Développement et validation d’une méthode de dosage des traces de détergents inactivants totaux du prion

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ARTICLE ORIGINAL

Développement et validation d’une méthode de dosage des traces de

détergents inactivants totaux du prion

Development and validation of an analytical method to quantify residues of cleaning products able to inactivate prion

T. Briot

^a^,^b

, A. Robelet

^a

, N. Morin

^c

, J. Riou

^b

, B. Lelièvre

^c^,^d

, A.-V. Lebelle-Dehaut

^a^,∗

aServicedestérilisation,centrehospitalieruniversitaired’Angers,4,rueLarrey,49933 Angers,France

bMicro-etnanomédecinesbiomimétiques,InsermU1066,universitéNantesAngersLeMans, 4,rueLarrey,49933Angers,France

cLaboratoiredepharmacologie—toxicologie,centrehospitalieruniversitaired’Angers,4,rue Larrey,49933Angers,France

dGrouped’étudedesinteractionshôtes-pathogènes,UPRESEA3142,universitéNantes AngersLeMans,4,rueLarrey,49933Angers,France

Reçule2octobre2015;reçusouslaformeréviséele7décembre2015;acceptéle9décembre 2015

DisponiblesurInternetle13janvier2016

MOTSCLÉS Prion; Stérilisation; Potassium; ICP-MS;

Laveurdésinfecteur

Résumé

Objectifs.—L’objectifprincipaldecetteétudeestdedévelopperuneméthodeanalytiquede dosagedesdétergents désinfectantsprionicides dansleseauxderinc¸age deslaveursdésin- fecteursd’unservicedestérilisation.Cetteméthodedoitêtresimpleàmettreenœuvreet utilisableenroutine àl’hôpital pourpermettre des’affranchir desdosages réalisésparles fabricantsdedétergentsdésinfectantsprionicides.

Méthode.—UneméthodeICP-MSbaséesurledosagedupotassiumdansleseauxderinc¸aged’un laveurdésinfecteuraétédéveloppée.Eneffet,lestroisdétergentsdésinfectantsprionicides actuellementsur le marché contiennent del’hydroxyde de potassium.Le détergent utilisé dansl’étudeaétédel’Actanios^®LDI(LaboratoireAnios).UnerégressiondePassingetBablok compare desrésultatsobtenuspar cettenouvelle méthodeà d’autresobtenus grâceàune méthode(HPLC-UV)développéeparlelaboratoireAnios.

∗Auteurcorrespondant.

Adressee-mail:avlebelle-dehaut@chu-angers.fr(A.-V.Lebelle-Dehaut).

http://dx.doi.org/10.1016/j.pharma.2015.12.003

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Résultats.—Laméthodedéveloppéeestsimpleàmettreenœuvreenroutineetlarégressionde PassingetBablokréaliséemontrequelesdeuxméthodesontétééquivalentessurles15dosages réalisésdansladeuxièmeeauderinc¸age.Lesdeuxméthodesontétélinéairesmaisavecune différencede1,5ppmsurlatroisièmeeauderinc¸age.

Conclusion.—La méthode ICP-MS développée est non spécifique du détergent étudié mais spécifiquedel’élémentpotassiumprésentdanstouslesdétergentsdésinfectantsprionicides actuellementsur le marché.Elle pourraitdonc probablement être appliquée àl’ensemble desdétergentsdésinfectantsprionicidesaprèsavoirvérifiéqu’elleestsuffisammentsensible lorsquelesconcentrationsenpotassiumdansledétergentsontfaibles.

KEYWORDS Prion;

Sterilization;

Potassium;

ICP-MS;

Washer-disinfector

Summary

Objectives.—Inthisstudy,anovelanalyticalmethodtoquantifyprioninactivatingdetergent inrinsingwaterscomingfromthewasher-disinfectorofahospitalsterilizationunithasbeen developed.Theﬁnalaimwastoobtainaneasyandfunctionalmethodinaroutine hospital processwhichdoesnotneedthecleaningproductmanufacturerservices.

Methods.—AnICP-MSmethodbasedonthepotassiumdosageofthewasher-disinfector’srinsing waterswasdeveloped.Potassiumhydroxideispresentonthecompositionofthethreeprion inactivatingdetergentcurrentlyontheFrenchmarket.Thedetergentusedinthisstudywas theActaniosLDI^®(Anioslaboratories).APassingandBablokregressioncomparesconcentrations measuredwiththisdevelopedmethodandwiththeHPLC-UVmanufacturermethod.

Results.—According toresultsobtained, thedeveloped methodis easyto useinaroutine hospitalprocess.ThePassingandBablokregressionshowedthatthereisnostatisticaldifference betweenthetwoanalyticalmethodsduringthesecondrinsingstep.Besides,bothmethodswere linearonthethirdrinsingstep,witha1.5ppmdifferencebetweentheconcentrationsmeasured foreachmethod.

