Le diabète sucré est défini par un désordre métabolique d’étiologies diverses, caractérisé par la présence d’une hyperglycémie chronique résultat d’un défaut de sécrétion d’insuline, de son activité ou des deux associés. Il s’agit d’une maladie mondialement répondue, l’augmentation de sa prévalence fait même parler d’épidémie. En effet, on comptait 230 millions de diabétiques en 2006 et 350 millions sont attendus en 2035, soit 120 millions de plus en une génération. Prés de 3,2 millions de décès sont enregistrés chaque année à travers le monde 1. Au Maroc, ils sont prés de 3 millions à l’heure actuelle 2.
Ces chiffres sont édifiants et tirent la sonnette d’alarme en vu de considérer cette pathologie comme une priorité sanitaire mondiale. Les conséquences néfastes sur la santé et l’économie ne sont plus à démontrer. Outre les complications aigues, l’hyperglycémie chronique s’accompagne de complications très invalidantes apparaissant au long cours et touchant de nombreux organes.
L’hémoglobine glyquée A1c (HbA1c), résultat d’une réaction générale de
glycation non enzymatique des protéines, est reconnue depuis plusieurs années comme le paramètre le plus objectif du contrôle glycémique dans la surveillance du diabète sucré. Elle s’est imposée comme le gold standard des examens biologiques, indispensable à une prise en charge optimale d’un patient diabétique. En effet, les résultats des grandes études prospectives, ont établi de façon certaine une corrélation entre l’équilibre glycémique évalué par l’HbA1c et
l’apparition de complications dégénératives 3 . Cette relation met en exergue l’intérêt de ce test dans le suivi à long terme du patient diabétique. Elle a permis de fixer des valeurs thérapeutiques décisionnelles et de calculer le risque de
survenue des complications en fonction de l’augmentation ou la diminution des résultats par rapport au dosage précédant 4, 5.
Les méthodes disponibles pour le dosage de l’HbA1c sont basées sur ses
propriétés physico-chimiques. Un effort de standardisation a été initié dans ce cadre par les principales sociétés savantes, afin de retenir et de valider certaines techniques analytiques en vu d’homogénéiser les résultats obtenus.
En France, les recommandations formulées par la HAS et par l'AFSSAPS préconisent que l'HbA1c soit dosée à l'aide d'une méthode certifiée selon les
schémas internationaux de standardisation.
Les DMDIV pour le dosage de l'HbA1c disponibles différent donc par leurs
modes de standardisation et donc par leurs valeurs de références, pouvant ainsi être source de confusion et de préjudice dans le suivi glycémique du patient diabétique.
Par ailleurs, le respect des règles d’assurance qualité des laboratoires oblige à procéder à la validation des techniques nouvellement adoptées préalablement à leur utilisation. Il s’agit d’une obligation du GBEA et un pré-requis indispensable dans le cadre de l’accréditation des laboratoires selon les normes ISO 17025 ou 15189. La validation d’une technique permet de connaître ses caractéristiques pour définir et juger la qualité du processus analytique, d’en préciser les limites de validité, d’assurer la transférabilité des résultats dans la mesure du possible. Les résultats sont examinés par rapport aux critères définis d’après l’état de l’art, l’utilisation d’un protocole rationnel et standardiser comme celui élaboré et publié par la SFBC, permet de simplifier de travail d’évaluation, d’uniformiser la présentation des données en vu de permettre un
jugement comparatif des résultats obtenus par des évalueurs ou des laboratoires différents.
Ce travail se propose de procéder à la validation d’un analyseur de l’HbA1c
utilisant la CLHP, le D-10® de chez Bio Rad certifié NGSP, mis à la disposition du laboratoire durant la période de l’étude, en vu de tester ses performances analytiques et de les comparer à celles du Cobas-Intégra® 400 de la société Roche certifié IFCC qui utilise une technique d’immaglutination.
Dans une première partie nous nous attèlerons à présenter une revue de la littérature sur l’HbA1c, ses méthodes de dosage, l’intérêt clinique de sa
détermination, ainsi que sur les référentiels qualités applicables dans les laboratoires d’analyses de biologie médicale et le protocole de validation d’une méthode de dosage.
Dans la seconde partie de ce travail nous présenterons les étapes de cette validation, ainsi que les résultats obtenus que nous discuterons avant de conclure.
PARTIE I
A. Glycation protéique et hémoglobine glyquée 1. Glycation protéique [6]
La glycation non enzymatique des protéines correspond à la fixation non enzymatique d’oses simples sur des groupements aminés libres des protéines, et s’oppose à la glycosylation qui est un mécanisme enzymatique de la biosynthèse protéique.
Ce processus comporte plusieurs étapes. Dans un premier temps, la condensation d’une fonction aldéhyde ou d’un groupement cétonique d’un sucre avec un groupement aminé d’une protéine conduit à la formation d’une base de schiff (aldimine) labile. Cette réaction est rapide et réversible.
Dans un second temps, la base de schiff subit un réarrangement dit d’Amadori pour former une liaison cétoamine (ou fructosamine) stable (figure 1).
Au plus long terme, les protéines glyquées subissent des remaniements (oxydations, clivages protéolytiques, pontages), qui conduisent à la formation de produits complexes fluorescents appelés produits avancés (ou terminaux) de la glycation (généralement désignés par l’abréviation AGE). Ces produits, dont le dosage n’est pas encore de pratique courant, seraient impliqués dans certaines complications dégénératives du diabète sucré.
Ce phénomène de glycation est général et affecte l’ensemble des protéines de l’organisme, circulantes comme tissulaire. Ainsi, dans le plasma, toutes les protéines peuvent être modifiées par les réactions de glycation et devenir ainsi des protéines glyquées. On les regroupe généralement sous le nom de fructosamines, en raison de leur liaison cétoamine (fructosamine) caractéristique. De même, les protéines tissulaires comme le collagène subissent ces modifications.
La glycation dépend de différents facteurs, notamment de la durée de vie de chaque protéine et de la concentration en oses.
En raison de son abondance chez l’homme, le glucose et le principal ose simple à se lier à la fonction aminée libre de résidus d’acides aminés. Sur une protéine, la fixation peut avoir lieu sur deux sites différents :
1. acide aminé N-terminal de la protéine,
2. groupement e-aminé d’un résidu de lysine de la chaîne protéique.
Suivant le site de glycation affecté, les caractères physico-chimiques sont plus au moins modifiés.
2. L’hémoglobine glyquée [6,1]
L’hémoglobine est la protéine des globules rouges qui transporte l’oxygène vers les cellules, elle existe sous plusieurs formes :
- L’hémoglobine A2 de structure α2δ2 est formée de deux chaînes
polypeptidiques α et δ.
- L’hémoglobine F de structure α2γ2 est formée de deux chaînes polypeptidiques α et γ. Elle prédomine pendant la vie fœtale et diminue pendant la première année de vie.
- L’hémoglobine A, possède la structure moléculaire α2β2. Son analyse chromatographique ou électrophorétique permet de mettre en évidence une hétérogénéité structurale. On distingue une forme majeure appelée HbA0 et
plusieurs formes mineures qui sont répertoriées sous le nom d’hémoglobine A1
ou hémoglobines rapides (elles migrent plus rapidement que l’HbA0 sous
l’influence d’un champ électrique). Ces dernières représentent 4 à 8 % de l’Hb totale et correspondent à des formes glyquées de l’hémoglobine. Toutes ces hémoglobines contiennent les mêmes chaînes polypeptidiques α et β et la structure α2β2. Elles ne se différencient que par la fixation de molécules greffées sur les chaînes polypeptidiques par la réaction de glycation.
