Validation d’une méthode de dosage des tanins condensés dans les matières végétales

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Validation d’une méthode de dosage des tanins

condensés dans les matières végétales

Audrina Permal

To cite this version:

Audrina Permal. Validation d’une méthode de dosage des tanins condensés dans les matières végétales. [Stage] 2017. �hal-02785070�

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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR

Bioanalyses et contrôles

Validation d’une méthode de dosage des tanins

condensés dans les matières végétales

Présenté par : Audrina PERMAL

Maître de stage : Carine CHEVRY MARIE-MAGDELEINE Durée de stage : 28 Novembre 2016 au 20 Janvier 2017

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Remerciements

Tout d’abord je souhaiterais remercier mon maître de stage : Madame Carine CHEVRY MARIE-MAGDELEINE qui m’a offert la possibilité d’effectuer cette période pratique ; ainsi que pour sa patience, sa disponibilité et son accessibilité.

Je remercie également les techniciens du laboratoire de l’URZ et plus particulièrement Monsieur Lucien PHILIBERT et Madame Suzitte CALIF pour leur encadrement, leur accompagnement, leur aide et leur collaboration tout au long de ce stage.

J’adresse également mes remerciements à tout le personnel de l’URZ et de l’INRA Antilles plus généralement, pour leur accueil et leur sympathie ; ils ont ainsi contribué au bon déroulement de mon stage qui a été véritablement instructif et enrichissant, tant sur le plan professionnel que sur le plan humain.

Je tiens à remercier mes professeurs de BTS Bioanalyses et Contrôles pour leur implication et leur conseils avisés.

Je tiens également à exprimer ma profonde gratitude à ma famille pour son soutien tout au long de ma poursuite d’études.

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SOMMAIRE

Introduction ………1

Glossaire/Abréviations………... 2

1. Présentation de l’organisme d’accueil ... 6

1.1. Institut national de la recherche agronomique ... 6

1.2. Unité de Recherches Zootechniques (URZ) ... 7

1.2.1. Présentation ... 7

1.2.2. Programmes de recherches ... 7

2. Etude bibliographique ... 8

2.1. Les métabolites des plantes ... 8

2.2. Les tanins ... 8

2.2.1. Les tanins condensés ... 9

2.2.1.1 Structure………...6

2.2.1.2 Intérêt et propriétés des tanins condensés………7

2.3. Les différentes méthodes de dosage des TC ... 11

2.4. La méthode utilisée au laboratoire de l’URZ ... 12

3. Validation de la méthode d’analyse par le profil d’exactitude ... 13

3.1. Définition, Objectif, Principe de la méthode de validation ... 13

3.2. Matériels et méthodes : démarche utilisée pour la méthode de validation ... 13

3.3. Résultats- discussion ... 19

4. Conclusion et perspectives ... 28

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Introduction

Les tanins condensés (TC) qui font partie des métabolites secondaires des plantes, peuvent jouer un rôle essentiel dans l’alimentation et la santé des petits ruminants. Cette activité biologique est liée à leur grande affinité avec les protéines, conduisant à des effets sur les productions animales :

- Une meilleure efficacité alimentaire : les protéines sont protégées contre la dégradation du rumen, assurant in fine un gain de poids par l’animal (Terrill et al., 1992 ; Niezen et al., 1995) et une meilleure résistance aux maladies.

- Un contrôle du parasitisme gastro-intestinal : Les TC agissent directement sur les nématodes du tube digestif.

- Un moindre impact environnemental : Les TC modulent la méthanogenèse dans le rumen, par action directe sur les microorganismes méthanogènes et indirecte sur les populations protozoaires (Bhatta et al., 2009).

Ces effets biologiques des TC dépendent de leur concentration, leur structure et leur poids moléculaire (Barry, 1989 ; Wang et al., 1994).

Afin d’évaluer le potentiel bio actif des ressources végétales riches en TC destinées à l’alimentation animale, le laboratoire de l’URZ travaille au dosage de ces composés dans les matières végétales.

L’URZ a donc mis au point une méthode de dosage des TC, il s’agit maintenant de travailler à sa validation afin d’estimer son exactitude pour une utilisation en routine.

L’Objectif de ce stage est de valider la méthode de dosage des TC dans les matières végétales par le profil d’exactitude, en prenant comme modèle les feuilles de manioc. Pour cela, nous aborderons les principes de la méthode de dosage et de la méthode de validation, puis nous verrons les différentes étapes de la validation de la méthode. Ensuite, nous discuterons des résultats obtenus après dosages, puis nous conclurons.

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Glossaire/Abréviations

CV : Coefficient de variation ET : Ecart-type

INRA : Institut National de Recherche Agronomique MOY : moyenne

TC : Tanins Condensés

URZ : Unité de Recherche Zootechnique

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1. Présentation de l’organisme d’accueil

1.1. Institut national de la recherche agronomique

L’INRA (Institut National de la Recherches Agronomique) a été fondé en 1946. C’est le premier institut de recherche agronomique en Europe et deuxième en sciences agricoles dans le monde. C’est un établissement public à caractères scientifique et technologique (EPST). Depuis 2016 il est présidé par Philippe Manguin.