Conclusions.—ThisstudyshowsthattheICP-MSmethoddevelopedisnonspecificforthedeter- gent,butspecificforthepotassiumelementwhichispresentinallprioninactivatingdetergent currentlyontheFrenchmarket.Thismethodshouldbefunctionalforalltheprioninactivating detergentcontainingpotassium,ifthesensibilityofthemethodissufficientwhenthepotassium concentrationisverylowintheprioninactivatingdetergentformulation.

Introduction

Depuis 2012, les exigences concernant la prévention des agents transmissibles non conventionnels (ATNC), notam- mentlesprionsagentsdesencéphalopathiesspongiformes transmissibles, ont amené les services de stérilisation franc¸ais à modiﬁerleurs paramètres delavage des dispo- sitifsmédicaux(DM)etàutiliser desdétergentsalcalinsà fortesconcentrations.

L’instructionministériellefrançaiseDGS/RI3nô2011-449 [1] définit les tissus à risque, le niveau de risque des patients,ainsiquelesprocédésefficacesvis-à-visdesATNC.

Àcetitre, l’immersion des DMdans lasoude 1Npendant 60minàtempératureambianteestprésentéecommelepro- cédéderéférenced’inactivationtotaledesATNC,utilisable enpratiqueenstérilisation.

L’Agencenationaledesécuritédumédicament(ANSM)a égalementétabliunProtocoleStandardPrion(PSP)[2].Ce PSPdéﬁnitlesméthodesd’évaluationdesperformancesdes produitsouprocédésalternatifsàlasoudequirevendiquent

uneéliminationouuneinactivationdesATNC.L’inactivation des ATNC est définie comme un traitement conduisant à une réduction de l’infectiosité sur le DM traité et dans lesliquidesayantserviàsontraitement.L’inactivationest totale lorsque l’infectiosité n’est plus détectable suivant lesanalyses réalisées enrespectantlescritères méthodo- logiquesretenusdanslePSP[1].L’ANSMpublielalistedes produitsetméthodescommercialiséspourleuractivitéprio- nicideetévaluésauregarddesspécificationsdéfiniesparle PSP.

En 2015, selon l’ANSM [3], trois détergents pour uti- lisation en laveurs désinfecteurs se revendiquent d’une inactivation totale des ATNC et ﬁgurent sur cette liste.

Ils sont qualiﬁés de détergents désinfectants prionicides (DDP).Touscontiennentdel’hydroxydedepotassiumdans leur formulation à des concentrations variables: moins de 1% pour le Néodisher Septoclean^® (Dr Weigert) [4], 17,5% pour l’Actanios LDI^® (LDI) des laboratoires Anios [5] etmoins de25%m/v pour le Hamo 100^® (laboratoire Stéris)[6].

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Pourobteniruneactivitédetypeinactivationtotaledes ATNC,l’ensemble deces DDP doitêtre utiliséà defortes concentrationsc’est-à-direentre0,8%v/v(Hamo100)et1% v/v(LDIetSeptoclean^®)[5—7].Ors’ilssontmalrincés,les résidusdecesproduitssurlesDMpeuventêtreàl’origine detoxicitécellulairepourlepatient[8,9].

LesexigencesgénéralesdelanormeISO15883-1surles laveursdésinfecteurs[10]demandentdoncdequantifierles résidusdeproduits chimiques aprèsrinçageetdedémon- trerqu’ilnerestepassurlesDMoudansl’eauderinçage finaledeproduitschimiquesenconcentrationsupérieureà laconcentrationlimitedéfinieparlesfabricantsdedéter- gents [11]. Ces derniers doivent ainsi définir les valeurs limitessansdangertoxicologiquedanslesrésidusd’eaude rinçageetmettreàdispositiondesservicesdestérilisation lesméthodesanalytiquesàutiliserpourdétecterlesrésidus duprocédé[11].

AuCHUd’Angers,ledétergentinactivanttotaldesATNC utiliséestleLDI(Actanios^®).Employéàuneconcentration de 1% v/v et à 55^◦C pendant 10min, ce produit reven- diqueuneactivitédetypeinactivationtotaleauregarddu PSP [3,5]. Le LDI est un dispositif médical de classe IIb, (conformémentàlarègle15del’annexeIXdeladirective 93/42/CEEdu14juin1993[12]).Ilcontientdel’hydroxyde depotassium etdu silicate desodiumtous deuxcorrosifs [13,14].Sachantquedestracespeuvententrerencontact avec la peau ou les muqueuses, le LDI doit faire l’objet d’uneévaluationbiologiqueconformémentauxexigencesde lanormel’ISO10993-1[8].L’étudedecytotoxicitésurcel- lulesdemammifèresréaliséeparlelaboratoireAnios,selon laméthodologieduchapitre5delanormel’ISO10993-1de 2009 [15], nemettait pas en évidencede potentiel cyto- toxique pour des teneurs inférieures ou égales à 10ppm [16].