La dénomination d’Hb glyquée est couramment utilisée, et la mieux adaptée pour désigner les produits formés, alors que celle d’Hb glycosylée est impropre (dans la mesure où cette fraction de l’Hb ne résulte pas d’un processus enzymatique) et doit être proscrite.
Du point de vue structurale, la fraction "Hb glyquée" regroupe un ensemble de composés différents par la nature de l’ose fixée (glucose,
glucose-6-phosphate, fructose-1,6-biglucose-6-phosphate, galactose, mannose), et le site protéique de fixation par fonction α aminée libre de la valine N-terminale des chaînes β ou fonction ε aminée accessible des résidus lysiles.
Lorsque l’Hb est glyquée à l’extrémité N- terminale (valine) des chaînes β, ses propriétés physico-chimiques (pHi) sont suffisamment modifiées pour permettre une séparation par électrophorèse ou chromatographie, c’est l’HbA1.
L’hémoglobine peut également être glyquée sur d’autres sites, qui ne modifient alors pas son pHi.
Dans le globule rouge, on trouve donc l’hémoglobine glyquée sous différentes formes. On peut en séparer certaines par chromatographie d’échange ionique (figure 2).
Figure 2. Les différentes fractions de l’hémoglobine obtenues par chromatographie d’échange cationique dans le sang d’un sujet adulte non diabétique [6].
- L’hémoglobine A1 est formée de plusieurs fractions, qui, en fonction de leur
ordre d’élution en chromatographie d’échange cationique faible, ont été nommées HbA1a (comprenant elle même deux sous-fractions HbA1a1 et HbA1a2),
HbA1b, HbA1c.
- L’hémoglobine A1c est la fraction la mieux caractérisée. Elle constitue la forme
majeure de l’HbA1 (80%), soit 4 à 6 % de l’hémoglobine totale.
- Les hémoglobines A1a1 et A1a2 résultent respectivement de la liaison de
fructose-1,6-diphosphate et de glucose-6-phosphate sur la valine N-terminale des chaînes β de l’hémoglobine. Ces deux formes représentent en moyenne environ 0,5 % de l’hémoglobine. Dans le cas de l’HbA1b (environ 0,8 % de
l’hémoglobine en moyenne), c’est le pyruvate qui est fixé à l’extrémité N-terminale des chaînes β de globine.
Le tableau I résume les termes employés pour designer les différentes formes d’hémoglobines glyquées.
Lorsque d’autres hémoglobines sont présentes (HbS, HbC par exemple), elles subissent de la même façon le processus de glycation, et dans les globules rouges sont retrouvées des formes glyquées de ces variants (HbS1c ou C1c par
exemple), au même titre que les formes glyquées de l’HbA. Il faut en tenir compte pour l’interprétation des résultats, car la présence de ces hémoglobines anormales a un effet variable selon les techniques utilisées.
Tableau I. Les différentes formes d’hémoglobine glyquée [6].
La formation de l’hémoglobine glyquée est irréversible. Elle résulte d’un long processus au cours de la vie du globule rouge. La quantité d’hémoglobine glyquée dans le sang dépend de la durée de vie des hématies (120 jours) et de la glycémie.
B. Hémoglobine glyquée A1c 1. Définition, formation
Selon le groupe de travail de l’IFCC, l’HbA1c est définie comme suit :
Hémoglobine A1 glyquée de manière irréversible sur une ou les deux extrémités
libres des valines N-terminale des chaînes β. Sa formation consiste en une fixation rapide, réversible de glucose sur la chaîne β par une liaison aldimine
labile qui subit un réarrangement d’Amadori lent et irréversible pour donner une liaison stable cétonique [5, 7] (Figure 3).
Figure 3. Formation de l’HBA1C [8]
L’importance de la glycation est dépendante de la concentration intra- érythrocytaire en glucose et de la durée de vie de l’hématie [7].
2. Dosage
Reflet de la glycémie moyenne d’une personne pendant environ 3 mois (durée de vie des globules rouges), l’HbA1c est considérée comme un mouchard
et un marqueur rétrospectif objectif de l’équilibre glycémique à moyen terme. Apparu dans les années 1970, le dosage de ce paramètre s’est rapidement imposé comme une analyse incontournable pour la surveillance des patients diabétiques [9].
La modification structurale acquise au cours du phénomène de glycation décrite plus haut, aboutit à une modification de la charge électrique de l’HbA1c
par rapport à l’HbA0. Elle permet ainsi de séparer ces fractions par des
techniques analytiques dont le principe est fondé sur la modification de cette propriété physico-chimique [7].
2.1. Phase pré analytique 2.1.1. Prélèvement
Le dosage de l’HbA1c est réalisé sur un prélèvement de sang effectué par
ponction veineuse au pli du coude sur héparine, fluorure, EDTA, ou ACD. Un prélèvement de sang capillaire est également possible [5,6].
Le sang total est conservé à + 4° C. La conservation de l’échantillon plus de 3 jours (EDTA), plus de 5 jours (ACD), pourrait conduire à l’apparition sur les pics des chromatogrammes d’épaulements provenant de la dégradation de l’hémoglobine [6].
2.1.2. Prétraitement et conservation
Le prétraitement de l'échantillon comprend la réalisation de l'hémolyse et l’élimination de la fraction labile de l’hémoglobine glyquée [6].
Les hémolysats peuvent être conservés à + 4° C pendant au maximum 7 jours, avec cependant possibilité de dégradation. Pour une conservation à long terme (plusieurs mois), une congélation des échantillons à – 24° C est requise. Des hémolysats préparés aussitôt après le prélèvement et conservés de cette façon peuvent valablement être utilisés pour contrôler la reproductibilité des techniques [5, 6].
2.2. Phase analytique
2.2.1. Principes des méthodes de dosage
L’intérêt suscité par la détermination de l’HbA1c est à l’origine d’une
exploitent soit les caractéristiques physico-chimiques (chromatographie d'échange ionique, électrophorèse), soit immunologiques de la molécule.
Les techniques de chromatographie d'échange cationique faible sont les techniques « historiques » d'étude de l'HbAlc, ayant permis son isolement et sa
caractérisation. Elles sont basées sur la plus grande électronégativité des Hb glyquées sur I'extrémité N-terminale des chaînes β. Le terme générique chromatographie d'échange ionique recouvre des techniques très différentes allant des colonnes de chromatographie basse pression (CLBP) aux automates de chromatographie haute performance (CLHP) très résolutifs. Leurs propriétés analytiques varient et le pic « HbAlc» ne contient pas toujours les mêmes
constituants [5].
Les techniques électrophorétiques, réalisées le plus souvent en gel d'agarose, mettent en jeu les mêmes propriétés de I'HbA1c. Comme les
techniques chromatographiques, elles permettent la mise en évidence de la plupart des variants de l’Hb, mais ne permettent pas celle des Hb modifiées comme les Hb carbamylées [5].
Les anticorps utilisés dans les méthodes immunologiques reconnaissent le peptide N-terminal des chaînes β modifiées par la fixation de glucose. II s'agit d'un court peptide, de longueur variable selon les fabricants. Différents systèmes ont été proposés :
- Un dosage immunoturbidimétrique en phase homogène adapté sur divers analyseurs automatiques de biochimie clinique, effectué après hémolyse préalable manuelle d’une aliquote de sang. Le pourcentage d’HbA1c est calculé
- Un dosage d’immunoinhibition sur latex, effectué sur sang capillaire, requiert l’utilisation d’un analyseur spécialisé,
- Un dosage ELISA sur microplaques automatisé utilisant un anticorps monoclonal [6].