L’INRA est chargé :

- D’œuvrer au service de l’intérêt public afin de maintenir l’équilibre entre les exigences de la recherche et les demandes de la société.

- De produire et diffuser des connaissances scientifiques et des innovations principalement dans les domaines de l’agriculture (pour une agriculture durable), de l’alimentation (pour une alimentation saine et équilibrée) et de l’environnement (pour préserver et valoriser l’environnement).

- Contribuer à l’expertise, à la formation, à la promotion de la culture scientifique et technique, et au débat de science-société.

L’INRA Antilles Guyane a été crée en 1949. Des 21 centres régionaux de l’INRA, le centre de recherche Antilles Guyane est le seul à être situé en zone tropicale. Il est le principal acteur de la recherche agronomique dans la zone caribéenne depuis 60 ans et couvre les trois départements Français d’ Amérique (Guadeloupe, Martinique et Guyane). Le centre de recherche de la Guadeloupe est situé sur le domaine de l’INRA, le site accueille l’unité mixte de recherche CIRAD-INRA. Son siège est en Guadeloupe. Il développe ses connaissances des milieux tropicaux, en collaboration avec des laboratoires des centres de France Métropolitaine et ses partenaires régionaux et interrégionaux. Son objectif est d’élaborer des techniques innovantes, des nouvelles technologies adaptées à l’environnement tropical qui accompagneront l’évolution des exploitations agricoles.

L’INRA Antilles Guyane est composé de 3 unités de recherche sur deux domaines expérimentaux :

- L’Unité de Recherche Agrosystèmes Tropicaux (URASTRO)

- L’Unité Mixte de Recherche Écologiques des Forets de Guyane (ECOFOG) - L’Unité de Recherche Zootechnique (URZ)

Et de deux domaines expérimentaux sur 3 localités :

 Le domaine expérimental de coproduction végétale Duclos/Godet

 Les unités expérimentales de production et santé animale Duclos/Gardel.

Ces deux domaines représentent le support et le prolongement des travaux de recherches de tous les secteurs d'activités du Centre menés dans les unités de recherches.

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1.2. Unité de Recherches Zootechniques (URZ)

1.2.1. Présentation

Créée à la fin de l’année 1964 et située en Guadeloupe sur le site de Duclos, l’U.R.Z. a pour mission principale l’étude des contraintes majeures d’origines animales, végétales, biologiques, climatiques et techniques qui conditionnent les productions (bovins, caprins, porcins, ovins, lapins) dans les zones intertropicales.

L’URZ est une structure regroupant 25 agents dont 14 chercheurs avec 3 groupes de recherche d’approche pluridisciplinaire.

L’URZ a donc pour but de :

 Valoriser les ressources végétales en alimentation et santé animale (caractérisation des ressources, étude du déterminisme de l’ingestion des fourrages, étude d’aliments ‘atypiques’, valeur santé (anthelminthique) des plantes).

 Valoriser les ressources animales (caractériser et évaluer les ressources animales locales, étudier la résistance génétique des caprins aux strongles et à la cowdriose, étudier l’adaptation du porc au chaud, étudier la variabilité génétique de la résistance des porcs au chaud, étudier les interactions génotype milieu).

 Concevoir et évaluer des systèmes d’élevage économes en intrants et durables (étudier les systèmes de pâturages, étudier les systèmes polyculture-élevage, définir des schémas d’amélioration génétiques adaptés).

L’URZ dispose d’un laboratoire d’analyses permettant toutes les analyses physico-chimiques des aliments du bétail, des contenus digestifs, des excrétas et de la qualité des produits animaux, mais aussi des analyses de parasitologie pour des mesures de coprologie, des coprocultures et des analyses biochimiques sur des échantillons sanguins ; et d’un Centre de Ressources Biologiques.

1.2.2. Programmes de recherches

Les travaux de l’Unité de Recherches Zootechniques concernent la proposition d’"Alternatives pour la conception biotechnique de systèmes d’élevage agroécologiques en milieu tropical humide". Il s’agit de produire des connaissances et des technologies au service d’une agriculture "productive et durable" dont la nuisibilité environnementale et la nocivité des produits sont minimisées, et ce conformément aux principes de l’agroécologie.

Ces travaux s'appuient sur les compétences multidisciplinaires développées par l'ensemble de l'équipe scientifique de l'URZ.

Trois thématiques de recherche sont développées :

- Adaptation et Résilience des Animaux pour des Systèmes d’Elevage tropicaux durables

- Optimisation de Fonctions en vue de l’Efficience des Systèmes d’Elevage Tropicaux - Valorisation des savoirs, expertises et innovations

Par ailleurs, l’URZ est engagée dans la gestion des ressources génétiques animales locales, en relation les Organismes de Sélection et les organisations professionnelles.

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2. Etude bibliographique

2.1. Les métabolites des plantes

Les végétaux produisent un grand nombre de composés, appelés métabolites. On distingue deux types de métabolites : les métabolites primaires et secondaires.