La quantité maximale tolérable dans la dernière eau derinc¸age, déﬁnieparle fabricant,estdoncde 10mg/L.

Le laboratoire Anios propose le dosage de résidus de LDI dans leseauxde rinc¸age,qu’ilréalisedans soncentre de recherche à Sainghin-en-Mélantois, par une méthode de chromatographieliquideenrajoutantaudétergentunaddi- tifdétectableenUV(HPLC-UV).

L’objectifprincipaldecetteétudeestdedévelopperune méthode analytique dedosage des DDP dans leseaux de rinçage, simple à mettre en œuvre et utilisable en rou- tine à l’hôpital. Elle doit permettre de s’affranchir des dosagesréalisésparlesfabricantsdeDDP. Cetteméthode estbaséesurledosagedupotassium,puisquelestroisDDP actuellementsurlemarchécontiennentdel’hydroxydede potassium[5—7].Unecomparaisonstatistiquedesrésultats obtenusparcetteméthodeetdeceuxobtenusparlefabri- cant sera réalisée. L’objectif secondaire est de disposer d’une méthode permettant de s’assurer que les concen- trationsutiliséesaumomentdulavagesontprionicideset d’optimiser les étapes de rinçages pour se placer sous le seuildetoxicitéduDDPdansleseauxderinçage.

Matériel et méthodes

Ungroupedetravailmultidisciplinairecomposédepharma- cienshospitaliers,debiologistesetd’unbiostatisticienaété constituépourremplircesobjectifs.

Matériel

Lematériel utilisécomprend unlaveurdésinfecteur(LD), unDDP, de l’eauosmosée, une balance, unspectromètre demassecoupléàunplasmainductif(ICP-MS).Lesdosages effectuésparlelaboratoireAniosontétéréalisésenHPLC- UV.

Le LDI a été gracieusement fourni par le laboratoire Anios(Lille-Hellemmes,France).Cedétergentestcomposé d’un mélange d’hydroxyde de potassium à 17,5% m/m (soit12,2%m/menpotassium,celui-cireprésentant69,7% de la masse d’une molécule d’hydroxyde de potassium), de tensioactifs, d’agents dispersants, d’anticorrosifs et d’excipients.Lesdeux lots(R33860etR33861) fournispar Anioscontiennentunchromophore,letolyltriazole,dontle maximumd’absorptionsesitueà260nm.Ladensitérelative duLDIestde1,31.Lorsqu’ilestdiluéà1%v/vdansdel’eau, etappliquépendant10minà55^◦C,ceproduitprésentedes propriétésdetypeinactivationtotaleduprionauregarddu PSP[3].

LeLD(Fig.1)utiliséaétéuntunnelLDWD380^TM(Beli- med,Ball,Suisse)composédetroischambresetde4cuves.

DanslapremièrechambrealieulelavagedesDM(alimentée parlacuvenô2)etunpremierrinçagedontl’eauprovient delacuvenô1.Danslasecondechambre,sedéroulentun deuxièmerinçage(cuvenô3),puisladésinfectionthermique (cuvenô4)quiaétéconsidéréecommeuntroisièmerinçage.

Latroisièmechambre est destinée auséchage des instru- ments. Les cuves 3et 4sont alimentées en eau osmosée (CulliganMFP400^TM,Voisins-le-Bretonneux,France).

Le matériel comprend également une balance (Ohaus EB30,Nänikon, Suisse)ayant uneprécision d’afﬁchage de 1g,unéchelonréeld=1g,unéchelondevériﬁcatione=1g.

Lepoidsminimalquipeutêtrepeséestde1g.Cettebalance estétalonnéetouslessixmois.

Un spectromètre de masse couplé à un plasma induc- tif(ICP-MS),Agilent 7500AICP-MS^TM(Agilent Technologies, SantaClara,États-Unis),aétéutilisé.Lapuretédel’argon utiliséaétésystématiquementsupérieureà99,999%(Mes- ser, Saint Herblain, France). Les échantillons ont été introduitsdansunechambredenébulisationdetypeScott grâce à une pompe péristaltique intégrée. Le nébulisat forméestacheminédansunplasmaoùilestdéshydraté,ato- miséetionisé.Lessignauxdeséléments(m/z)sontdétectés etquantiﬁés.

La solution de potassium 10g/L, HNO3 5% Certispex a étéfournie parHoriba(Irvine,États-Unis)etcelled’acide nitriqueSuprapur^®parMerck(Darmstadt,Allemagne).L’eau utiliséepourledosageenICP-MSaétéosmosée,puisdémi- néraliséegrâce à unsystème MilliQPLUS185^TM (Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines,France).L’eauobtenueprésente unerésistivitéde18,2Mohms·cmà25^◦C.

