Átlag
koncentráció (ng/mL) Különböző sorozat mérésein
(CV%)
1 35 24,3 6 5 13 50,2 10
2 35 92 5 6 13 119 8
3 35 374 4 7 13 303 6
4 35 677 4 8 13 574 5
rövid protokoll
Minták n Átlag
koncentráció (ng/mL) Azonos sorozat mérésein
(CV%)
Minták n Átlag
koncentráció (ng/mL) Különböző sorozat mérésein
(CV%)
9 35 29,2 5 13 11 38,0 12
10 35 94 5 14 9 103 6
11 35 313 4 15 11 198 6
12 35 501 6 16 9 460 4
CGA-ELISA
Cisbio Bioassays _ 2019 Május - 015. modell
8 HUN
12.2. Fedezési próba
A humán szérumokhoz ismert mennyiségű CgA hozzáadása történt. A mintákban a fedezési százalék 90% és 110% között oszlik el a két protokoll között.
12.3. Hígítási próba
A magas koncentrációjú minták felhígításra kerültek. Az elért visszanyerési százalékok 100% és 140% közé estek a két protokoll között.
12.4. Specificitás
A két monoklonális antitest lehetővé teszi egész és töredezett keringő CgA mérését.
12.5 Mérési tartomány
A mintákat azon a mérési tartományon belül kell mérni, mely a kimutathatóság alsó határa és a standard skála legmagasabb koncentrációja közé esik, nevezetesen 7 és 820 ng/mL közé.
12.6. A kimutathatóság alsó határa
A kimutathatóság alsó határa a 0-tól eltérő legkisebb mérhető koncentációként van meghatározva 95 %-os valószínűséggel. Ennek mért értéke 7 ng/mL a két protokollban.
A funkcionális érzékenység pontatlansági profillal mért koncentrációként van meghatározva 20%-os variációs koefficienssel (CV).
Ennek becsült értéke 11 ng/mL a két protokollban.
12.7. Kioltási effektus
1.000.000 ng/mL-ig nem következik be kioltási effektus.
12.8. Interferenciák
• A biotin koncentrációit 1200 ng/mL-ig CGA-ELISA assay-vel vizsgáltuk, a 2 protokoll alkalmazásával (rövid és hosszú):
A rövid protokollal nem volt megfigyelhető interferencia (2 ó + 2 ó)
A hosszú protokollal interferencia volt megfigyelhető (16-20 ó + 2 ó) 15 ng/mL-es koncentrációnál.
Ezért a rövid protokoll alkalmazását javasoljuk, ha a beteg biotint vesz be.
• Nincs interferencia bilirubin, a hemoglobin, a trigliceridek és reumatoid faktorok, hogy az egyes mért koncentrációk legfeljebb egyenlő megfelelő koncentrációjú és 500 µg/mL, 12 g/l, 12 g/l és 138 UI/mL volt megfigyelhető.
• Védőanyag konjugátumhoz történő hozzáadásával (nem specifikus egér immunoglobulinok) az immunomérés védett olyan esetleges interferenciákkal szemben, mint a humán anti-egér antitestekekkel (HAMA) való interferencia.
Mindemellett az „ál pozitív” vagy „ál negatív” eredményeket nem lehet teljes mértékben kizárni, mivel előfordulhat, hogy a páciensek mintáiban heterofil antitestek, reumatoid faktorok, stb. interferenciát mutathatnak.
A MÉRÉS FOLYAMATÁBRÁJA
MÉLYEDÉSEK
Hígító / Kalibrát or 0
µL
Kalibrátorok Kontroll és
minták µL
700 rpm keverés 1 percen
--- át Inkubálás
16-20 órán át 18-25°C- keverés on nélkül vagy 2 óra
(± 5 perc) 18-25 °C-
700 rpm on keveréssel
Mosás --- 3
Konjugált
µL Inkubálás 2 órán át
(+/- 5 perc) 18-25°C-
700 rpm on keverésse
l ---- Mosás 3-szor kiszívás és
TMB µL
Inkubálás 10 percig 18-25°C-
on 700 rpm keveréssel
STOP oldat µL
700 rpm keverés 1 percen át
--- Optikai sűrűség
mérése 450 nm-en
Kalibrátor 0 200 20 200 100 50
Kalibrátorok 200 20 200 100 50
Kontroll 200 20 200 100 50
Minták 200 20 200 100 50
Bibliography Jun E et al.
Diagnostic value of chromogranin A in pancreatic neuroendocrine tumors depends on tumor size: A prospective observational study from a single institute.