Les métabolites primaires sont les molécules indispensables à la vie de la plante (glucides, acides aminés, lipides, protéines …).

Les métabolites secondaires, quant à eux, ne sont pas directement impliqués dans le processus biologique des végétaux. Ils sont construits à partir d’association de molécules simples du métabolisme primaire, généralement par les sucres. Leur rôle n’est pas toujours clairement défini. Toutefois, de nombreuses recherches ont permis de démontrer que ce sont des éléments essentiels à la coévolution des plantes avec leur environnement : protection contre prédateurs et parasites, attraction des pollinisateurs… (Krief, 2003).

Les métabolites secondaires sont classés dans trois catégories :

 Les alcaloïdes, composés azotés et comportant au moins un cycle : Exemples : Caféine, Cocaïne, Morphine, etc.

 Les terpènes, molécules formées à partir d’unités moléculaires d’isoprène (2-méthylbuta-1,3-diène).

Exemples : Huiles essentielles, caoutchouc, carotènes, etc.

 Les composés phénoliques, caractérisés par au moins un noyau aromatique relié à un ou plusieurs groupements hydroxyles (-OH).

Exemples : Phénols, polyphénols, acides-phénols, flavonoïdes1, tanins, etc.

2.2. Les tanins

Les tanins sont des métabolites secondaires des végétaux, de la classe des polyphénols. On les retrouve dans de nombreuses familles botaniques, et sont localisés (selon les espèces) dans les fruits, les écorces, les feuilles…

Ces molécules, comme presque toutes celles produites par les plantes, ont une structure très complexe formée d’unités répétitives monomériques : ce sont des polymères naturels.

Il existe deux types de tanins :

- Les tanins hydrolysables, qui sont des oligo ou polyesters d’un sucre, en général le glucose, et d’un nombre variable d’acide-phénol (Bruneton, 1999). Ils sont classés selon la nature de cet acide-phénol : les tanins galliques (cf. Figure 1) et les tanins ellagiques.

- Les tanins condensés, qui sont des polymères de flavanols, une sous-classe des flavonoïdes.

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Figure 1. Exemple de structure d'un tanin gallique (polymère)

2.2.1. Les tanins condensés

2.2.1.1. Structure

Les tanins condensés (TC) appartiennent à la famille des flavonoïdes (Mueller-Harvey, 2006). Ce sont des oligomères ou polymères des flavan-3-ols, dont la structure chimique est basée sur un système d’hétérocycles (Figures 2 et 3). En général, ils sont de poids moléculaire plus élevé que les tanins hydrolysables.

Selon la nature des unités monomériques flavan-3-ols on distingue deux types de TC: les procyanidines et les prodelphinidines (Figure 2).

Figure 2. Unités de base des tanins condensés

Acide gallique

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Figure 3. Structure des tanins condensés

2.2.1.2. Intérêt et propriétés des tanins condensés

L’URZ étudie les tanins condensés pour leurs propriétés bioactives sur les animaux d’élevage, à travers de nombreuses expériences (in vitro et in vivo) depuis 2007. Différents essais réalisés (dans le monde et à l’URZ) ont pu montrer que l’ingestion de TC par les ruminants a pour conséquence plusieurs effets positifs sur les productions animales:

- Une meilleure efficacité alimentaire : les protéines sont protégées lors de la dégradation du rumen, assurant un gain de poids par l’animal (Terrill et al., 1992 ; Niezen et al., 1995) et une meilleure résistance aux maladies.

- Un contrôle du parasitisme gastro-intestinal : les TC agissent directement sur les nématodes2 du tube digestif.

- Un moindre impact environnemental : les TC modulent la méthanogenèse dans le rumen, par action directe sur les microorganismes méthanogènes et indirecte sur les populations protozoaires (Bhatta et al., 2009).

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2.3. Les différentes méthodes de dosage des TC

L’estimation des tanins condensés est un critère important pour le choix de la ressource végétale utilisable en productions animales. Il existe plusieurs méthodes colorimétriques de dosage des tanins condensés :

- La méthode de dosage au butanol-HCl, basée sur la dépolymérisation oxydante des TC avec l’apparition d’un précipité de couleur rouge (Schofield et al.,2001). C’est une méthode utilisée classiquement dans les laboratoires. Elle a pour avantage de confirmer la présence de polymères interflavanes. Cependant cette méthode a une variabilité élevée du fait de la complexité de structure des TC, de la nature du standard utilisé et de la présence d’eau ou de métaux (Fe3+) dans le milieu réactionnel.

Figure 4 Réaction au butanol-HCl (Schofield et al.,2001).

- Les méthodes de dosage à la vanilline basées sur la réaction des TC avec la vanilline, produisant un complexe coloré (Figure5). Elles sont spécifiques de manière générale aux flavonols. Les points critiques de cette méthode portent sur : le type de solvant utilisé (eau ou alcool), la nature et la concentration de l’acide (Sulfurique ou chlorhydrique), le temps de réaction, la température (travail basse température) et le type de standards utilisés (Schofield et al.,2001).