Les dosages du fabricant ont été réalisés par chroma- tographieliquidehauteperformancesurunsystèmeWaters Alliance^TM2695(Waters,Saint-Quentin-en-Yvelines,France) sur une colonne Hypurity^® (Hypersil) C18 4,6×250mm, 5␮m,lefouraététhermostatéà30^◦C.Laphasemobilea étécomposéed’unmélanged’eauetd’acétonitrile(70/30) àun débit de 1mL/min, enmode isocratique. Le volume d’injectionaétéde50␮L[17].Ladétectionaétéeffectuée à260nmsurundétecteuràbarrettedediodesWaters2996 (Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines,France). Les résultats

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Figure1. Représentationschématiqued’untunneldelavageBelimedLDWD380.

SchematicrepresentationofthewasherdisinfectorBelimedLDWD380.

delavalidationdecetteméthoden’ontpasétécommuni- quésparlefabricantetneserontdoncpasprésentésdans lesrésultats.

Méthodes

Cycles de lavages effectués par le LD

Quinze cycles de lavage completsont été effectués(soit unlavagesuivi detrois rinc¸ages etd’un séchage)sur des instrumentschirurgicauxrépartisdemanièrealéatoire.

Validation de la méthode ICP-MS de dosage du potassium

Pour doser le potassium dans les eaux de rinc¸age, une méthodeICP MSa étédéveloppéeselonles recommandations du COFRAC [18] et les conférences internationales d’harmonisation,ICHQ2(R1)[19].

Lagamme étalon dupotassium (K,m/z 39)a été éta- blieentre0,25et5,00mg/L.Cinqcontrôlesinternesà0,75; 1,25;2,00;3,00et4,00mg/Lontétéutilisés.

Laméthodeaétévalidéeentermesdeﬁdélitéintermé- diaire,justesse,linéarité,contaminationinter-échantillons etlimitedequantiﬁcation(LOQ).

Lafidélitéintermédiaireaétéévaluéeaprès5passages decontrôlequalitéetce,surquatrejours. Laprécisiona étécalculéeparlecoefficientdevariationexpriméenpour- centage.Ce coefficientnedoitpasêtresupérieurà±15% (±20%pourlaplusfaibleconcentration).

Lalinéaritéaétéévaluéeaprèspassageentriplicatdes pointsdegamme etappréciéeparlecalculducoefﬁcient decorrélation(r²)quidevaitêtresupérieurà0,990.

Lacontaminationinter-échantillonsaétéévaluéeàcinq reprises:lestandardleplusélevéestpassétroisfois,puis

suividel’échantilloncorrespondantàlaLOQ(injectétrois fois).

LaLOQaétévalidéeaprèspassaged’unéchantillondix fois,puiscalculdel’écartàlaconcentrationthéoriquequi doitêtreinférieurà20%.

Préparation des échantillons

Pour le dosage du potassium (K, m/z:39) en ICP-MS, les échantillonsontétédiluésaudemiavecunesolutiond’acide nitriqueà1%contenantl’étaloninterne(Eu,m/z:153).

Lepotassiumcontenudansl’eauosmoséealimentantles cuves 3et4a d’abord été dosé. Cette quantité ﬁxedans l’eau osmosée a par la suite systématiquement été sous- traitedesrésultatsdel’ensembledesdosagesdepotassium.

LaconcentrationenpotassiumdansleLDIaétémesurée parlaméthodeICP-MSetcomparéeauxdonnéesdufabri- cant.PourchaquelotdeLDI,unesolutionà15mg/Letuneà 5mg/Ldansdel’eauosmoséeontétépréparées,puisdosées parICP-MS.

Pouranalyserlesrésidusdedétergentdanslescuves3et 4,deséchantillonsd’unlitreontétéprélevés30secondes avant la fin des deux derniers rinçages dans ces deux cuvessurles15cycles,soit30échantillons.Tousleséchan- tillons ont été doséspar HPLC-UVet par ICP-MS. Puisque la concentrationenpotassiumdans le LDIaété mesurée, lesconcentrationsmesuréesenpotassiumdansleseauxde rinçageontétéconvertiesenconcentrationenLDI.

Comparaisons des deux méthodes de dosage

Pourcomparerlesdeuxméthodesdedosages(HPLC-UVet ICP-MS),leséchantillonsontdoncétéappariés.

Pour répondre à l’objectif principal de l’étude, une régressiondePassingetBablokaétéréaliséeaﬁndecompa- rerlesrésultatsdesdosagesobtenusparlaméthodeICP-MS

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àceuxdufabricantdeLDI[20].L’objectifdecettesection consistedoncàexpliquerlaméthodologieinhérenteàcette méthodederégression.

Contrairementàuneméthodederégressionlinéaireclas- sique,cetterégressionnonparamétriquenedemandeque peud’hypothèsesetestrobusteauxvaleursextrêmeset/ou aberrantes.Laréalisationdumodèlenécessitequelesdis- tributionsdes deuxvariablesaléatoiressuivent unemême distributioncontinuesurl’ensembledelarégiond’intérêt.

