NOTE
Détermination de la teneur en résidus de benzylpénicilline dans les laits de bovins
commercialisés en Côte d’Ivoire
M. Aké
1,2*, H. I. Traoré
1, A. K. Malan
1SUMMARY
Liquid chromatographic determination of benzylpenicillin residues in milk A high performance liquid chromatographic method was developed for the determination of benzylpenicillin residues in milk sold in Côte d’Ivoire. Ben- zylpenicillin is an antibiotic, largelly used for the treatment of mastitis in dairy cows. The proposed method involved extraction followed by active resolution of benzylpenicillin with a C18 reverse phase column, followed by UV detection.
Results of validation tests were satisfactory. Application of the method to the analysis of 120 samples of three types of milk showed that only 7 samples con- tained benzylpenicillin at a higher level than the admitted norm of 4 µg.L-1. All these samples were withdrawn from cows that were raised in the traditional manner. These results showed that these high levels of benzylpenicillin may be due to unapropriate use or to the non respect of the delay between the treatment step and the milking.
Keywords
benzylpenicillin, HPLC, milk.
RÉSUMÉ
Pour évaluer la présence des résidus de benzylpénicilline, antibiotique utilisé dans le traitement des mammites chez le bovin, une méthode d’analyse a été proposée pour le contrôle en routine des laits commercialisés en Côte d’Ivoire.
Elle comprend une première étape d’extraction par partition liquide-liquide suivie de l’analyse par chromatographie liquide haute performance sur colonne en phase inverse. La détection s’est faite dans l’ultraviolet. La technique a été vali- dée et appliquée à des échantillons de lait de trois origines différentes. Sur les 120 échantillons de lait analysés, la benzylpénicilline a pu être mise en évidence à des teneurs au dessus de la norme (4µg.L-1) dans 7 échantillons provenant
1. Laboratoire de Chimie Analytique – UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques – BP V 34 Abidjan 01 – Côte d’Ivoire.
2. Laboratoire de Nutrition – Institut National de Santé Publique – BP V 47 – Abidjan 01 – Côte d’Ivoire.
* Correspondance : mdake@aviso.ci
© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit
tous des élevages traditionnels. Ces résultats traduisent probablement l’usage méconnu de cet antibiotique ou alors le non-respect du délai d’attente entre le traitement du bovin et la période de la traite du lait.
Mots clés
benzylpénicilline, CLHP, lait de bovin.
1 – INTRODUCTION
En élevage moderne, les antibiotiques sont utilisés comme promoteurs de crois- sance et surtout pour traiter des maladies spécifiques telles que les mammites qui atteignent très souvent les vaches (MCDOUGALL, 1998). L’usage inapproprié et le non-respect du temps d’attente entre l’administration de l’antibiotique à l’animal et la collecte de ses produits (lait, viande…) peuvent être à l’origine de la présence de résidus d’antibiotiques dans ces denrées alimentaires destinées à l’alimentation humaine et animale (MOLINAet al., 2003 ; DUTTA et al., 2001). Cette présence, en concentration excessive peut entraîner des effets néfastes chez l’homme tels que des réactions allergiques ou même des effets toxiques directs ainsi qu’un accroisse- ment des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques (ENRIQUEZ, 2000 ; BUR- GAT et al., 1991 ; CORPET, 1987). Une perturbation des processus de fabrication de certains produits dérivés du lait comme les yaourts et le fromage a également pu être notée (GRUMWALD et PETZ, 2003). En Côte d’Ivoire, le contrôle des résidus d’antibiotiques et particulièrement de benzylpénicilline dans le lait préoccupe aussi bien les producteurs que les autorités responsables de la santé publique. De plus, la législation ivoirienne a prévu un arrêté interministériel rendant obligatoire la détec- tion de la benzylpénicilline dans le lait (CODINORM, 2001).