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2.4. La méthode utilisée au laboratoire de l’URZ

La méthode utilisée au laboratoire de l’URZ est une méthode colorimétrique à la vanilline sulfurique. C’est une méthode qui repose sur la réaction entre la vanilline et les flavonols (voir annexe). Elle est utilisée car les résultats obtenus sont plus fiables, plus répétables.

- Principe de la méthode de dosage :

La vanilline réagit avec les monomères catéchiques et les unités terminales des proanthocyanidines pour former un complexe chromophore rouge qui absorbe à 500 nm. Elle ne réagit pas avec les unités intermédiaires des proanthocyanidines car son site de fixation (carbone 6) est pris dans la liaison monomère – monomère C4-C6 des TC.

Figure 5 Réaction à la vanilline sulfurique (Schofield et al.,2001).

D’un point de vue pratique, il convient avant chaque réaction que les solutions d’acide sulfurique à 70% et de vanilline sulfurique 1% soient homogènes, froides et préparées le jour du dosage.

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3. Validation de la méthode d’analyse par le profil d’exactitude

La méthode de dosage des TC a été développée et mise au point au sein du laboratoire de l’URZ. Il s’agit maintenant de la valider afin de démontrer qu’elle convient bien aux objectifs du laboratoire, à savoir s’appuyer sur des méthodes fiables, reproductibles pour la finalité de travaux de recherche. Pour cela, la validation se fera selon une procédure expérimentale stricte : la méthode d’analyse par le profil d’exactitude.

3.1. Définition, Objectif, Principe de la méthode de validation

Le profil d’exactitude est un outil statistique permettant d’estimer la justesse et la concordance d’une méthode d’analyse. Il est basé sur une application directe des principes décrits dans les normes de la série ISO 5725 (1, 2, 3, 4 ; 1994). On y propose un modèle statistique pour estimer l’exactitude (justesse et fidélité) d’une méthode ou de résultats. Pour cela, il faut d’abord avoir correctement mis au point la méthode à valider : le domaine d’application doit être défini (sous le forme d’une gamme de concentrations absolues ou relatives) et le mode opératoire complètement rédigé.

Principes généraux de la méthode de validation : - Définir les objectifs à atteindre ;

- Prévoir les plans d’expérience à réaliser ;

- Prévoir les quantités et la qualité des matériaux à utiliser ;

- Organiser le calendrier des études et celui du personnel qui en sera chargé.

3.2. Matériels et méthodes : démarche utilisée pour la méthode de validation

La validation se fait en 10 étapes, selon la méthode développée par Max FEINBERG. On se réfèrera au « numéro spécial du cahier des techniques de l’INRA, validation des méthodes d’analyse quantitative par le profil d’exactitude ».

Plusieurs étapes essentielles sont à respecter afin de mettre en place la validation :  Etape 1 : Définir la quantité mesurée

La quantité mesurée est la concentration en TC exprimée en mg pour 100 mg de matière sèche selon la formule :

% TC = (% TC brut *100) / % MS (humidité résiduelle).

Cette quantité doit être la même lors de la validation que lors de la mesure en routine. Pour les TC on utilise un étalonnage préalable.

 Etape 2 : Préciser des objectifs de validation et le domaine de validation

Les différentes concentrations utilisées sont celles des échantillons de référence. Pour cela, il a fallu faire un dosage préalable des différents échantillons lyophilisés D00066 (feuilles de manioc), D00137 (fécès), AL00200 (feuilles), D00126 (feuilles), D00138 et D00139 (feuilles de manioc + pulpe de banane à différentes concentrations). On choisit des échantillons de très faible à très forte concentrations en TC afin de couvrir tout le domaine de validité. Cette étape est très importante car elle sert à définir les limites d’acceptabilité.

 Etape 3 : Sélectionner les échantillons de validation

4 échantillons ont été choisis : AL00200, D00137, et deux échantillons constitués en diluant l’échantillon D00066 dans de la matière minérale (10% et 50%) qui est une matière inerte, notés D00144 et D00145. Les échantillons utilisés sont lyophilisés et broyés ; ils ont été dosés en suivant le mode opératoire (voir annexe), et ce, 5 fois. On obtient donc pour chaque

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échantillon 5 valeurs répétitives (% TC), que l’on disposera sur un fichier de résultats Excel. On prend pour chaque échantillon, comme valeur de référence, la moyenne des répétitions réalisés.

A l’issu de cette mesure, le choix du nombre et des niveaux de concentration a été fait. Il y a donc 4 niveaux de concentration :

- D00144 : 3,42% - D00137 : 5,32% - D00145 : 8,14% - AL00200 : 13,33%

 Etape 4 : Planifier les essais de validation Le plan d’expérience de validation est le suivant :

Tableau 1: Plan d'échantillonnage

Réponses instrumentales Y Niveaux de concentration K des échantillons (µg/ml) Séries I (Jours)

Opérateurs Valeurs de référence des échantillons de validation X

Répétition J1 Répétition J2

1 série I correspond à 1 jour d’expérimentation - Série I (I≥ 3)

On prendra I=8.