Il sera égalementsupposé une relation linéaire entreces deuxvariables, soitY etX, ces variablesaléatoires. Elles représententrespectivementla mesurededosage pour la méthode ICP-MS et celle du fabricant LDI, soit les deux modèleslinéairessuivant:

Yi= ␣+ ␤Xi+␩i, (1)

Xi= A+ BYi+␰i (2)

avec B=1/␤, A=− ␣/␤, et ␩ et ␰ quisuivent une même distribution.Ilest intéressantd’observer queles modèles supposent que les deux variables d’intérêt puissent être décomposéesenunepartiedéterministeetunepartiealéa- toire.

Finalement, un focusa été fait sur le modèle(1) aﬁn d’interpréterlarelationentreledosageparlaméthodeICP- MS(X)etceluidufabricantduLDI(Y).Lesvaleurs␤dela pente,et␣del’ordonnéeàl’originesontdoncessentielles àl’interprétation.

Cesvaleurs,ainsiqueleursintervallesdeconfianceont été estimées à l’aide des modèles (1) et (2).Une fois le modèleobtenu,ilaéténécessairedetesterlasignificati- vitéduparamètred’ordonnéeàl’origine(H01:␣=0),ainsi que celle du paramètre de pente (H02: ␤=1). Ces tests d’hypothèses ontété réalisésens’appuyant surles inter- vallesdeconfianceà95%desparamètresestimés.

Si le test d’hypothèse concernant le paramètre d’ordonnéeàl’originerejettel’hypothèsenulleH01alorsles deuxméthodesdiffèrentd’unevaleurconstante(biais).

Concernantleparamètredepente,sil’hypothèsenulle H02estrejetée,alorsilexisteaumoinsunedifférencepro- portionnelleentrelesdeuxméthodesétudiées.

Cependant, si ni l’hypothèse nulle du paramètre de pente,nicelledel’ordonnéeàl’origine,nesontrejetées, alorslesdeuxméthodesétudiéessontsupposéesidentiques.

Il est également nécessaire de vérifier l’hypothèse de linéaritésupposéeentrelesdeuxvariables,ilconvientdonc, commeleproposePassingetBablok,deréaliseruntestde linéarité.CetestditduCUSUM(«cumulativeofthescores») permet de vérifier la stabilité du modèle sur l’ensemble delarégiond’intérêt.Sousl’hypothèsenulle(H0:larela- tionentrelesdeuxvariablesestlinéaire),cettestatistique de test suit une distribution de Kolmogorov-Smirnov. Si l’hypothèsenulleestrejetéeaurisquedepremièreespèce à5%,alorslarelation entrelesdeux mesuresdeconcen- trationestnonlinéaire,cequisignifiequelarégressionde PassingetBablokestnonapplicable.

L’ensembledel’analyseaétéréaliséesouslelogicielsta- tistiqueR(v3.2.1).Enplusdesfonctionsdebaseprésentes auseindecelogiciel,lespackages«MethComp»et«mcr» ontétéutilisés[21].

Concentration en LDI dans les eaux de lavage

L’objectifsecondairedecetteétudeaétédes’assurerque lesconcentrationsdeLDIdansleseauxdelavagesontprio- nicides,c’est-à-direéquivalentes à1% v/v. Une méthode gravimétriquea été utilisée pour déterminerces concentrations dans la cuve n^o2. En effet, la concentration en potassiumn’apaspuêtresuiviepuisquecettecuveestali- mentéeeneauduréseauoùlesconcentrationsenpotassium sontvariables.

PourdéterminerlaconcentrationcalculéedeDDPdans lasolutiondelavagedes15cycles,lamassedeLDIprélevée parleLDaétémesurée,puisdiviséeparladensitéduLDI pourconvertirlamasseenvolume.Cevolumeaensuiteété diviséparle volumed’eaucontenuedelacuve2(53L)et convertienpourcentagepourobtenirunpourcentagev/v.

Surquatrecycles(cuven^o2,cycles2,9,13,15),cesconcen- trationscalculéesontétécomparéesàcellesobtenuesgrâce auxdosagesHPLC-UV.

Pour comparer statistiquement ces concentrations, un testnonparamétriquedes rangssignésdeWilcoxon aété effectuésurlesconcentrationsàlafoiscalculéesparpesées etmesuréesparHPLC-UV(n=4).

Résultats

Validation de la méthode ICP-MS de dosage du potassium

Laﬁdélitéintermédiaireetl’inexactitudeontétérespecti- vementinférieures à1,0et2,5%. Lalinéarité (r²>0,996), la LOQ de 0,25mg/L (l’écart maximal à la concentration théoriqueasystématiquementétéinférieurà12,72%)etla contaminationinter-échantillons ont respecté les critères devalidationdelaméthode.