Récemment, il a été mis sur le marché un lecteur d’Hb glyquée, le moniteur A1c Now® (Bayer Diabetes Care), pour le dosage de l’HbA1c, à partir
d’une goutte de sang capillaire en délocalisé. Ce système fait appel à des techniques d’immunodosage et d’analyse chimique pour mesurer l’HbA1c et
l’Hb totale respectivement. Il offre une précision adéquate comparée aux techniques standardisées, il pourrait être plus bénéfique pour les patients qui ne peuvent obtenir des valeurs d’un laboratoire standardisé, en raison des contraintes financières ou de transport [10].
Le tableau II présente la plupart des réactifs disponibles pour le dosage de l’HbA1c en France, classés par méthode d'analyse, et leurs caractéristiques
colligées à partir des notices d'utilisation.
Tableau II. Principaux réactifs disponibles pour le dosage de l’HBA1C en France [5].
Méthode Fabricant (gamme) Certification Mode de calcul
Interférences décrites dans les notices
Chromatographie d’échange d’ions
NGSP HbA1C/ ensemble HbA
Séparation/pas d’inter- férences avec HbA1C labile, HbF,
variants de l’Hb de charges différentes de l’HbA0 et de
l’HbA1c (dont Hb S,C,D,et E) .
CLHP Bio-Rad (Varian®, D10®) Tosoh Bioscience (G7) Menarini (HA) CLBP Bio-Rad (Diastal®) NGSP
Protocole d’hémolyse adapté pour éviter l’interférence de l’HbA1c labile (co-migration),
mauvaise séparation de l’HbF, séparation des Hb S et C. Bayer Diagnostic
(glycomal®) Notice non communiquée par le fabricant Microcolone Bio-Rad
Electrophorèse Sebia Non précisée HbA1/Hb
totale Co-migration HbA1C et HbF
Chromatographi
e d’affinité Progen (Nycocard) Non précisée
Hb glyquées/ Hb non glyquées Calcul HbA1C
Pas de description des interférences Méthode immunologique: inhibition d’agglutination ABX Pentra NGSP HbA1C/ Hb totale Augmentation de la valeur d’ HbA1C en présence d’Hb S et
C. Résultat d’ HbA1C< résultat
attendu en présence d’HbF > à10%.
Pas d’interférence de HbA1C
labile. Roche Diagnostics (Tina-Quant®, Intégra®) IFCC formule pour NGSP Beckman Coulter (Synchron)
Pas d’effet de l’Hb glyquée labile, de l’HbF < à10%, des Hb S et C.
Dade Behring
(dimension) NGSP
Reconnaissance par l’anticorps de nombreuses Hb anormales glyquées (S ,C ,E,G,H). Résultat inexact si taux élevé d’HbF.
Bayer Diagnostic (DC
200) NGSP
Résultat d’HbA1C< résultat
attendu en présence d’Hb S ou C (diminution durée de vie des
2.2.2. Standardisation des méthodes de dosage (Tableau II)
Plus de trente méthodes sont disponibles commercialement pour mesurer l’Hb glyquée. Le manque de standardisation des méthodes utilisées pour mesurer l’hémoglobine glyquée a entraîné une très grande variabilité dans les résultats avec des valeurs allant de 4,0 % à 8,1 % pour le même échantillon de sang. Dans plusieurs pays, un processus de standardisation a été utilisé pour réduire la variabilité des résultats [11].
En France, les opérations de standardisation menées en particulier à l’instigation de la SFBC ont permis la sélection de techniques fiables et standardisées. Les sociétés scientifiques (SFBC, ALFEDIAM, SFE) et les organismes officiels (AFSSAPS, ANAES) retiennent comme critère incontournable l’utilisation de techniques standardisées dans les laboratoires de biologie.
Les seuils définis grâce aux études prospectives DCCT et UKPDS [12,13], l’ont été avec le seul système de standardisation NGSP de l’HbA1c utilisable sur
la période de réalisation de ces travaux [5,14]. Le groupe NGSP utilise un système de référence en CLHP et des préparations d’Hb purifiées. Grâce à celui-ci, il a déjà certifié un grand nombre de méthodes. Il préconise des résultats chiffrés avec un intervalle de référence compris entre 4 et 6 % de l’Hb totale. Mais le pic chromatographique obtenu par la méthode de référence n’est en effet pas pur à 100 %. Cela a conduit le groupe IFCC à adopter un système de référence plus élaboré, utilisant une méthode de chromatographie CLHP en phase inverse, couplée à une détection par spectrométrie de masse ou par électrophorèse capillaire. La structure dosée est l’hexapeptide N-terminal de la chaîne β de la globine obtenu par digestion enzymatique des préparations d’Hb
purifiées. Mais l’inconvénient majeur de cette technique est de fournir des valeurs d’HbA1c de 1 à 2 % plus basses que celles de la standardisation
NGSP [4].
Après plusieurs échanges au sein des laboratoires du groupe d'experts de l'IFCC et du NGSP, la relation entre les deux méthodes a été récemment décrite : NGSP = (0,915x IFCC) + 2,15. Une équation existe donc entre les deux types de standardisation et les membres des deux groupes ont mis en place une organisation permettant de surveiller l'absence de dérive ultérieure entre les résultats. De plus, des études de cohortes à grande échelle sont nécessaires pour fixer de nouveaux seuils décisionnels si la standardisation IFCC devient la nouvelle référence [5, 15, 16, 17].
Un groupe de travail, formé par I'EASD, l'ADA, l’IDF et des représentants du NGSPet de l'IFCC, a pris alors les décisions suivantes:
* pour éviter toute confusion au niveau des prescripteurs et des patients, les résultats doivent continuer à être rendus selon les normes NGSP/DCCT actuellement en vigueur,
* seules les valeurs usuelles et les seuils décisionnels NGSP/DCCT, avec lesquels les patients et les médecins sont actuellement familiarisés, doivent continuer à être utilisés,
* la standardisation IFCC définit dorénavant les matériaux et la méthode de référence avec laquelle les industriels du diagnostic in vitro devraient se standardiser.
Ce consensus permet d'éviter des confusions et ne remet pas en cause les recommandations de la HAS et de l'AFSSAPSf en matière de suivi et de traitement du patient diabétique [3].
2.3. Phase post analytique, interprétation des résultats
La glycation de l’Hb étant à son terme quasiment irréversible, elle constitue une véritable mémoire des taux cumulés de glucose circulant. Liée à la durée de vie des globules rouges (120 jours), la quantité d’hémoglobine glyquée représente la valeur intégrée de la glycémie des 6 à 8 semaines précédentes et constitue un élément objectif du contrôle glycémique chez le diabétique.
Il existe de nombreuses méthodes de dosage des hémoglobines glyquées auxquelles correspondent des valeurs de références et des causes d’erreur différentes. C’est pourquoi, il est hasardeux d’interpréter des résultats d’hémoglobine glyquée sans connaître exactement la méthode utilisée [6].
2.3.1. Présentation des résultats [3]
Conformément aux recommandations de l’Afssaps, il est nécessaire pour le rendu des résultats du dosage de l’HbA1c :
٭D’utiliser des DMDIV standardisés (NGSP ou IFCC),
٭De maintenir le rendu des résultats du dosage de l'HbA1c dans le
système de référence du NGSP/DCCT avec indication de la technique, du système de standardisation et des valeurs de référence adéquates. Ceci afin de maintenir la cohérence avec les recommandations de la HAS en matière de suivi glycémique du patient diabétique et d'éviter toute confusion au niveau des prescripteurs et des patients.