- Répétition J par série (J≥ 2)

On prendra J=2 répétitions par série. Ce nombre doit rester constant le long de la validation. - Niveaux de concentration K (K≥ 3)

Cette valeur sert à vérifier la linéarité entre les concentrations de référence et celles retrouvées. On prendra K=4, ceci au cas où la validation serait proche de la limite de quantification.

- Le nombre d’essai n n=I*J*K*nombre d’opérateurs n=8*2*4*1

n=64 essais.

Plus ce nombre est grand et meilleure est l’estimation des critères de validation.

Afin d’avoir une meilleure estimation des critères de validation, il a été choisi de faire répéter le test par 3 opérateurs.

 Etape 5 : Planifier l’étalonnage

La méthode choisie est une méthode indirecte, il est donc nécessaire d’utiliser une gamme étalon. Le plan d’étalonnage est le suivant :

Tableau 2: Plan d'étalonnage

Réponses instrumentales Y Niveaux K’ des étalons

(µg/ml) Séries I’ (Jours) Opérateurs Valeurs de référence des échantillons de validation X Répétition J’1 Répétition J’2

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- Nombre de séries I’

Le nombre de séries sera le même que pour le plan de validation : I’=8. On aura donc un modèle d’étalonnage par jour. On fait l’étalonnage le même jour que la mesure de validation.

- Nombre de répétitions J’

On prendra comme nombre de répétitions J’=2, par niveau de concentration d’étalon (points de gamme).

Les réponses y de la validation ne doivent pas dépasser les points de gamme. - Nombre de niveaux K’

On prendra comme nombre de niveaux étalons par série (points de gamme) K’=6. Etant donné que l’on ne connaît pas la fonction de réponse (à priori linéaire), cela permettra a posteriori de déterminer le modèle correspondant à la courbe d’étalonnage.

Les valeurs de référence sont calculées en prenant les moyennes de tous les points de gamme.  Etape 6 : Réaliser les essais

Les essais sont réalisés en suivant scrupuleusement la méthode telle qu’elle sera utilisée en routine, en respectant le nombre de séries (1 série=1 jour).

Afin de réaliser la totalité des essais, il faut s’assurer de la disponibilité de quantités suffisantes d’échantillons (TC purs et échantillons) ; il convient donc de calculer en amont les quantités nécessaires et peser les échantillons pour vérifier.

Les mesures de validation et d’étalonnage doivent se faire dans les mêmes conditions, le même jour : 2 courbes étalons faites pour chaque série, servent à un calcul de réponses donné (à une série donnée).

Les résultats sont exprimés en fonction du %MS (humidité résiduelle) de chaque échantillon : %TC (exprimé en mg/100 mg MS) = (%TC brut *100) / %MS.

Le % de Matière Sèche (humidité résiduelle) est mesuré à l’aide d’un humidimètre (sartorius

MA 150).

 Etape 7 : Calculer les concentrations prédites inverses - Calcul du modèle d’étalonnage :

Il s’agit de la fonction de réponse de l’étalonnage. Pour chaque série : on enregistre les données au fur et à mesure, et on utilise la régression par la méthode des moindres carrés (DROITEREG d’excel). On obtient ainsi les paramètres de la fonction de réponse qui permettront de calculer les concentrations relatives aux absorbances obtenues.

- Calcul des réponses y (concentrations), par prédiction inverse :

Pour chaque série, on utilise la fonction de réponse obtenue, afin d’avoir l’équation de prédiction inverse et calculer la réponse (la concentration en TC). Un modèle est calculé par série.

Certaines valeurs sont éliminées lorsqu’elles sont trop éloignées de la valeur moyenne.

 Etape 8 : Calculer les critères de validation Il s’agit de déterminer les critères de :

- Justesse par série et niveau de concentration

Elle correspond à l’étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur de référence. Elle s’exprime sous la forme d’un biais (absolu et relatif).

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Biais absolu : babsolu = z – x

Biais relatif : brelatif (%)= ((z-x)/x)*100

z : concentration retrouvée x : valeur de référence

- Fidélité par niveau de concentration

Elle correspond à l’étroitesse de l’accord entre les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées.

- Intervalles de tolérance

Intervalle qui contient en moyenne une proportion β% définie de futurs mesurages obtenus selon un mode opératoire donné et pour une concentration donnée. La valeur de β est, généralement, choisie entre 80% et 95%.

Les calculs sont réalisés à l’aide d’un tableau Excel construit selon la feuille de calcul du profil d’exactitude, qui permet de réaliser le calcul pour un niveau de concentration.

(http://www.paris.inra.fr/metarisk/downloads/softwareprograms/exceltemplates).