La littérature rapporte plusieurs méthodes d’analyse de cet antibiotique dans le lait. En dehors des méthodes qualitatives de détection rapide (HARIK-KHAN et MOATS, 1995), les techniques quantitatives microbiologiques (NOUWS et al., 1999 ; SHITANDI
et STERMESJO, 2001 ; BONFOH et al., 2003a), immunologiques (LEE et al., 2000) et physico-chimiques telles que l’électrophorèse (CUTTING et al., 1995 ; NOZAL et al., 2004) et surtout la chromatographie (BOISON et al., 1994 ; RAMIREZ et al., 2003 ; 1990 ; BECKER et al., 2004 ; BOATTO et al., 1998 ; SORENSEN et al., 1997 ; TYC- ZKOWSKA et al., 1994 ; MOATS et HARIK-KHAN, 1995 ; MEETSCHEN et PETZ, 1990 ; HARIK-KHAN et MOATS, 1995 ; FURUSAWA N., 2000 ; TARBIN et al., 1995) sont égale- ment très utilisées. Parmi ces dernières, la chromatographie liquide haute perfor- mance (CLHP) reste encore l’une des méthodes les plus utilisées, offrant de nombreux avantages, avec une étape préalable d’extraction soit sur phase solide (BECKER et al., 2004 ; SORENSEN et al., 1997 ; BOISON et al., 1994 ; MOATS et HARIK- KHAN, 1995 ), soit sur phase liquide (FURUSAWA N., 2000 ; BOATTO et al., 1998 ; HARIK-KHAN et MOATS, 1995 ).
Pour notre étude, la détermination de la teneur en benzylpénicilline dans le lait est tirée de la méthode d’analyse de résidus de β-lactamines dans le lait, proposée par HARIK-KHAN et MOATS (1995). Elle comprend une étape d’extraction par partage liquide-liquide, suivie du dosage par chromatographie liquide sur colonne en phase inverse avec une détection dans l’ultraviolet à 210 nm.
2 – MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1 Matériel
– Filtre sans cendre n° 1 (Whatman).
– Balance de précision (Mettler, modèle 303 S).
– Dispositif de filtration sur membrane (Millipore).
– Évaporateur rotatif (Buchi).
– Chromatographe liquide haute performance équipé d’une pompe (Gilson, modèle 302) d’une vanne d’injection Rheodyne 7010 munie d’une boucle de 20µL, d’une colonne RP 18 (150 x 4,6 mm) dont la taille des particules est de 5µm (Merck), d’un détecteur UV (Jasco modèle 975) et d’un intégrateur (Hewlett Packard modèle 785).
2.2 Réactifs et solvants
Tous les réactifs utilisés sont de qualité analytique.
– Eau bidistillée.
– Bromure de tétrabutylammonium (0,2 M).
– Dihydrogénophophate de potassium (0,005 M).
– Acide phosphorique (0,005 M).
– Acétonitrile pour chromatographie liquide.
L’étalon utilisé est la benzylpénicilline sodique (Sigma). Une solution mère à 100 µg.mL-1 dans l’eau distillée est préparée et stockée à + 4°C. Les solutions de travail de 2 à 1 000 µg.L-1 sont préparées par dilution extemporanée de la solution mère dans l’eau distillée.
2.3 Traitement de l’échantillon et extraction
120 échantillons de lait de bovins de provenance différente ont été étudiés : supermarchés (30), élevages améliorés (30), élevages traditionnels – traite directe (30) et élevages traditionnels – mélange de plusieurs traites (30).
Prélever exactement 10 mL de lait dans un erlenmeyer, ajouter exactement 2 mL de solution de bromure de tétrabutylammonium puis ajouter lentement 40 mL d’acé- tonitrile. Agiter puis laisser au repos 10 min à température ambiante. Filtrer le surna- geant à travers un filtre sans cendre. Concentrer le filtrat à une température de 45 °C
± 1 °C, sous pression réduite jusqu’à l’obtention d’un volume de 1 mL. Ce volume est ensuite repris par 4 mL d’eau distillée et soumis à l’analyse par chromatographie liquide selon les conditions suivantes :
2.4 Analyse chromatographique
– Phase stationnaire : octadécylsilanisée (5µm) ;
– Phase mobile : dihydrogénophosphate dipotassique 0,005 M : Acide phospho- rique 0,005 M : Acétonitrile (32,5 :32,5 : 35 , v/v) ;
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– Débit de la phase mobile : 1 mL.min-1 ; – Détection UV : 210 nm.
– La benzylpénicilline est éluée en moins de 8 min. Les chromatogrammes d’une solution de référence de benzylpénicilline (20 µg.L-1) et d’un extrait de lait sont représentés sur les figures 1 et 2.
(1)
0 0
5 min
UA
20 000
10 000
Figure 1
Chromatogramme d’une solution de référence de benzylpénicilline (20 µg.L-1).
Pic 1 : Benzylpénicilline.
Chromatogram of a reference solution containing 20 µg.L-1 of benzylpenicillin.
Peak 1 : Benzylpenicillin.
Figure 2
Chromatogramme d’un extrait de lait.
Pic 1 : Benzylpénicilline.
Chromatogram of a milk extract.
Peak 1 : Benzylpenicillin.