Concentration de potassium dans l’eau osmosée

Laconcentrationcontenuedans l’eauosmoséealimentant lescuves3et4étaitde0,44mg/Lenmoyenne.

Concentration en potassium dans les lots de LDI utilisés

Sur les deux lots de LDI utilisés pendant les essais, les concentrations moyennes en potassium ont été de 12,2±0,4%(m/m).

Dosage du LDI dans les eaux de rinc ¸age

Les concentrations en LDI qui ont été calculées à partir desconcentrationsenpotassiummesuréesparICP-MSetles concentrationsenLDIdoséesparHPLC-UVontétéindiquées dansleTableau1.

Comparaison des deux méthodes de dosage

Concernant la cuve 3, avec un intervalle de conﬁance à 95%l’estimation duparamètre depente(␤) acontenula valeur1 (IC95=[0,76; 1,38]). L’intervalle de conﬁance à

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Tableau1 DosagedesrésidusdeLDIdansleseauxderinc¸agedescuves3et4selonlesméthodesICP-MSetHPLC-UV.

DosageofLDIremnantsinrinsingwaterofthereservoirs3and4accordingtotheICP-MSandtheHPLC-UVmethods.

Cycle 2êétapederinçage(chambre2—cuve3) 3êétapederinçage(chambre2—cuve4) LDI

ICP-MS mg/L

LDI HPLC-UV mg/L

LDI ICP-MS mg/L

LDI HPLC-UV mg/L

1 12,5 4,60 2,05 2,00

2 17,0 11,7 0,738 2,00

3 27,3 24,1 2,95 4,40

4 29,6 25,0 4,51 4,10

5 28,8 23,9 3,85 4,70

6 27,4 22,8 2,38 3,10

7 29,8 25,8 2,87 4,10

8 32,0 27,9 3,20 4,10

9 30,7 27,6 4,43 5,40

10 28,3 26,1 2,54 3,30

11 27,3 26,1 5,66 3,90

12 23,7 22,5 2,05 2,70

13 25,7 24,5 6,07 6,70

14 23,9 22,1 2,05 3,30

15 34,7 33,5 5,49 5,80

Laconcentrationde LDIindiquéetient comptede laprésence depotassiumdans l’eauosmosée (concentration 0,44mg/L).Cette

«contamination»asystématiquementétésoustraitedesrésultatsdesdosagesdepotassiumdanslescuves3et4avantlaconversion delaconcentrationenpotassiumàcelleenLDI.

95% du terme d’ordonnée à l’origine (␣), quant à lui a contenulavaleur0(IC95=[−6,76;8,90]).Devantcesrésul- tats,nil’hypothèse nulleduparamètredepente,nicelle del’ordonnéeà l’origine,n’ont étérejetées aurisquede secondeespèce.

Il a ensuite été vériﬁé si la supposée relation linéaire entrelesdeuxmesuresdedosagesaétécorrecte,etqu’elle aétéstablesurl’ensembledudomained’intérêt.Laréalisa- tiondutestCUSUMn’apaspermispasderejeterl’hypothèse nulle(p=0,93)aurisquedesecondeespèce(Fig.2).

Une méthodologie similaire a été appliquée pour la comparaisondes méthodesanalytiquesdedosagespourla cuve4.L’intervalle deconﬁance à95%del’estimationdu paramètre de pente associé à la régression a contenu la valeur1(IC95=[0,82;1,48]).

Cependant l’intervalle de conﬁance à 95% de l’estimationdu paramètre d’ordonnée à l’origine n’a pas compris la valeur 0 (IC95=[−2,98; −0,33]). L’hypothèse nulleassociéeàcetestadoncétérejetée.

Le test CUSUM réalisé a posteriori a validé la relation delinéarité entrelesdeuxvariables, ainsiquela validité dumodèlesurl’ensemblede larégiond’intérêt(p=0,99) (Fig.3).

Concentration en LDI dans les eaux de lavage

LesconcentrationsenLDIcalculéesgrâceauxpeséesdeLDI etcellesmesuréesparlefabricantontétéindiquéesdans leTableau2.

Letest desrangssignésdeWilcoxonn’a paspermisde rejeterl’hypothèse nulle H0au risque de seconde espèce (p=0,17).

Figure2. RégressionPassingetBablokmodélisantlamesurede dosageparlaméthodedufabricantLDIenfonctiondelaméthode ICP-MSauseindelaCuve3(n=15).Lalignecontinuereprésente l’estimationdelacourbederégression(ˆy=5,705+0,9011xi),et celleenpointillélacourbed’équation ˆy=x.

PassingandBablokregressionoftheAniosmethodagainsttheICP- MSmethodinthereservoir3(n=15).Thecontinouslinerepresents the estimated regressioncurve (ˆy=5,705+0,9011xi), and the dottedlinerepresentsthecurveyˆ=x.