Le compte rendu devra donc, spécifier la nature de la technique utilisée, la fraction d’hémoglobine glyquée effectivement dosée (HbA1c, HbA1, Hb
glyquée totale), et l’intervalle des valeurs de référence. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la fraction d’hémoglobine glyquée par rapport à la concentration de l’hémoglobine totale.
2.3.2. Valeurs usuelles
Les différentes valeurs usuelles, en fonction des techniques de mesures, parmi les plus utilisées, sont regroupées dans le tableau 3.
Tableau III. Valeurs usuelles en fonction du type de technique [6].
2.3.3. Variations physiologiques
Les valeurs d’HbA1c sont indépendantes du régime alimentaire, de
l’exercice physique et de l’état de jeûne. Il n’existe pas non plus de variations avec l’âge et le sexe [5].
2.3.4. Variations pathologiques, causes d’erreur
2.3.4.1. Raccourcissement de la durée de vie des globules rouges
La valeur sémiologique de l’HbA1c comme marqueur rétrospectif et
cumulatif de l’équilibre glycémique au cours des 6 à 8 semaines précédant le prélèvement chez le patient diabétique est conditionnée par une durée de vie normale des hématies (120 jours) et une synthèse normale des hémoglobines avec 97 à 99 % d’HbA. Si l’un de ces paramètres est modifié, l’interprétation du dosage de l’HbA1c devient délicate, voire impossible [5, 18].
La glycation de l’Hb se produit dés les stades érythropoïètiques, puis tout au long de la présence des globules rouges dans le courant circulatoire. Toute modification de la durée de vie des hématies entraîne donc une perturbation de cet équilibre, et la destruction prématurée des érythrocytes les plus âgées diminue les valeurs d’HbA1c. Les hémolyses, quelle que soit leur origine
(auto-immune, mécanique, toxique, médicamenteuse), les hémorragies ou spoliation sanguine importante et les traitements stimulant l’érythropoïèse entraînent un rajeunissement globale de la population érythrocytaire en quelques jours et rendent ininterprétable les résultats d’HbA1c. De la même façon, les antécédents
transfusionnels récents altèrent les taux d’HbA1c. La même situation est
rencontrée dans le cas de cirrhoses avancées qui provoquent l’augmentation de la séquestration splénique des globules rouges, ainsi qu’une hémolyse importante et d’hépatites virales traitées par Ribavirine® où les résultats d’HbA1c sont sous estimés du fait de l’anémie régénérative provoquée par le
traitement [4, 19, 20].
Ces situations sont fréquentes en milieux hospitalier et leurs conséquences sur les dosages d’HbA1c sont souvent méconnues des cliniciens [5].
2.3.4.2. Présence d’une hémoglobinopathie
La présence d’un variant peut induire une erreur d’interprétation avec pour conséquence une décision thérapeutique inadéquate est donc des plus importantes [5].
L’hémoglobine fœtale peut être à l’origine de résultats erronés avec les techniques qui ne permettent pas de l’identifier ou de reconnaître spécifiquement la fraction l’HbA1c [6].
2.3.4.3. Modifications post-traductionnelles de l'Hb
➢ Hémoglobine glyquée labile
L'Hb glyquée labile ou pre-Alc peut également interférer [5].
➢ Hémoglobine acétylée
In vitro, I'incubation d'Hb normale avec de l'aspirine conduit a la formation d'Hb acétylée dont le point isoélectrique est proche de celui de I'HbAlc. L'Hb
acétylée est séparée de I'HbAlc par les techniques modernes de chromatographie
et n'interfère pas avec les techniques immunologiques. De plus, chez des patients consommant chroniquement jusqu'a 1 g d'aspirine par jour, I'Hb acétylée reste indétectable. L'interférence de I'Hb acétylée, quelle que soit la méthode de dosage, semble donc peu probable [5].
Au cours de l’éthylisme chronique, une acétylation de l’hémoglobine est également observée, avec les mêmes conséquences sur son comportement en électrophorèse et chromatographie d’échange cationique : des valeurs relativement élevées d’hémoglobine acétylée ont été trouvées chez des patients éthyliques (2 à 3 %), mais on ne possède pas vraiment de résultats d’études à
grande échelle qui puissent affirmer le rôle réel de cette interférence dans les dosages de l’HbA1c [6].
➢ Hémoglobine carbamylée et insuffisance rénale
L’hémoglobine carbamylée en quantité importante chez les insuffisants rénaux peut augmenter sensiblement les valeurs observées de l’HbA1c [5].
2.3.4.4. Autres interférences [6]
➤ Lipémie
Lorsque la triglyceridémie est élevée, certaines techniques peuvent être affectées comme l’électrophorèse ou encore la chromatographie sur minicolonnes d échange ionique appliquée au cours de l’HbA1c dans son
ensemble. Dans ces cas, les résultats peuvent être faussement élevés ou l’interprétation délicate (mauvaise séparation des bandes en électrophorèse). Un prétraitement de l’échantillon peut être nécessaire.
➤ Bilirubine : aucun effet n’est décrit.
2.3.5. Interprétation
Aujourd'hui, on admet généralement qu'un taux d'HbA1c de 4 à 6 % est
normal et que le taux de 7 % représente le seuil à ne pas dépasser afin d'éviter les complications. Une récente campagne nationale d'information des patients diabétiques est de leur entourage, intitulée "sous le 7" promulgue d'ailleurs la valeur de 7 % comme objectif de valeur d'HbA1c à ne pas dépasser [3].
Un groupe européen pour le traitement du diabète de type I a défini une stratégie applicable à tous les laboratoires quelles que soient les techniques de dosage utilisées. Il recommande à chaque laboratoire de définir ses propres
valeurs de référence à partir d’une population témoin non diabétique, de calculer une valeur moyenne et un écart-type pour évaluer la dispersion des valeurs. Le contrôle glycémique est jugé insuffisant chez les patients présentant des valeurs d’HbA1c supérieures à la moyenne observée + 5 écarts-type [6].
Par ailleurs, il est certainement très difficile, voire impossible de comparer les résultats émanant de laboratoires différents obtenus par des techniques différentes. Pour cela, le suivi d’un patient diabétique doit être réalisé par la même technique dans le même laboratoire [21].
2.3.6. Intérêt clinique de l’HbA1C
2.3.6.1. Surveillance des maladies diabétiques
Molécule " espionne", l’HbA1c permet de connaître ce que le patient sait en
partie à partir du dosage qu’il a effectué chez lui, mais s’efforce parfois de cacher à son médecin : ses taux de glycémie sur une longue durée.
Dés lors, l’hémoglobine glyquée servira d’une part, comme un dispositif de surveillance et de gestion de la maladie, alors que pour le chercheur (clinicien, biologiste ou épidémiologiste), elle est un outil de connaissance qui permet d’avancer dans la compréhension des complications du diabète. Schématiquement, des taux d’HbA1c élevés signifient, soit des doses
insuffisantes d’insuline, soit une mauvaise répartition de ces doses dans la journée, soit en fin, un régime alimentaire ou une activité physique inadaptée.
L’invention de l’hémoglobine glyquée apparaît à la fois comme un dispositif technique donnant des informations sur les taux de glucose dans le sang des diabétiques, un dispositif de surveillance normatif permettant de
discipliner " le mauvais patient", en fin de compte, un dispositif cognitif permettant la réalisation des grandes enquêtes cliniques.
♦ Corrélation entre l'HbA1C et la glycémie
La corrélation entre le taux d'hémoglobine glyquée et l'hyperglycémie chronique des deux mois précédant son dosage est bien établie. En moyenne, une augmentation de 1 % en HbA1c (ou HbA1) correspond à une élévation de la
glycémie antérieure de 0,3 g.L- 1 (ou 0,5 g.L- 1) [21].