(1)
0 0
5 min
UA
10 000
Figure 1 Figure 2
2.5 Validation de la méthode
Avant d’appliquer la méthode, elle a été soumise aux principaux tests de valida- tion. La linéarité de la concentration en fonction de la surface de pic a été recher- chée pour des concentrations comprises entre 5 et 1 000 µg.L-1. Le coefficient de détermination r2 a été calculé. La répétabilité de l’analyse chromatographique a été vérifiée à partir de dix injections d’une solution de référence de benzylpénicilline à deux niveaux de concentration d’une part et d’un extrait de lait, contenant des rési- dus de benzylpénicilline d’autre part. À partir de cet échantillon de lait, la répétabilité de l’ensemble de la procédure a été déterminée à partir de dix extractions différen- tes. Chaque extrait obtenu est ensuite injecté à deux reprises dans le chromatogra- phe. L’absence d’effet de matrice de la procédure d’analyse a été vérifiée en ajoutant des quantités de benzylpénicilline à trois niveaux de concentration à des échantillons de lait. La détermination de la teneur en benzylpénicilline avec ou sans ajout a été réalisée. Pour évaluer la sensibilité de la méthode, les limites de détec- tion et de quantification ont été évaluées par référence à un rapport signal sur bruit (S/N) respectivement égal à 3 et à 10.
Tableau 1 Répétabilité de la méthode.
Table 1
Repeatability of the method.
3 – RÉSULTATS ET DISCUSSION
L’analyse des tests de validation a permis de définir un domaine de linéarité qui s’étend de 5 à 1000 µg.L-1. Le coefficient de détermination r2 est égal à 0,9996.
L’ordonnée à l’origine n’est pas significativement différente de zéro (p = 0,05). Ces résultats ont été confirmés par une analyse de variance (ANOVA) avec Fcal = 1576,89 (p < <0,0001). Les coefficients de variation calculés évaluant la répétabilité, sont acceptables et proches de ceux rapportés par BOISON et al. (1994), TYCZKOWSKA et al.
(1994) et FURASAWA (2000) qui rapportent également des coefficients de variation infé- rieurs à 5 % (tableau 1). Les taux de recouvrement obtenus variaient entre 92 et 99 % avec une valeur moyenne de 95,54 %. Ils sont légèrement supérieurs à ceux rappor- tés par HARIK-KHAN et MOATS (1995) dans leur étude portant sur l’analyse simultanée des résidus de β-lactamines ainsi que FURASAWA (2000). Ces taux sont également pro- ches de ceux rapportés par certains auteurs qui effectuaient l’extraction sur phase solide avant le dosage : 95 % à 102 % (BECKER et al. 2004 ; SORENSEN et al., 1997 ;
Répétabilité de l’analyse chromatographique (n = 10)
Moyenne (µg.L-1)
Ecart-type (µg.L-1)
CV (%) Solution de référence de benzylpénicilline
20 µg.L-1 125 µg.L-1
1,12 1,49
Lait 11,70 0,277 2,37
Répétabilité de l’ensemble de la procédure (n = 10)
Lait 11,48 0,525 4,57
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MOATS et HARIK-KHAN, 1995). La limite de détection obtenue de 2µg.L-1 proche de celle rapportée par FURASAWA (2000), BOISON et al. (1994) et SORENSEN et al. (1997), est inférieure à la limite maximale résiduelle (LMR) admise de 4 µg.L-1 (CODINORM, 2001 ; FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION et WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1998). Les résultats des tests de validation appliqués, satisfaisants dans l’ensemble nous ont permis de retenir cette méthode pour le contrôle en routine des laits prélevés.