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 Etape 9 : Construire le profil d’exactitude

Pour utiliser le profil d’exactitude en vue de valider une méthode, il faut avoir fixé deux critères de décision : la limite d’acceptabilité et la proportion β. Ces critères seront renseignés dans le tableau récapitulatif (tableau 7) :

 Limites d’acceptabilité

Elles servent à traduire les objectifs pratiques des utilisateurs. Elles délimitent un intervalle autour de la valeur de référence. Le plus souvent, ces limites sont réglementaires ou issues de la réglementation. Mais dans le cas où il n’existe pas de référence établie, il convient de prendre en compte les attentes des utilisateurs finaux, comme une limite de quantification donnée (LQ).

Dans le cas présent, afin d’arrêter une décision, nous avons fait varier la limite d’acceptabilité entre 10 et 25% (10, 20 et 25%).

 Proportion β

Elle représente la proportion de futurs résultats qui seront en moyenne compris dans les intervalles de tolérance. La valeur de β dépend largement du champ d’application. Plus β est petit, par exemple 70%, plus la méthode risque de produire des résultats qui ne correspondent pas aux spécifications annoncées. C’est pourquoi, dans la méthode du profil d’exactitude cette proportion a été fixée à 80%, au moins. Dans notre cas, la valeur 80% est fixée.

L’ensemble des données enregistrées permet ensuite de construire un graphique schématisant le profil d’exactitude de la méthode (figure 6) où figure en abscisses les niveaux de concentration et en ordonnées les pourcentages d’exactitude.

Sur l’axe vertical, peuvent être lues: les limites de tolérance haute et basse β (± 80% ici), le taux de recouvrement moyen et les limites d’acceptabilité haute et basse λ (±20% de la valeur cible dans le cas présent).

Sur l’axe horizontal, peuvent être lues les valeurs de la ligne « valeur cible » du tableau (valeurs de référence).

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Figure 6 : Exemple de profil d’exactitude obtenu suite à une validation de méthode

Plusieurs éléments d’appréciation apparaissent ainsi sur ce graphique :  Recouvrement

Il correspond à la justesse de la mesure.  Intervalle de tolérance

Il contient en moyenne une proportion β% définie de futurs mesurages obtenus selon un mode opératoire donné et pour une concentration donnée. Ses limites sont obtenues par le calcul, à partir de mesurages répétés. La valeur de β est, généralement, choisie entre 80% et 95%. Elle n’intervient que pour situer la limite de quantification de la méthode.

 Intervalle d’acceptabilité

C’est la spécification de la performance exigée pour la méthode, exprimée comme un écart acceptable autour de la valeur de référence. Les limites de l’intervalle sont fixées par le client ou par une obligation réglementaire, parfois en fonction du niveau de concentration. Elles sont notées ±λ en valeurs absolues et dans l’unité du mesurande ou (1±λ)*100 en valeurs relatives.

 Limite de quantification

C’est la plus petite et/ou plus grande quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une exactitude définie. Elle correspond à la concentration la plus petite et/ou la plus grande du domaine de validité.

70% 90% 110% 130% 150% 170% 190% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ex act itu de ( % ) Niveaux

Recouvrement (justesse) Limite basse tolérance (%) Limite haute tolérance (%) Limite d'acceptabilité basse Limite d'acceptabilité haute

Limite de quantification

Domaine de validité

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 Etape 10 : Interpréter le profil d’exactitude pour la validation

Il s’agit de déterminer les domaines de validation et de validité, à l’aide des 2 critères de décision β et λ pré-définis.

 Domaine de validation

Il représente l’ensemble des types de matrice auquel s’applique la méthode et gamme de concentrations sur laquelle a porté la validation.

 Domaine de validité

C’est l’ensemble des types de matrice auquel s’applique la méthode et gamme de concentrations sur laquelle a porté la validation et pour lequel les futurs résultats fournis par la méthode sont jugés valides.

3.3. Résultats- discussion

 Calcul des concentrations d’étalonnage et estimation des coefficients du modèle

d’étalonnage

Les concentrations d’étalonnage sont présentées dans le tableau 4 ci-après :

Tableau 4 : Calculs de l’étalonnage

Répétition 1 Répétition 2 1 0,017 0,018 31,25 33,09 2 0,017 0,016 31,25 29,41 3 0,018 0,02 33,09 36,76 4 0,019 0,022 34,93 40,44 5 0,02 0,022 35,85 40,44 6 0,019 0,019 34,01 34,93 7 . 0,021 38,6 8 0,015 0,013 27,57 23,9 1 0,025 0,024 62,5 60 2 0,027 0,024 67,5 60 3 0,026 0,027 65 67,5 4 0,027 0,03 67,5 75 5 0,031 0,029 76,25 71,25 6 0,025 0,026 62,5 63,75 7 0,03 0,029 75 72,5 8 0,022 0,02 55 50 Concentrati on 2 Niveaux des étalons (µg/ml) Séries (Jours) Valeurs de référence des étalons X Concentrati on 1 Réponses instrumentales Y 31,25 0,017 60 0,024

(21)