♦ Corrélation entre l'HbA1c et les complications chroniques du diabète
Deux études randomisées ont clairement montré le lien entre l'augmentation de l'HbA1c (reflet de la glycémie moyenne) et l'augmentation
exponentielle du risque de complications principalement micro vasculaires : l'étude DCCT dans le diabète de type 1 et l'étude UKPDS dans le diabète de type 2.
Grossièrement, pour chaque élévation de 1% de l'HbA1c , on observe une
augmentation relative de 30% des complications micro vasculaires [12, 13].
♦ Corrélation entre l'abaissement de l'HbA1c et la réduction des complications
De nombreuses études prospectives ont montré qu'un bon équilibre glycémique aboutissait à une réduction du risque de micro angiopathie diabétique, se traduisant par la rétinopathie, la micro albuminurie et la neuropathie [13, 22].
L’étude américaine DCCT a confirmé qu'un bon contrôle glycémique autour de 7 % d'HbA1c sur plusieurs années diminuait la progression des
♦ Intérêt de l’HBA1C pour fixer des objectifs thérapeutiques
I'HbAlc est devenue indispensable au diabétologue ainsi que le montrent
plusieurs études longitudinales [23].
En général, l'objectif est d'obtenir des chiffres d'HbA1c les plus proches
possible des chiffres de référence. Pourtant, il ne faut jamais oublier que le nombre d'hypoglycémies sévères s'accroît si le traitement est intensifié au point d'obtenir des HbA1c quasi normales [21, 24, 25, 26].
D’après la recommandation «Traitement médicamenteux du diabète de type 2 » publiée par l’AFSSAPS et la HAS en novembre 2006, le recours aux antidiabétiques oraux a lieu lorsque les mesures hygiéno- diététiques ne suffisent plus à contrôler la glycémie : HbA1c > 6 % [27]. Les différentes étapes de traitement sont rappelées dans le tableau ci-contre.
Tableau IV. Escalade thérapeutique dans le diabète de type 2 [27].
2.3.6.2. Dépistage du diabète
Déjà évoqué par différents auteurs ces dernières années à partir des données épidémiologiques en raison de sa sensibilité élevée, l’utilisation de l’HbA1c dans le dépistage du diabète est une procédure qui devrait se
généraliser, suite à la standardisation des méthodes souhaitée par les pouvoirs publiques [28]. En effet, il existe une relation entre la valeur de l’HbA1c en
pourcentage et la moyenne des glycémies sur 2 ou 3 mois, la figure 4 illustre cette relation [29, 30].
Si le test de dépistage se révèle positif, c’est à dire HbA1c ≥ à 6 % pour un
laboratoire ayant un intervalle compris entre 4 et 6 %, il sera nécessaire de pratiquer une épreuve de charge pour confirmer le diagnostic. En pratique courante, le médecin est d’abord alerté par une histoire familiale (antécédents familiaux du diabète), ou des signes cliniques évocateurs, tels que le surpoids
Cependant, cette indication demeure encore discutée même après plusieurs années de débats et de controverses [29].
Figure 4. Relations entre les valeurs d’ HbA1c (%) et la moyenne glycémique mesurée sur deux à trois mois [29, 30].
2.3.6.3. Autres utilisations cliniques
D’autres pistes de l’utilisation du dosage de l’HbA1c sont actuellement
explorées en cardiologie (syndrome coronarien), en pathologie vasculaire (artériopathie), en néphrologie (insuffisance rénale), en hématologie (anémie) ou en cancérologie (facteurs de prédisposition) [29].
Une étude récente réalisée chez 332 patients admis pour prise en charge de syndrome coronarien aigu, a montré que le risque de mortalité dans le groupe de patients ayant un taux d’HbA1c inférieur à 6,2 % versus le groupe de patients
avec une HbA1c supérieur à 6,2 est respectivement de 10 et 17 %. Les études
sont en cours pour évaluer l’impact de la régulation intensive de la glycémie au moment de l’infarctus sur l’amélioration du pronostic vital à long terme [29].
➢ En oncologie
Le diabète semble associé à un risque élevé du cancer colorectal. Dans une étude réalisée en 2004, Khaw a démontré qu’une augmentation de 1 % du taux de l’HbA1c était associée à une augmentation d’environ 33 % du risque de
développement du cancer colorectal. Si ces résultats sont confirmés, cette découverte favoriserait le développement de stratégie préventive très efficace
[29].
➢ Dans les pathologies vasculaires
Une corrélation a été établie entre le taux d’HbA1c en pourcentage et le
développement d’artériographie chez les patients diabétiques. En effet, les patients ayant un taux d’HbA1c dépassant 7,5 % sont 5 fois plus sujets à
développer une artériopathie que ceux dont le taux d’HbA1c est inférieur à 6 % [29].
Selon une étude turque, l’HbA1c pourrait être utilisée pour différencier
l’anémie par carence martiale de la thalassémie mineure. Le taux moyen d’HbA1c était diminué dans le groupe de thalassémiques. Un cut-off de 5 % de
l’HbA1c avait une sensibilité de 95 % et une spécificité de 75 % pour
différencier les deux groupes. Des études plus larges sont nécessaires pour valider cette découverte [29, 31].
➢ En néphrologie
Une équipe japonaise a récemment publié les résultats de l’équilibre glycémique chez les patients hémodialysés chroniques. L’analyse de cohorte étudiée montre que l’HbA1c devrait être maintenue à un taux inférieur à 8 %
chez le patient diabétique hémodialysé, comme le recommande le National Kidney Foundation Task Force on Cardiovascular Disease, une valeur supérieure que celle recommandée par l’ADA (7 %). Ce taux moyen fournit une protection sûre contre les maladies métaboliques, les risques d’infection et d’hypoglycémie très fréquents chez ces patients [29, 32].
Dans une étude récente, la possibilité de l’utilisation de l’HbA1C pour
prédire la survenue du diabète en post-transplantation rénale a été examinée, elle a montré une meilleur sensibilité de l’HbA1c comparée à la glycémie à jeûne
Le respect des règles d'assurance qualité des laboratoires oblige à procéder à la validation des techniques en préalable à leur utilisation et à le justifier. En effet, le choix de la technique et sa fiabilité est l’un des facteurs déterminants des résultats des analyses de biologie médicale. C’est une responsabilité qui
II- VALIDATION ET MISE AU POINT D’UNE METHODE DE DOSAGE EN BIOLOGIE MEDICALE
incombe au biologiste qui doit sélectionner ses outils et méthodes et les valider en vue d’assure la transférabilité des résultats dans la mesure du possible comme le recommande les référentiels qualité. Il s’agit d’une exigence du système «Assurance qualité » et un pré-requis indispensable dans le cadre de d'accréditation des laboratoires selon les normes ISO 17025ou 15189.
A. Les référentiels qualité applicables dans les laboratoires d’analyse de biologie médicale
Deux catégories de référentiels peuvent être distinguées :
les référentiels obligatoires que sont le GBEA, le manuel d’accréditation de l’ANAES (actuelle HAS), et plus récemment la norme ISO 15189 rendue obligatoire en 2009 [34]. Le GBEA et la norme ISO 15189 seront présentés,
les référentiels choisis dans le cadre d’une démarche qualité volontaire : les normes NF EN ISO 9001, NF EN ISO 17025 [35].