L’analyse des 120 échantillons de lait prélevés a relevé, d’un point de vue quali- tatif, que la benzylpénicilline a été retrouvée dans 5 échantillons de lait sur 30 prove- nant de la traite directe B1 soit 16,67 % et 2 échantillons de lait sur 30 provenant d’un mélange de traite B2 soit 6,67 %. Au total, 5,83 % des échantillons de laits analysés se sont révélés non conformes. Ces résultats indiquent que seuls les échantillons provenant des élevages traditionnels contiennent des résidus d’antibio- tiques. Des études similaires réalisées au Mali et au Niger ont également mis en évi- dence la prévalence de la présence de résidus d’antibiotiques (benzylpénicilline et tétracycline) dans les laits qui provenaient d’élevages traditionnels tenus par les communautés peuhls (BONFOH et al., 2003a ; BONFOH et al., 2003b). D’un point de vue quantitatif, les teneurs retrouvées sont largement au-dessus de la LMR de 4µg.L-1 (tableau 2). La présence de benzylpénicilline à ces taux peut s’expliquer par le non-respect du délai d’attente entre l’administration de la benzylpénicilline et la collecte des échantillons (ENRIQUEZ, 2000). Par ailleurs, il semble que la faible pro- duction par rapport à une importante demande, n’encourage pas certains éleveurs traditionnels à éliminer du marché le lait provenant des vaches traitées. Certains auteurs rapportent que la présence de ces résidus dans le lait serait une méthode développée par certains collecteurs pour contrôler l’activité microbienne pendant le transport (BONFOH et al., 2003a). Les résultats obtenus posent un problème de Santé publique car la présence de ces résidus peut provoquer l’apparition de réactions allergiques chez l’homme lorsque ce type de lait est consommé à des doses supé- rieures à la dose journalière admissible de 30µg/jour (ENRIQUEZ, 2000). Par ailleurs, elle peut entraîner l’apparition de souches bactériennes résistant aux antibiotiques, notamment au niveau de la flore intestinale (CORPET, 1987). De plus, les technologies laitières, aboutissant à la production de produits laitiers, tels que les yaourts, froma- ges… peuvent également être perturbées (GRUNWALD et PETZ, 2003). Ces différentes explications justifient pleinement la prise en charge des éleveurs traditionnels, qui représentent une part importante des producteurs de lait en Côte d’Ivoire (formation des éleveurs…). La nécessité du contrôle du lait à toutes les étapes, depuis la traite jusqu’à la commercialisation, doit être envisagée de manière systématique.
Tableau 2
Teneur en benzylpénicilline (exprimée en µg.L-1) des échantillons de lait.
Table 2
Benzylpenicillin content (expressed in µg.L-1) in samples of milk.
Origine N° Benzylpénicilline
(µg.L-1) Élevage traditionnel
B (traite unique)
Élevage traditionnel B (mélange de traites)
B3 B5 B6 B15 B21 B23 B30
92,77 30,45 25,20 5,44 11,79 57,60 7,45
4 – CONCLUSION
La méthode proposée permet une résolution rapide et efficace de la benzylpéni- cilline dans le lait. Les tests de validation ont indiqué que la méthode est précise, spécifique et exacte et peut être retenue pour le contrôle de routine de la qualité des laits commercialisés en Côte d’Ivoire. Le contrôle appliqué, a mis en évidence que 5,83 % des laits, provenant tous des élevages traditionnels de bovins, contenaient des teneurs en benzylpénicilline au-dessus de la norme admise de 4 µg.L-1. Ces résultats semblent donner une indication de la qualité des laits et justifient la mise en place d’un contrôle systématique des laits commercialisés localement. La prise en charge et la formation des éleveurs traditionnels devraient être rapidement envi- sagées en vue de fournir un lait de qualité aux populations.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
BECKER M., ZITTLAU E., PETZ M., 2004.
Residue analysis of 15 penicillins and cephalosporins in bovine muscle, kidney and milk by liquid chromatography, tan- dem mass spectrometry. Anal. Chim.
Acta, 520, 19-32.
BOATTO G., CERRI R., PAU A., PALOMBA M., PINTORE G., DENTI M. G., 1998.
Monitoring of benzylpenicillin in ovine milk by high performance liquid chromatogra- phy. J. Pharm. Biomed. Anal., 17, 733- 738.
BOISON J.O., KENG L., MACNEIL J.D., 1994.
Analysis of penicillin G in milk by liquid chromatography. J. AOAC Int., 77, 565- 570.
BONFOH B., DEM S., KEITA O., DELORENZI S., TRAORE H., SIMBE C. F., ALFA- ROUKH I. O., FARAH Z., NICOLET J., ZINSSTAG J., 2003. Assessment of anti- biotic residues by microbial inhibitor tests in fresh cow milk sold in Bamako (Mali).
Milchwissenschaft, 58, 304-307 (a).
BONFOH B., ZINSSTAG J., FARAH Z., SIMBE C.F., 2003. Rapport technique du sémi- naire lait sain pour la Sahel, Bamako 23- 28 février 2003, 58 p, LCV-INSH/STI-ETH, Bamako (b).
BURGAT V., 1991. Residues of drugs of vete- rinary use in food. Rev. Prat., 41, 985-990.
CODINORM , 2001. Lait et produits laitiers – NI 03-01-007. In : CODINORM (ed.) Cata-
logue des normes ivoiriennes. 10 p, Abid- jan.
CORPET D.E., 1987. Antibiotic residues and drug resistance in human intestinal flora.