Discussion

Comparaison des méthodes analytiques

La méthode ICP-MS a été validée selon les recommandations du COFRAC et des ICH. Ces recommandations sont

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Tableau2 ConcentrationsthéoriquesdansleseauxdelavagedeLDIcalculéesàpartirdesmassesdeLDIprélevéespar l’automateetconcentrationsmesuréesparHPLC-UV.

TheoricalconcentrationsofLDIincleaning calculatedfrom themassesofLDItakenfrom thewasherdisinfector,and measuredconcentrationsbytheHPLC-UVmethod.

Cycle MassedeLDI(kg) Concentrationcalculée(%v/v) Concentrationmesurée(%v/v)

1 0,668 0,96 /

2 0,702 1,01 1,02

3 0,700 1,01 /

4 0,692 1,00 /

5 1,000 1,44 /

6 0,396 0,57 /

7 0,690 0,99 /

8 0,690 0,99 /

9 0,694 1,00 1,00

10 0,682 0,98 /

11 0,718 1,03 /

12 0,712 1,03 /

13 0,716 1,03 1,05

14 0,718 1,03 /

15 0,716 1,03 1,05

/:dosagenonréalisé.

Figure3. RégressionPassingetBablokmodélisantlamesurede dosageparlaméthode dufabricant LDIfonction delaméthode ICP-MSauseindelaCuve4(n=15).Lalignecontinuereprésente l’estimationdelacourbederégression(ˆy=−1,504+1,107x_i),et celleenpointillélacourbed’équation ˆy=x.

PassingandBablokregressionoftheAniosmethodagainsttheICP- MSmethodinthereservoir4(n=15).Thecontinouslinerepresents theestimatedregressioncurve (ˆy=−1,504+1,107xi),andthe dottedlinerepresentsthecurveˆy=x.

lesdeuxgrandsréférentielstraditionnellementutiliséspour validerlesméthodesanalytiquesdebiologiemédicaleetde contrôlepharmaceutique.

La LOQdela méthodeICP-MS aété fixéeà 0,25mg/L, soit2,05mg/LdeLDI.QuantàlaméthodeHPLC-UV,laLOQ a été définie à 2,00mg/L de LDI.La méthode ICP-MS est doncspécifiquedupotassiummaispasduLDI,etestaussi sensiblequelaméthodedufabricantpourladétectiondu LDI.

Les concentrations en potassium des deux lots de LDI mesurées par la méthode ICP-MS ont été conformes aux concentrationsthéoriques[5],c’est-à-dire12,2%.Ainsi,les concentrations mesurées en potassium dans les eaux de rinc¸ageontétéconvertiesdanscetteétudeenconcentra- tionenLDI.

LesrésultatsdelarégressiondePassingetBabloksurla cuve3ontindiquéquelesdeuxméthodesontété équiva- lentessurles15dosagesréalisés.Deplus,larelationlinéaire estvériﬁée.

Néanmoins,lorsdecedeuxièmerinc¸age,lesdifférences entrelesrésultatsdesdeuxméthodesconcernantlesdeux premiers cycles ont été très importantes sans qu’aucune cause n’ait pu être identiﬁée (Tableau 1). Elles ont été abaisséessurlescyclessuivants,malgrédesmodesdeprélè- vementsstrictementidentiques.Enrevanche,lesquantités résiduellesabsoluesdeLDIsurcesdeuxpremierscyclesont étébeaucoupmoinsimportantesquesurlescyclessuivants, cequipeut expliquerune augmentationdel’écartrelatif entrelesrésultats.

Encequiconcernelacuve4,l’hypothèsenulleH01aété rejetéeetiladoncexisté unedifférenceentrelesrésul- tatsdesdeuxméthodes,celle-ciétanttoutefoisminimecar mesuréede façon constante à1,5mg/L.Enrevanche,les deux méthodes sont linéaires sur l’ensemble du domaine étudié.Laméthodededosagedupotassium(ICP-MS)donne desrésultats,enmoyenne,inférieursde1,5mg/Lparrap- portàlaméthodedufabricant.PuisquelefabricantduLDI fixeunseuildecytotoxicitéde10mg/L[16]dansl’eaude rinçagedeladernièrecuve,enutilisantlaméthodeICP-MS leseuilaétéabaisséà8,5mg/Lpourleréglagedesétapes derinçageduLD.

L’ensembledesparamètresdelaméthodefabricantn’a pasétécommuniqué,maisuneprécisionouunejustesseplus élevéedelaméthodeICP-MSparrapportàlaméthodeHPLC- UVpourraitégalementexpliquercettedifférencemoyenne

(8)

de1,5ppm mise enévidence surdes concentrations rési- duellestrèsfaibles.

Concentration en LDI dans les eaux de lavage

LaméthodeICP-MSestuneméthodespécifiquedupotassium maisnonspécifiqueduLDIetnepeutêtreutiliséequedans deseauxoùlesconcentrationsenpotassiumsont connues etfixées.Ainsi iln’apasétépossible,parcetteméthode, dedoserlesconcentrationsenLDIdansleseauxdelavages.