1. Le guide de bonne exécution des analyses de biologie médicale
Il s’agit d’un référentiel opposable à tout laboratoire de biologie médicale. La parution de ce texte réglementaire et obligatoire, défini en annexe de l’arrêté du 02 novembre 1994, a été un événement important pour tous les laboratoires privés et publics: tous aujourd’hui prennent en compte les dispositions du GBEA. L’assurance qualité fait désormais partie intégrante de l’activité.
Cinq ans après sa première parution, le GBEA a été modifié par l’arrêté du 26 novembre 1999 publié au Journal Officiel le 11 décembre 1999. Les principales évolutions portent sur l’instrumentation en particulier le suivi métrologique des équipements, la gestion des réactifs, l’informatique, le
transport des échantillons biologiques et la mise en oeuvre des techniques de biologie moléculaire.
Le GBEA décrit les conditions d’exécution des analyses et présente l’avantage de donner des détails pratiques. La mise en application des dispositions du GBEA doit permettre de maîtriser l’ensemble des tâches pré analytiques, analytiques et post-analytiques : depuis le prélèvement de l’échantillon biologique auprès du patient jusqu’à la transmission du compte-rendu d’analyses. Le GBEA comprend les règles de fonctionnement concernent l’organisation en termes de personnel, l’installation et l’instrumentation. Une partie importante est consacrée à l’exécution des analyses, elle précise toutes les étapes à formaliser par des documents écrits [35].
Le Guide de bonne exécution des analyses indique (chapitre I.1) que « C’est au biologiste qu’incombe le choix de méthodes optimisées, utilisées dans un grand nombre de laboratoires et recommandées par les sociétés scientifiques nationales ou internationales de biologie ou, le cas échéant, validées par lui-même à condition qu’elles permettent, dans la mesure du possible, le transfert des résultats » et (chapitre III.1) que « des procédures opératoires doivent être techniquement validées afin d’assurer la qualité des résultats » [36].
Un GBEA marocain sera bientôt applicable à l’échelon national [37].
2. La norme NF EN ISO 15189
Elle est beaucoup plus spécifique ainsi que l’indique son titre : «Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence ».
La version française est parue en octobre 2003. Cette norme conjugue les exigences du système qualité de la norme NF EN ISO 9001 : 2000 et les exigences techniques propres aux analyses de biologie médicale. Avec une partie « Exigences relatives au management » et une partie « Exigences techniques » qui prend en compte l’ensemble de l’analyse y compris les phases pré- et post analytiques. Son sommaire est très voisin de celui de la norme NF EN ISO/CEI 17025.
Les thèmes abordés dans la partie «Exigences relatives au management» sont déjà cités dans la norme NF EN ISO 9001 (actions préventives, actions correctives, revue de direction, audits, etc.). Les chapitres « Analyses transmises à des laboratoires sous-traitants » « Services externes et approvisionnement » et « Prestation de conseils » sont en revanche spécifiques. Les exigences techniques concernent les procédures pré analytiques, analytiques, post analytiques et le compte-rendu des résultats mais aussi le personnel, les locaux et conditions environnementales, le matériel de laboratoire. C’est le premier référentiel normatif spécifique qui couvre la totalité de l’activité des LABM
[35].
Dans la nouvelle norme NF EN ISO 15189, la validation est retrouvée dans le paragraphe 5.5.2: "le laboratoire doit utiliser uniquement des procédures validées pour s’assurer qu’elles conviennent à l’utilisation prévue. Les validations doivent être aussi approfondies que nécessaire pour répondre aux besoins de l’application ou du domaine d’application concerné(e). Le
laboratoire doit enregistrer les résultats obtenus et la procédure utilisée pour la validation." [38].
Analyser, choisir, valider sont les préoccupations majeures de tout responsable d'un laboratoire d'analyses médicales, qu'il soit public ou privé. En effet, Chaque résultat de mesure est affecté d'une erreur totale (inexactitude) qu'il convient d'identifier en recherchant ses composantes, de qualifier et de quantifier. Les erreurs mises en évidence à partir des résultats d'une évaluation sont la résultante d'erreurs systématiques (erreur de justesse...) et d'erreurs aléatoires (imprécision) auxquelles s'ajoutent des erreurs de spécificité et des erreurs grossières [39].
1. Définitions [39]
Erreur systématique
C'est la différence entre la moyenne qui résulterait d'un nombre infini de mesurages du même mesurande, effectués dans des conditions de répétabilité et une valeur vraie du mesurande. L'erreur systématique est égale à l'erreur moins l'erreur aléatoire.
Erreur de justesse
Il s'agit de l'erreur systématique d'indication d'un instrument de mesure. Elle est normalement estimée en prenant la moyenne de l'erreur d'indication sur un nombre approprié d'observations répétées. Elle est aussi appelée biais.
Exactitude de mesure
Elle correspond à l'étroitesse de l'accord entre le résultat d'un mesurage et une valeur vraie du mesurande.
Elle se définit comme l'étroitesse de l'accord entre les résultats des mesurages successifs du même mesurande, les mesurages étant effectués dans la totalité des mêmes conditions. Elle est estimée par les paramètres d'évaluation de la dispersion : ET et CV.
Reproductibilité
Elle se définit comme l'étroitesse de l'accord entre le résultat des mesurages du même mesurande, les mesurages étant effectués en faisant varier les conditions de mesure. Elle est estimée par les paramètres d'évaluation de la dispersion : ET et CV.
La figure 5 schématise l’ensemble de ces définitions.
Figure 5. Schéma illustrant le concept d'incertitude des mesures [39]. 2. Protocole d’évaluation
La commission de validation de techniques de la SFBC a publié un protocole de validation de techniques en 1986, complété en 1993. Ce document permet la définition des normes d’acceptabilité (limites de reproductibilité, de
concentrations pertinents choisis pour correspondre le plus souvent à des niveaux de décisions médicale différents. L’intérêt d’un protocole rationnel et standardisé est de simplifier et d’optimiser le travail d’évaluation, d’uniformiser la présentation des données et de permettre un jugement comparatif des résultats obtenus par des évaluateurs ou des laboratoires différents. L’exploitation informatique des résultats est facilitée par l’utilisation de logiciels adaptés au protocole de validation de techniques [9].
Ce référentiel est destiné à ceux qui effectuent des évaluations de techniques pour juger de leur qualité et les valider en fonction de leur reproductibilité, et de leur justesse en comparant les résultats avec ceux d'une technique choisie comme référence. Pour chaque analyte et chacun des trois niveaux de concentration, des préparations de contrôle à utiliser pour une évaluation (bas, moyen, haut), des spécifications de répétabilité, de reproductibilité, de justesse (erreur systématique) et d'exactitude sont définies en suivant un protocole commun (voir tableau relatif aux limites d’acceptabilité proposées par le protocole valtec en annexe).
Ce référentiel est un outil qui doit évoluer et constitue un élément de dialogue propice au développement du partenariat entre biologistes et cliniciens, biologistes et industriels [39].
3. Etapes techniques du protocole de validation
Elles comprennent une période de familiarisation et une période d’évaluation [40].
D'une durée minimale de 3 jours consécutifs, la période de familiarisation est destinée à former les utilisateurs et à révéler les problèmes liés à l'essai. Elle est fonction de la complexité de la technique étudiée.
3.2. Période d’évaluation
La période d'évaluation d'une durée de 20 jours minimum, peut se décomposer en différents modules correspondants à l’évaluation de chacune de ces caractéristiques :
- Domaine analytique (limite de linéarité), - Limite de détection,
- Appréciation de l’imprécision (répétabilité et reproductibilité), - Appréciation de l’inexactitude,
- Etudes des interférences.