Antimicrob. Agents Chemother., 31, 587- 593.
CUTTING J. H., KIESSLING W. M., BOND F.
L., McCARRON J. E., KRENZER K. S., HURLBUT J. A., SOFOS J. N., 1995. Aga- rose gel electrophoretic detection of six - lactam antibiotic residues in milk. J.
AOAC Int., 78, 663-667.
DUTTA G. N., DUTTA R., BURAGOHAIN J., MILLI D. C., 2001. Antibiotic residues in milk after treatment of bovine mastitis.
Indian J. Dairy Sci., 54, 322-325.
ENRIQUEZ B., 2000. Résidus de molécules à activité antibiotique et protection de la santé du consommateur. Ann. Pharm. Fr., 58, 455-463.
FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZA- TION, WORLD HEALTH ORGANIAZTION, 1998. Evaluation des résidus de certains médicaments vétérinaires dans les ali- ments. In OMS (ed), 47e Rapport du comité mixte FAO/OMS d’experts des additifs alimentaires, Série des Rapports techniques 876, Rome.
FURASAWA N., 2000. Rapid liquid chromato- graphic determination of residual penicillin G in milk. Fresenius J. Anal. Chem., 368, 624-626.
© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit
GRUNWALD L., PETZ M., 2003. Food proces- sing effects on residues : penicillins in milk and yoghurt. Anal. Chim. Acta, 483, 73-79.
HARIK-KHAN R., MOATS W. A., 1995. Identi- fication and measurement of beta-lactam antibiotic residues in milk: integration of screening kits with liquid chromatography.
J. AOAC Int., 78, 978-986.
LEE H. J., LEE M. H., HANK A., 2000. Applica- tion of ELISA for the detection of penicillin antibiotic residues in live animal. Asian Australas. J. Anim. Sci., 13, 1604-1608.
McDOUGALL S., 1998. Efficiency of two anti- biotic treatments in curing clinical and subclinical mastitis in lactating dairy cows.
N. Z. Vet. J., 46, 226-232.
MEETSCHEN U., PETZ M., 1990. Capillary gas chromatographic method for determi- nation of benzylpenicillin and other -lac- tam antibiotics in milk. J. Assoc. Off. Anal.
Chem., 73, 373-379.
MOATS W.A., HARIK-KHAN R., 1995. Liquid chromatographic determination of β- lactam antibiotics in milk: a multireisdue approach. J. AOAC Int., 78, 49-54.
MOLINA A., MOLINA M. P., ALTHAUS R. L., GALLEGO L., 2003. Residue persistence in sheep milk following antibiotic therapy.
Vet. J., 165, 84-89.
NOUWS J., VAN EGMOND H., SMULDERS I., LOEFFEN G., SCHOUTEN J., STEGEMAN H., 1999. Amicrobiological assay system for assessment of raw milk exceeding EU maximum residue levels. Int. Dairy J., 9, 85-90.
NOZAL L., ARCE L., RIOS A., VALCARCEL M., 2004. Development of a screening method for analytical control of antibiotic residues by micellar electrokinetic capil- lary chromatography. Anal. Chim. Acta, 523, 21-28.
RAMIREZ A., GUTIERREZ R., DIAZ G., GON- ZALEZ C., PEREZ N., VEG S., NOA M., 2003. High performance thin layer chro- matography-bioautography for multiple antibiotic residues in cow milk. J. Chro- matogr. B, 784, 315-322
SHITANDI A, STERMESJO A., 2001. Detec- tion of antimicrobial drug residues in kenyan milk. J. Food Saf., 21, 205-214.
SORENSEN L. K., RASMUSSEN B. M., BOI- SON J. O., KENG L., 1997. Simultaneous determination of six penicillins in cows’ raw milk by a multiresidue high performance liquid chromatography method. J. Chroma- togr. B Biomed. Appl., 694, 383-391.
TARBIN J. A., FARRINGTON W. H. H., SHEA- RER G., 1995. Determination of penicillins in animal tissues at trace residue concen- trations. Part I. Determination of benzylpeni- cillin in milk by reversed-phase liquid chromatography with solid phase extraction and liquid chromatographic fractionation clean-up. Anal. Chim. Acta, 318, 95-101.
TYCZKOWSKA K.L., VOYKSNER R.D., STRAUB R.F., ARONSON A. L., 1994.
Simultaneous residues analysis of beta- lactam antibiotics in bovine milk by liquid chromatography and ultraviolet detection and confirmation by electrospray mass spectrometry. J. AOAC Int., 77, 1122-1131.