1 0,036 0,036 112,5 112,5 2 0,042 0,038 131,25 118,75 3 0,039 0,043 121,88 134,38 4 0,038 0,047 118,75 146,88 5 0,048 0,046 150 142,19 6 0,04 0,04 125 123,44 7 0,07 0,053 218,75 164,06 8 0,037 0,035 115,63 109,38 1 0,061 0,059 224,26 216,91 2 0,078 0,064 286,76 235,29 3 0,067 0,076 246,32 279,41 4 0,067 0,082 246,32 301,47 5 0,078 0,064 286,76 235,29 6 0,087 0,072 319,85 262,87 7 0,103 0,076 378,68 279,41 8 0,065 0,061 238,97 224,26 1 0,102 0,103 408 412 2 0,132 0,119 528 474 3 0,127 0,123 508 492 4 0,117 0,139 468 556 5 0,14 0,127 558 508 6 0,151 0,123 604 492 7 0,147 . 586 8 0,155 0,157 620 628 1 0,216 0,188 981,82 854,55 2 0,242 0,218 1100 988,64 3 0,217 0,23 986,36 1045,45 4 0,215 0,249 977,27 1131,82 5 0,246 0,217 1118,18 984,09 6 0,24 0,23 1088,64 1045,45 7 0,254 0,24 1154,55 1090,91 8 0,22 0,238 1000 1081,82 500 0,125 1000 0,22 250 0,068 125 0,04

(22)

Le modèle d’étalonnage choisi est une droite du type y=ax+b, les valeurs obtenues pour les coefficients a et b t ayant permis le calcul des concentrations (tableau 4) sont présentées dans le tableau 5.

L’équation moyenne est : y=4,1479x+0,0012

Tableau 5 : Valeurs de a et b Niveaux des étalons (µg/ml) Séries (Jours) Valeurs de référence des étalons X Valeur coefficient directeur a Valeur ordonnée b 1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 31,25 0,017 60 0,024 125 0,04

(23)

1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 1 3,4772424 3,483E-05 2 4,2823596 0,0034925 3 4,0218153 -0,000927 4 4,1679602 -0,003714 5 4,144307 0,0009241 6 4,3536603 -0,000552 7 4,402617 0,006225 8 4,3330775 0,0040771 4,1478799 0,0011951 1000 moyennes 250 0,068 500 0,125 0,22

(24)

 Calcul des concentrations prédites inverses

Les concentrations en TC des échantillons prédites inverses de chaque répétition sont calculées à partir des modèles d’étalonnage obtenus lors des différents dosages. Elles sont présentées dans le tableau 6.

Le calcul du coefficient de variation (CV= ET/ Moy *100) permet d’apprécier la dispersion des valeurs. Les valeurs aberrantes trop éloignées de la valeur moyenne ne sont pas prises en compte dans le calcul (Tableau 6).

Tableau 6 : Différents dosages

Code Labo

DATE

HR

%TC sec (mg/100mg) %TC sec (mg/100mg) _{moy G1 et}

G2

DOSAGE GAMME1 GAMME2

D00144 (A) 13/12/2016 93,25 1,91 2,07 1,99 14/12/2016 3,16 2,8 2,98 15/12/2016 2,63 2,25 2,44 16/12/2016 3,19 2,4 2,8 19/12/2016 2,7 2,66 2,68 21/12/2016 2,63 3,18 2,91 22/12/2016 2,15 3,73 2,94 23/12/2016 4,03 4,19 4,11 MOY 2,86 ET 0,68 CV 23,9 D00145 (C) 14/12/2016 95,25 7,21 7,32 7,265 15/12/2016 6,85 6,59 6,72 16/12/2016 7,56 5,91 6,735 19/12/2016 7,41 7,63 7,52 21/12/2016 6,88 7,21 7,045 22/12/2016 6,95 8,11 7,53 7,31 6,68 6,995 7,42 8,82 8,12 MOY 7,26 ET 0,71 CV 9,72

(25)

AL00200 (D) 13/12/2016 92,37 12,4 10,01 11,205 14/12/2016 10,56 11,11 10,835 15/12/2016 11,96 11,09 11,525 16/12/2016 13,31 11,17 12,24 21/12/2016 11,69 11,79 11,74 22/12/2016 13,18 13,87 13,525 29/12/2016 12,45 11,49 11,97 30/12/2016 12,14 14,27 13,205 MOY 12,03 ET 1,18 CV 9,8 D00137 (B) 13/12/2016 59,65 3,03 3,25 3,14 14/12/2016 5,23 3,1 4,165 15/12/2016 4,14 2,75 3,445 16/12/2016 3,69 2,9 3,295 19/12/2016 4,68 5,51 5,095 21/12/2016 3,19 4,14 3,665 2,77 2,33 2,55 6,92 8,4 7,66 MOY 3,8 ET 0,94 CV 24,65

(26)

 Calcul des critères de validation et interprétation du profil d’exactitude

Les critères de validation, pour la limite d’acceptabilité λ de 20% et la tolérance β de 80%, sont présentés dans le tableau 7. L’interprétation graphique correspondant aux 3 limites d’acceptabilité testées : 10, 20 et 25% est présentée sur les figures 7 , 8 et 9 ci après.