3.2.1. Evaluation du domaine d’analyse
Elle vise l’évaluation de la limite haute et basse de la relation linéaire existant entre la concentration de l’analyte observée et la dilution effectuée. Elle comporte plusieurs étapes qui se succèdent après la dilution d'échantillons de concentration très élevée :
- analyser chaque dilution en triple,
- reporter les résultats sur un graphe yi = f (xi) où yi représente la
- exprimer en pourcentage de la valeur de la solution dont la concentration est plus élevée, les résultats observés pour chaque point de la gamme et les reporter sur un graphe en fonction de la dilution effectuée.
La partie rectiligne de la courbe correspond à la zone de linéarité à l’intérieur de laquelle les résultats sont validés [9].
3.2.2. Evaluation de la limite de détection
La limite de détection d’une technique est la plus petite quantité ou concentration qui peut être distinguée, avec une probabilité connue, d’un blanc de la réaction réalisé dans les mêmes conditions. Elle est égale à K fois l’écart type de précision, mesuré sur le blanc réactif (K est calculé en fonction des risques α et β, α étant le risque de considérer une grandeur comme différente de zéro alors qu’elle est nulle, β celui de considère une grandeur comme nulle alors qu’elle n’est pas nulle). Elle vise à déterminer, pour une technique donnée, dans les mêmes conditions d’exécution propres à chaque laboratoire, la plus faible concentration de l’analyte à doser qu’elle est susceptible de détecter. Cette valeur limite doit être associée à chaque résultat d’analyse chaque fois que celle-ci est importante pour l’interprétation des résultats [9].
3.2.3. Evaluation de la répétabilité et de la reproductibilité
Son objectif est d’évaluer la dispersion des résultats obtenus à partir des aliquotes d’un même spécimen distribuées dans une même série d’analyse (répétabilité) ou dans des séries différentes (reproductibilité).
♦ Evaluation de la répétabilité
En pratique, cet essai est réalisé au cours d'une même série. Il est recommandé d'utiliser plusieurs niveaux de concentration ("bas", moyen,
"élevé"). Ces niveaux sont choisis en fonction des valeurs physiopathologiques. Le nombre de détermination dépend de la cadence de l'automate à valider, du coût des réactifs, etc. Cet effectif peut être compris entre 10 et 30 (5 si technique manuelle et/ou réactif très onéreux). La valeur statistique des résultats obtenus dépend de ces effectifs.
L'exploitation des résultats consiste à calculer la moyenne (m), l'écart-type (s) et le coefficient de variation (CV) des valeurs expérimentales de chaque série. Pour mémoire, le CV est :
∑ xi ∑ (xi- m) 2
C V e n n n-1 m
Le CV ainsi calculé est une expression simplifiée de la répétabilité de la méthode en %.
♦ Evaluation de la reproductibilité
En pratique, cet essai est réalisé au cours de séries successives en général 1 à 2 par jour par le passage des échantillons de contrôle de qualité interne (CQ) quotidiens.
15 à 30 déterminations minimums, selon les techniques sont nécessaires pour chacun des types d’échantillon.
Les modalités de calcul sont identiques à celles de la répétabilité, avec calcul de la moyenne (m), de l'écart-type (s) et du coefficient de variation (CV) sur les valeurs expérimentales de chaque série: le CV ainsi calculé est comparé au CV limite admissible [9,41].
m = S = CV en % = (S) x 100
Elle vise à mettre en évidence des erreurs systématiques (affectant d’une erreur de même signe tous les spécimens analysés) d’ordre proportionnel (dépendant de la concentration de l’analyte) ou constant (indépendant de la concentration de l’analyte à doser) indépendamment de l’erreur aléatoire de reproductibilité [9].
3.2.5. Evaluation de l’exactitude et de la justesse par comparaison de techniques
Cette étape évalue l’exactitude d’une technique B par rapport à une technique A. Pour cela, on analyse au moins 40 échantillons de patients, couvrant l'étendue du domaine physio-pathologique. Ces échantillons, frais de préférence, sont analysés en simple par les 2 techniques, dans des conditions de temps le plus possibles [9, 41].
Les résultats sont examinés au fur et à mesure, et vérifiés si la discordance est jugée supérieure aux limites préétablies.
Pour chacun des couples retenus xi (méthodes A) et yi (méthode B), le protocole consiste à :
∎ Calculer les différences xi- yi.
∎ Calculer les rapports yi / xi.
∎ Etablir les graphiques des différences (xi - yi) fonction de xi et (yi/ xi) fonction de xi, et reporter les limites retenues en valeurs absolues ou relatives sur ces graphiques.
∎ Calculer la droite de régression la mieux adaptée pour définir la relation statistique liant les résultats de la technique A à ceux de la technique B.
Parmi les droites de régression répondant aux critères fixées (York, Passing Bablock…) la plus facilement exploitable est la droite des moindres rectangles [9].
Les paramètres de la droite de régression des moindres rectangles sont les suivants :
Y = bx +a a = myi + b mxi b = Syi / Sxi
myi= moyenne des valeurs yi yi= moyenne des valeurs xi
Syi = écart type des valeurs yi Sxi= écart type des valeurs xi
3.2.6. Verification des valeurs de références
Les valeurs de références devront être vérifiées le cas échéant et si possible, par bibliographie et/ou par calcul statistique. Ce calcul peut se faire de la manière suivante :
● Après une période d’utilisation permettant d’obtenir un nombre de valeurs significatif (n > 100),
● A partir de patients exempts de pathologie (si possible), ● Ecarter toutes les valeurs >à m + 2s et < à m – 2s,
● Recalculer la moyenne (moyenne normalisée) mn et l’écart-type
(écart-type normalisé) sn à partir des valeurs ainsi retenues.
Les valeurs de références seront données par l’intervalle [mn – 2sn; mn +
3.2.7. Etude des interférences
Les défauts de spécificité ou de sensibilité aux interférences peuvent être évalués par surcharge d’un spécimen biologique par un composé dont la présence est susceptible d’entraîner un résultat inexact, soit par excès, soit par défaut. Le protocole se propose d’appréhender de façons quantitative l’influence de certains composés d’origine endogène (hémoglobine, bilirubine, colorant…) ou exogène (médicaments, aliments, toxiques…).
Un spécimen de concentration connue de l’analyte à doser (niveau moyen) est surchargé par une solution concentrée de la substance susceptible d’interférer pour obtenir plusieurs niveaux de concentration.
La valeur moyenne observée pour le spécimen non surchargé est soustraite de la valeur moyenne observée pour chaque spécimen. Les différences observées (négatives ou positives) sont reportées sur un graphe en fonction de la concentration de la substance interférente et comparées à des limites.
Les normes utilisées correspondent à la norme d’interprétation (valeur moyenne) du protocole de validation de techniques.
Les conclusions de ces essais in vitro doivent être confirmées par l’étude de spécimens de patients présentant des caractéristiques ou de traitements équivalents [9].
PARTIE II
A. Automates et méthodologies analytiques
Le dosage de l’Hb A1c a été réalisé simultanément sur les deux automates
suivants :
● Le Cobas Intégra®
de la société Roche diagnostics, automate multiparamétrique de biochimie qui dose l’HbA1c par immunoturbidimètrie,
technique de comparaison, ● Le D-10®
de chez Bio-Rad, mis à la disposition du laboratoire pour évaluation, utilisant la CLHP.