Surgery. 2017 Jul;162(1):120-30 Rogowski W et al.
Baseline chromogranin A and its dynamics are prognostic markers in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.
Future Oncol. 2017;13(12):1069-79 Cheng Y et al.
Serum chromogranin A levels for the diagnosis and follow-up of well-differentiated non-functioning neuroendocrine tumors.
Tumour biology. 2016; 37(3):2863-9 d'Herbomez M et al.
Biomarkers of neuroendocrine tumors.
Ann Biol Clin. 2016; 74(6):669-79.
Erickson JA et al.
A chromogranin A ELISA absent of an apparent high-dose hook effect observed in other chromogranin A ELISAs.
Clin Chim Acta. 2016; 452:120-3 Ferrero E et al.
Plasma Chromogranin A as a marker of cardiovascular involvement in Erdheim-Chester disease.
Oncoimmunology. 2016; 5(7): e1181244 Gut P et al.
Chromogranin A - unspecific neuroendocrine marker. Clinical utility and potential diagnostic pitfalls.
Arch Medical Sci: AMS. 2016; 12(1):1-9 Kim M et al.
The Role of Plasma Chromogranin A as Assessment of Treatment Response in Non-functioning Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors.
Cancer Res treat. 2016; 48(1):153-61 Lyubimova NV et al.
Chromogranin As a Biochemical Marker of Neuroendocrine Tumors.
Bull Exp Biol Med. 2016; 160(5):702-4 Niedworok C et al.
Serum Chromogranin A as a Complementary Marker for the Prediction of Prostate Cancer-Specific Survival.
Pathol Oncol Res. 2017 Jul;23(3):643-650.
Shanahan MA et al.
Chromogranin A predicts survival for resected pancreatic neuroendocrine tumors.
J Surg Res. 2016; 201(1):38-43 Esfahani M et al.
Biomarkers for evaluation of prostate cancer prognosis Asian Pac J Cancer Prev. 2015; 16(7):2601-11.
Glinicki P et al.
Comparison of chromogranin A (CgA) levels in serum and plasma (EDTA2K) and the respective reference ranges in healthy males.
Endokrynol Pol. 2015; 66(1):53-6.
Hallet J et al.
Exploring the rising incidence of neuroendocrine tumors: a population-based analysis of epidemiology, metastatic presentation, and outcomes.
Cancer. 2015; 121(4):589-97 Han X et al.
The value of serum chromogranin A as a predictor of tumor burden, therapeutic
response, and nomogram-based survival in well-moderate nonfunctional pancreatic neuroendocrine tumors with liver metastases.
Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015; 27(5):527-35.
Hsu CH Reyes et al.
Chromogranin A levels and mortality in patients with severe sepsis.
Biomarkers. 2015; 20(3):171-6 Kim M et al.
The Role of Plasma Chromogranin A as Assessment of Treatment Response in Non-functioning Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors.
Cancer Res Treat. 2016; 48(1):153-61 Attwood SE et al.
Long-term safety of proton pump inhibitor therapy assessed under controlled, randomised clinical trial conditions: data from the SOPRAN and LOTUS studies.
Aliment Pharmacol Ther. 2015; 41(11):1162-74.
Rehfeld JF.
Chromogranin A in gastrinomas: Promises and pitfalls.
Clin Chim Acta. 2015; 15;446:15-20.
Wu PB et al.
Increased plasma CgA levels associated with nonalcoholic fatty liver disease.
The Turkish journal of gastroenterology. 2015; 26(5):404-7 P Glinicki et al.
Chromogranin A (CgA): structure, biological function, pre-analytical, analytical, and clinical aspects of its measurement in blood
Postepy Nauk Medycznych. 2014; XXVII(12):847-51.
Piotr Glinicki et al.
Comparison of chromogranin A levels in serum and plasma (EDTA2K) and the respective reference ranges in healthy males
Endocrine Abstracts. 2014; (35):532 Hijioka M et al.
Serum chromogranin A is a useful marker for Japanese patients with pancreatic neuroendocrine tumors.
Cancer Sci. 2014; 105(11):1464-71.
Modlin IM et al.
Neuroendocrine tumor biomarkers: current status and perspectives.
Neuroendocrinology. 2014; 100(4):265-77.
Onal IK et al.
Chromogranin A as a marker of disease activity in inflammatory bowel disease.
Scand J Gastroenterol. 2014; 49(12):1501-2.
Pedersen L et al.
Preanalytical factors of importance for measurement of Chromogranin A.
Clin Chim Acta. 2014; 436:41-4.