Eneffetlachambre1dutunnelestalimentéeavecdel’eau adoucie.

Au vu des résultats du test des rangs signés de Wil- coxon (p=0,17), il n’a pas été possible de démontrerde différencesigniﬁcativeentrelesconcentrationsenLDIdans lessolutionsdelavagemesuréespar peséeoupardosage enHPLC-UV,au risquedepremièreespèceà5%. Ainsi,la méthodedespesées,plussimpleàmettreenœuvreenrou- tinedansunservice destérilisationestdésormais utilisée enpratiqueauCHUd’Angers.

Lesuivigravimétriquedesconcentrations(Tableau2)en LDIdans les solutions delavage montrepour 4cyclesdes concentrationsenLDIinférieuresà1%v/vetdoncendes- sous des préconisations du fabricant pour que le produit possèdeuneactivitédetypeinactivationtotalevis-à-visdes ATNCselonlePSP.ComptetenudesrésultatsdutestdeWil- coxon(p=0,17)etdelanon-significativitédesdifférences entrelesdeuxméthodesdecontrôledesconcentrations,en production,unetolérancede−0%et+10%surlaconcentra- tiondeLDIdansleseauxdelavageaétéfixée.Leslaveurs ontétérégléspourobteniruneconcentrationde1,10%v/v afindenejamaisêtreendessousde1,00%v/v.Lesvaleurs des cycles 5et 6ont été rejetées en raison de l’absence d’explicationtechniqueetdecorrélationaveclesconcen- trationsretrouvéesdansleseauxderinçage.Eneffetpour cesdeuxcycles,lesconcentrationsrésiduellesenLDIdans ladernièrecuvederinçagen’ontpasdifférédesconcentra- tionsdesautrescycles.

Résidus de LDI dans les eaux de rinc ¸age

La concentration en potassium dans l’eau osmosée peut variernotammentenraisondelaqualitédesfiltres.Ainsi, avantchaquedosagedepotassiumdansleseauxderinçage, laquantitédepotassium présentedansl’eauosmoséeest systématiquementdosée,puis soustraitedesquantitésde potassiummesuréesdansleseauxderinçage.

Quelles que soientles concentrations en LDIobtenues dans les eaux de lavage,calculées par la méthode gravi- métrique, les concentrations résiduelles de DDP dans les eauxderinçagesdela cuve4onttoujours étéinférieures à10mg/L,limite supérieuredéfinieparlefabricantdece DDP. Cesconcentrations ont même étésystématiquement inférieuresà8,5mg/LaveclaméthodeICP-MS,cequicor- respondà lalimite maximale quiafinalementétédéfinie aucoursdecetteétudeaveclaméthodeICP-MS.Leréglage duLDpermetdoncd’obtenirdesconcentrationsprionicides dansleseauxdelavagesetd’éliminersuffisammentleDDP aufuretàmesuredesrinçagespourquelesconcentrations résiduelles soientinférieures aux concentrations toxiques définiesparlefabricant.

Lalimitedecetteméthodeestliéeaupossiblerelargage depotassiumparlesinstrumentsetleurenvironnementqui pourraitfairecroireàlaprésencederésidusdeLDI.

Conclusion

Cette étude montre que la méthode ICP-MS développée a permis de quantifier de faibles concentrations de LDI (2,05mg/L). Cette méthode étant non spécifique de ce détergent maisspécifiquedel’élémentpotassiumprésent danstouslesDDPactuellementsurlemarché,ellepourrait probablementêtreappliquéeàl’ensembledecesDDP.Cela devracependant êtrevérifié enparticulierpour leNeodi- sher Septoclean^® quicontientmoins depotassium danssa formulationqueleLDI.

La méthode analytique ICP-MS développée pour cette étude est doncutilisablepour affiner le paramétrage des laveursdésinfecteurs.Ellepermetd’optimiserlenombreet laduréedesrinçages,afinderéduirelestempsdecycleet lesconsommationsd’eauosmosée.Elleestdésormaisinté- gréedansleprotocoledequalificationdescyclesprionicides auCHUd’Angers.Lestempsd’analysedeséchantillonsavec cetteméthodesonttrèscourts(del’ordredelaminute).

Lesrésidusalcalinsconstituentunrisquedebrûlurepour les patients. Particulièrement redoutés en chirurgie oph- talmiqueparailleurs concernée parl’instructionprion, la sécurité des patients sera améliorée par la possibilité de suivrefacilementlesrésidusdedétergentsprionicides.

Remerciements

LesauteurstiennentàremercierleslaboratoiresAniosqui ont fourni gracieusement l’Actanios LDI et ont réalisé et fournilesrésultatsdesdosages«fabricants».

Déclaration de liens d’intérêts

Lesauteursdéclarentnepasavoirdeliensd’intérêts.

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