1. D-10® : Présentation et principe méthodologique
Le D-10® est un analyseur compact, peu encombrant (dimensions : 402 mm (L) x 476 mm (H) x 534 mm (P), poids de 35 Kg). Il s’agit d’un système de CLHP par échange d’ions utilisable pour le dosage des hémoglobines A1c
(HbA1c), A2, F et le dépistage des variants de l’hémoglobine. Dans notre étude,
nous l’avons utilisé seulement pour le dosage de l’HbA1c dans le cadre du suivi
des patients diabétiques et avec l’option passeur d’échantillons. Il comporte : - un système de prélèvement, de dilution des échantillons et de lavage ; - un module chromatographique contenant une pompe double piston, une vanne et une boucle d’injection de 25 µL, une enceinte thermostatée contenant la colonne échangeuse d’ions, un détecteur (diode électroluminescente) ;
- un module électronique comprenant une imprimante, un écran tactile et un PC équipé d’un logiciel permettant une connexion bidirectionnelle avec l’informatique du laboratoire.
Figure 6. L’analyseur D-10®
de Bio Rad (Laboratoire de biochimie H.M.I.M.V)
Le passeur d’échantillons permet le chargement en continu et le stockage après analyse des échantillons autorisant une capacité de chargement de 50 tubes par série (cinq positions de racks de 10 tubes).
Le travail en routine se fait sur tubes primaires fermés identifiés, l’échantillon étant prélevé directement après percement du bouchon par l’aiguille de prélèvement évitant ainsi tout risque d’accident avec exposition au sang. Des adaptateurs sont fournis pour travailler sur micro tubes (pédiatrie), sur échantillons de contrôle et sur échantillons pré dilués.
Le dosage repose sur une méthode de CLHP certifiée NGSP. Les échantillons sont automatiquement dilués dans le système D-10®, puis injectés dans le circuit d’écoulement analytique et appliqués à la cartouche analytique.
Le système D-10® envoie un gradient programmé de tampon de force ionique croissante dans la cartouche, les molécules d’hémoglobine sont alors séparées en fonction de leur interaction ionique avec le matériau contenu dans la cartouche. Elles traversent ensuite la cellule à circulation du photomètre filtre où sont mesurés les changements d’absorbance à 415 nm. Le logiciel D-10 intègre les données brutes recueillies lors de chaque analyse. Un compte rendu d’analyse et un chromatogramme sont générés pour chaque échantillon. Il comporte les informations suivantes : date et heure du dosage, identification de l’échantillon (calibrant, contrôle, patient), identification de l’injection (numéro de la série, numéro de l’injection, position de l’échantillon sur le rack), le chromatogramme, les surfaces et les temps de rétention des différents pics identifiés et le taux de l’HbA1c en %. La Figure 7 illustre des exemples de
chromatogrammes obtenus avec la méthode D-10® HbA1c.
Pour un sang normal, six fractions sont identifiées dans l’ordre de leur élution : HbA1a, HbA1b, HbF, HbA1c labile identifiée « LA1C » sur le
chromatogramme, HbA1C, HbA0. La surface de l’hémoglobine A1c est calculée à
l’aide d’un algorithme gaussien exponentiellement modifié qui permet d’exclure la surface des pics dus à l’HbA1c labile et à l’hémoglobine carbamylée de la
surface du pic A1c.
La séparation des fractions s’effectue en 3 minutes dans le programme Hb A1c, en 6.5 minutes en programme A2/F/A1c. Le passage d’un programme à
l’autre se fait sans changement de réactifs ni de cartouche et sans soumettre le système à un nouveau conditionnement.
Figure 7. Exemples de chromatogrammes obtenus avec la méthode D10® HbA1C
2. Cobas-Intégra®:Principe méthodologique du dosage de l’HbA1c
Le Cobas-Intégra® 400 de Roche (figure 8), est un automate multiparamétrique dont le panel d’analyse s’étend à la biochimie, à la pharmacologie, à la toxicologie de routine, ainsi qu’au dosage des protéines spécifiques. Il s’agit d’un système fermé à réactifs captifs, dont la cadence
analytique est d’environ 400 tests/ heure, fonctionnant habituellement 24h/ 24h sans interruption.
La technique de dosage de l’HbA1C sur le Cobas-Intégra ®
400 repose sur le principe de l’immunoturbidimétrie.
Après hémolyse, l’Hb libérée subit une dégradation protéique par la pepsine pour permettre la réaction immunologique avec la partie N-terminale de la chaîne β.
Pour le dosage de l’Hb, les hèmes sont oxydés. L’Hb totale est déterminée dans l’hémolysat à l’aide d’une méthode colorimétrique n’utilisant pas le cyanure et fondée sur la formation d’un chromophore brun-vert dans une solution détergente alcaline. L’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration en Hb de l’échantillon et déterminée par la mesure de l’augmentation de l’absorbance à 552 nm. Le résultat du dosage est calculé à l’aide d’une constante déterminée à partir du calibrateur primaire chlorohémine.
Le dosage de l’HbA1C utilise des anticorps monoclonaux fixés à des
particules de latex. Les anticorps se lient à la partie N-terminale de la chaîne β de l’HbA1C.
Les anticorps encore libres sont agglutinés à l’aide d’un polymère synthétique présentant plusieurs répliques de la partie N-terminale de la chaîne β de l’HbA1C. La variation de turbidité est inversement proportionnelle à la
quantité de glycoprotéines liées et est mesurée par turbidimétrie à 552nm. La figure 9 résume de façon schématique ce principe.
Un polypeptide synthétique comprenant la partie N-terminale de l’HbA1C
Le résultat final est exprimé en pourcentage d’HbA1C et calculé à partir du
rapport HbA1C/Hb et d’une équation de conversion pour établir la corrélation
avec la méthode HPLC de référence : HbA1C (%) = (HbA1c/Hb) ×170,8 + 1,94
Cette technique présente les spécificités suivantes :
- Un CV de 1,96% pour le niveau bas et de 2,21% pour le niveau haut en répétabilité, respectivement de 2,71 % et 2,63% en reproductibilité.
- Une linéarité satisfaisante jusqu’à 14,5% : y = 0,9941 X – 0,0384 et R2= 0,9999.
- Des valeurs usuelles allant de 2,59 à 4,91%.
Figure 8. L’analyseur Cobas-Intégra®
de Roche (laboratoire de biochimie H.M.I.M.V)
Figure 9. Schéma illustrant le principe du dosage de l’HbA1C par immunoturbidimétrie sur le Cobas-Intégra® 400.
B. Protocole d’évaluation :
Le protocole d’évaluation analytique s’inspire des recommandations du protocole Valtec de la SFBC.
L’évaluation a été faite dans le cadre d’utilisation normale de l’automate selon les recommandations de bonne pratique de la société Bio-Rad.
1. Echantillons analysés et pré-traitement
Des échantillons de contrôle de qualité de deux niveaux bas et haut ont été utilisés pour l’étude des imprécisions intra et inter-séries. En ce qui concerne l’évaluation des autres critères étudiant la performance analytique du D-10®
, des
prélèvements de sang total effectués sur des tubes EDTA ont été requis. Ces derniers provenaient de patients hospitalisés ou consultants dans les servicesde L’HMIMV de Rabat.
L’hémolyse est faite soit de manière automatique lorsqu’il s’agit du dosage sur le D-10®, ou bien manuellement si le volume de l’échantillon est insuffisant
ou si on opère sur le Cobas-Intégra® 400.
Des prélèvements sanguins supplémentaires ont été réalisés dans le cadre de cette étude pour explorer la fonction rénale, la glycémie et la fonction hépatique.
2. Etapes et procédures expérimentales
Les performances analytiques, notamment la répétabilité (imprécision intra série), la reproductibilité (imprécision inter séries), la linéarité, les valeurs de référence ont été évaluées. La comparaison des résultats ainsi que l’étude de l’interférence de l’hémoglobine carbamylée ont été étudiées.