Tableau 7 : Profil d’exactitude

Profil d'exactitude

Probabilité tolérance (bêta) 80% Limite d'acceptabilité 20%

Niveaux Niveau A Niveau B Niveau C Niveau D

Valeur cible 3,16 4,38 7,37 12,59

Moyenne niveau 2,855 3,801 7,241 12,031

Ecart-type de répétabilité (sr) 0,484 0,853 0,645 1,04 Ecart-type inter-séries (sL) 0,498 0,406 0,122 0,577 Ecart-type de fidélité (sFI) 0,694 0,945 0,657 1,189

Rapport des variances (R) 1,057 0,227 0,036 0,308

Coefficient intermédiaire 1,046 1,048 1,032 1,038

Nombre de degrés liberté 11,205 10,216 14,848 13,742

Valeur basse tolérance 1,866 2,444 6,332 10,369

Valeur haute tolérance 3,844 5,158 8,15 13,692

Biais (%) -9,65% -13,22% -1,75% -4,44%

Recouvrement (justesse) 90,35% 86,78% 98,25% 95,56%

Limite basse tolérance (%) 59,04% 55,79% 85,92% 82,36%

Limite haute tolérance (%) 121,66% 117,76% 110,58% 108,75%

Limite d'acceptabilité basse 80,00% 80,00% 80,00% 80,00%

Limite d'acceptabilité haute 120,00% 120,00% 120,00% 120,00%

Incertitude

Ecart-type de l'IT (sIT) 0,7265 0,9905 0,6775 1,234

(27)

Figure 7 : Profil d’exactitude obtenu pour une limite d’acceptabilité λ de 10%

70% 80% 90% 100% 110% 120% 130% 0 2 4 6 8 10 12 14 Ex act itu de ( % ) Niveaux

(28)

Interprétation des résultats obtenus :  Limite d’acceptabilité λ

Les résultats obtenus montrent que plus λ augmente, plus le domaine de validité augmente. De plus, pour λ=10%, les limites de tolérance sont en dehors des limites d’acceptabilité, donc la méthode est en dehors du domaine de validation. On ne pourra pas valider la méthode. D’autre part, la limite de quantification est élevée (environ 9%).

Pour λ=25%, les limites d’acceptabilité sont trop éloignées des limites de tolérance, on ne peut donc pas déterminer graphiquement la limite de quantification.

λ=20% est le meilleur compromis entre domaine de validité et intervalle d’acceptabilité. On

choisira donc λ=20% pour la suite de la validation.

 Limite de quantification et Domaine de validité

Pour λ=20% et ẞ=80%, le domaine de validation de la méthode est compris entre 3,16%

et 12,59% qui sont les valeurs de référence des concentrations extrêmes.

Pour λ=20% et ẞ=80%, la limite de quantification se situe entre les niveaux de concentration A et B. Elle a une valeur d’environ 3,8% (détermination graphique).

On observe que les limites de tolérance à 80% sont comprises entre les limites d’acceptabilités dans un domaine de validité qui s’étend d’environ 3,8% à 12,5%TC. On ne pourra donc utiliser cette méthode que pour des échantillons compris dans cet intervalle de concentrations.

 Fidélité et justesse

On observe que la fidélité varie en fonction de la concentration : la méthode est plus fidèle

pour de fortes concentrations (l’écart-type de fidélité varie de 0,694 à 1,189 entre les niveaux A et D, tableau 6).

D’autre part, on observe une bonne justesse moyenne (>85%). La justesse varie également en fonction de la concentration (90% pour les plus basses concentrations et tend vers 95% pour les plus fortes concentrations). La méthode est donc plus juste lorsque la concentration en

TC augmente. 70% 80% 90% 100% 110% 120% 130% 0 2 4 6 8 10 12 14 Ex act itu de ( % ) Niveaux

(29)

Le biais de justesse n’est pas déterminable du fait que les valeurs de référence aient été déterminées en prenant les moyennes des valeurs obtenues.

4. Conclusion et perspectives

L’objectif de ce travail de stage était de valider la méthode de dosage développée au laboratoire pour le dosage des tanins condensés dans les aliments et produits animaux.

Au travers de la validation réalisée, on peut conclure à la capacité de la méthode à quantifier les TC dans le domaine de validité défini entre 3,16% et 12,59%.

Ce résultat correspond aux attentes du laboratoire pour les gammes de concentration actuellement dosées. Cependant, cette validation est limitée du fait qu’elle n’est valable que sur une plage de concentrations données.

Compte tenu de la complexité des TC et de la diversité de leurs teneurs dans les plantes, il sera nécessaire de procéder à une nouvelle validation en élargissant le domaine de validation (inférieures à 3,16% de TC ou supérieures à 12,59% de TC), afin d’affiner le domaine de validité de la méthode, notamment pour la détermination de faibles concentrations de TC.

(30)

Références

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(21) Validation des méthodes d’analyse quantitative par le profil d’exactitude, cahier des techniques de l’INRA, 2010.

(22) Feuille de calcul du profil d’exactitude :

(http://www.paris.inra.fr/metarisk/downloads/softwareprograms/exceltemplates)